CC BY
4
СПЕЦИФИЧНОСТЬ ОТВЕТА КРИСТАЛЛОГЕННЫХ СВОЙСТВ КРОВИ НА ДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ОКСИДА АЗОТА
А.К. Мартусевич 12, Л.К. Ковалева 3, Е.С. Голыгина \ А.В. Суровегина 12, А.С. Федотова 1, К.Б. Шумаев 4
1 Приволжский исследовательский медицинский университет 2Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия 3Кубанский государственный медицинский университет 4ФИЦ биотехнологии РАН
Abstract
The aim of this work was a comparative analysis of influence of different NO forms on dehydration structurization of human blood serum. Specimens of 15 healthy people blood were treated by gaseous nitric oxide from Plazon device (800 and 80 ppm) and experimental NO-generator (20, 50, 75 and 100 ppm) and by water solution of thiol-containing dinitrosyl iron complexes (3 mM). Specialties of free (own) crystallization of blood serum specimens were estimated with morphological description and with using of semiquantitive parameters. It was stated, that result of NO action on crystallogenic activity of blood serum depends to its concentration and form (free or bound), as well as the presence of reactive oxygen species in gas flow. Most clear stimulating effect on investigated parameter of biological fluid was fixed for bound form of NO - dinitrosyl iron complexes with glutathione ligands.
Key words: nitric oxide, dinitrosyl iron complexes, blood plasma, crystallogenic properties, biocrystallomics
Целью работы явился сравнительный анализ влияния различных форм оксида азота на характер дегидратационной структуризации образцов сыворотки крови человека. Изучали влияние на образцы крови 15 практически здоровых доноров газового потока от аппарата «Плазон», содержащего NO (800 и 80 ppm) и экспериментального генератора NO (20, 50, 75 и 100 ppm), а также глутатион-содержащих динитрозильных комплексов железа (3 ммоль/л). Проводили оценку собственного натрия кристаллообразования сыворотки интактной и обработанной NO крови. Установлено, что результат влияния монооксида азота на кристаллогенные свойства сыворотки крови непосредственно определяется концентрацией NO и его формой (свободной или депонированной), а также наличием примесей активных форм кислорода. При этом наиболее выраженный стимулирующий эффект выявлен для депонированной формы оксида азота -динитрозильных комплексов железа с глутатионовыми лигандами.
Ключевые слова: оксид азота, динитрозильные комплексы железа, кровь, кристаллогенные свойства, биокристалломика
В настоящее время убедительно показано, что монооксид азота (N0) - один из основных мессенджеров межклеточной сигнализации - способен оказывать многочисленные биологические эффекты [1-4]. Однако до сих пор существует определенный «разрыв» между данными о клинической значимости изменений уровня рассматриваемого метаболита в биосредах и результатами модельных экспериментов по оценке его физико-химических свойств. Это связано с малочисленностью исследований, посвященных действию N0 на организм здоровых и имеющих различную патологию животных [5, 6], а также на биосистемы, в том числе культуры клеток, изолированные биологические жидкости и др. [7, 8].
С учетом того, что влияние оксида азота на биообъекты носит ярко выраженный дозозависимый характер [1, 4, 7, 9], а также определяется формой доставки соединения в биосистему (в свободном или депонированном виде [8, 10]), роль данных факторов должна быть уточнена при изучении его биологических эффектов. В связи с этим целью данной работы явился сравнительный анализ влияния различных форм N0 на характер дегидратационной структуризации образцов сыворотки крови человека.
Материалы и методы исследования
Материалом исследования служили образцы крови 15 практически здоровых людей - доноров крови. Изучен характер реакции цельной консервированной крови на воздействие свободного и депонированного оксида азота. Для проведения эксперимента кровь разделяли на 8 порций (интактную, на которую не оказывали воздействий, и 7 опытных, подвергшихся обработке). Объем каждой порции составлял 5 мл.
Производили прямой барботаж шести опытных образцов крови газообразным оксидом азота, генерированным аппаратом «Плазон» при стандартной мощности (концентрация N0 - 800 ррт) и десятикратно разведенным потоком от данного прибора (80 ррт), а также экспериментальным аппаратом ^О-генератор) для синтеза оксида азота, созданным в РФЯЦ [8] (при концентрациях 20, 50, 75 и 100 ррт). Время барботирования - 3 мин., экспозиция после воздействия - 5 мин. В седьмой опытный образец крови добавляли 0,1 мл. свежеполученного водного раствора ДНКЖ (концентрация соединения, определенная спектрофотометрически по известным экстинкциям при длинах волны 310 и 360 нм., - 3 ммоль/л). Синтез ДНКЖ производили по методике А.Ф. Ванина с соавт. (2005) [11]. Экспозиция после введения соединения также составляла 5 мин. По завершении экспозиции производили центрифугирование всех образцов при 1500 об/мин в течение 15 мин. Полученную сыворотку крови в объеме 100 мкл. наносили на предметное стекло и приготавливали микропрепараты высушенной биологической жидкости в соответствии с методом кристаллоскопии, позволяющим оценивать собственную кристаллогенную активность биосреды [12]. Высушенные микропрепараты оценивали морфологически (путем описания особенностей структуризации высушенного образца биологической жидкости) и визуаметрически (с применением собственной системы параметров) [12].
Полученные данные были обработаны статистически в пакете Statistica 6.1 for Windows.
Результаты и их обсуждение
Установлено, что при обработке образцов биологической жидкости газовым потоком от аппарата «Плазон» имеет место отчетливое ингибирование собственной кристаллизации биосреды, что проявляется в значимом снижении как кристаллизуемости, так индекса структурности кристаллограмм (p<0,05 для обоих случаев). Десятикратное разведение последнего воздухом снижает выраженность указанного эффекта, однако оба показателя не достигают уровня контрольного образца (p<0,05). Напротив, при воздействии газового потока от другого генератора, содержащего аналогичное количество оксида азота (75 против 80 ppm) без примеси активных форм кислорода, прежде всего - озона, результат кристаллизации практически не отличается от фаций интактной биологической жидкости. Это позволяет предположить, что ингибирование структуризации, наблюдаемое при обработке крови потоком от «Плазона», определяется не только концентрацией NO, но и образованием пероксинитрита, оказывающего негативное влияние на конформацию и структуру макромолекул плазмы крови.
С учетом приведенных выше данных интересным представляется стимулирующее действие низких концентраций оксида азота (20 ppm) без примесей активных форм кислорода на кристаллизацию сыворотки крови, что четко просматривается как морфологически, так на основании оценки визуаметрических параметров, в частности - кристаллизуемости и индекса структурности. В большей степени усиливает кристаллогенную активность биосреды введение водного раствора ДНКЖ. По-видимому, подобный эффект обусловлен присутствием в составе комплекса атомов железа, высвобождаемых при частичном его разрушении, имеющем место при попадании в образцы крови.
Установлено, что минимальная среди использованных концентраций оксида азота (20 ppm) снижает выраженность деструктивных изменений кристаллов с 0,76±0,15 балла до 0,36±0,14 балла (p<0,01). Повышение концентрации приводит к дозозависимому нарастанию параметра, практически выходящему на плато при воздействии на образцы цельной крови 75 ppm NO. Следует подчеркнуть, что даже наиболее высокая концентрация оксида азота (100 ppm) не вызывает значительного увеличения значения степени деструкции фации, остающейся в пределах 1,5 баллов.
Анализ сформированности краевой зоны микропрепарата высушенной биологической жидкости при действии различных концентраций оксида азота также продемонстрировал двухфазную зависимость. Так, выявленные на основании морфологической оценки кристаллограмм сыворотки крови особенности краевой зоны фации выразились при визуаметрии в повышении значения параметра (с 1,10±0,12 до 1,65±0,14 балла при концентрации NO 20 ppm; p<0,05). Дальнейшее увеличение воздействующей дозы оксида азота приводило к резкому сужению краевой зоны с соответствующим падением уровня показателя, достигающим максимума (0,41±0,12 балла) при барботаже образцов крови наивысшей из использованных концентраций соединения (100
ppm). Важно отметить, что наиболее значимые изменения, обнаруживаемые при действии газового потока от аппарата «Плазон», также проявляются в краевой зоне фации в форме особой дополнительной полосы.
Заключение
Таким образом, результаты проведенных экспериментов позволили установить, что результат влияния монооксида азота на кристаллогенные свойства сыворотки крови непосредственно определяется концентрацией NO и его формой (свободной или депонированной), а также наличием примесей активных форм кислорода. При этом наиболее выраженный стимулирующий эффект выявлен для депонированной формы оксида азота - динитрозильных комплексов железа с глутатионовми лигандами.
Список литературы
1. А.Ф. Ванин, Вестник РАМН 4, 3 (2000).
2. В.Г. Граник, Н.Б. Григорьев Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств. Вузовская книга, Москва (2004).
3. R.J. Gryglewsky, P. Minuz ^ds.). Nitric Oxide. Basic Research and Clinical application. IOS Press, Amsterdam; Berlin; Oxford; Tokyo; Washington (2001).
4. E. van Faassen., A.F. Vanin (Eds.), Radicals for Life: The Various forms of Nitric Oxide. Elsevier, Amsterdam (2007).
5. А.Ф. Ванин, Г.Н. Можокина, Н.А. Ткачев с соавт., Биофизика 58 (2), 295 (2013).
6. Х.Л. Гайнутдинов, В.В. Андрианов, В.С. Июдин с соавт., Биофизика 58 (2), 278 (2013).
7. А.Ф. Ванин, Р.Р. Бородулин, Л.Н. Кубрина с соавт., Биофизика 58 (1), 126 (2013).
8. А.К. Мартусевич, А.Г. Соловьева, С.П. Перетягин с соавт., Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 158 (7), 40 (2014).
9. M.I. Remizova, N.I. Kochetygov, K.A. Gerbout et al., Eur. J. Pharmacol. 66, 240 (2011).
10.А.К. Мартусевич, А.Г. Соловьева, С.П. Перетягин, Современные технологии в медицине 5 (4), 33 (2013).
11. А.К. Мартусевич, Н.Ф. Камакин, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 143 (3), 358 (2007).
12.М.Г. Залеский, Вестник новых медицинских технологий 12 (2), 93 (2005).
13.М.Г. Залеский, В.Л. Эмануэль, М.В. Краснова, Клиническая лабораторная диагностика 8, 20 (2004).
14.Ю.Ю. Тарасевич, О.П. Исакова, В.В. Кондухов, А.В. Савицкая, Журнал технической физики 80 (5), 45 (2010).
15.Т.А. Яхно, В.В. Казаков, О.А. Санина с соавт., Журнал технической физики 80 (7), 17 (2010).
16.T.A. Yakhno, Natural Science 3, 220 (2010).
17.K.B. Shumaev, A.A. Gubkin, V.A. Serezhenkov et al., Nitric Oxide Biol. Chem. 18, 37 (2008).
18.В.Н. Кидалов, А.А. Хадарцев Тезиография крови и биологических жидкостей. Тульский полиграфист, Тула (2009).
19.A.F. Vanin, E.I. Chazov, Biophysics 56, 268 (2011).
