CC BY
18
ВЛИЯНИЕ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА НА
СТРУКТУРИЗАЦИЮ СЫВОРОТКИ КРОВИ КРЫС
1 1 1 1
A.К. Мартусевич , А.В. Давыдюк, Л.К. Ковалева , К.М. Сысуев ,
'i 1
B.А. Бобков , В.В. Наумов
1ФГБУ «Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр» Минздрава России, Нижний Новгород, Россия
ФГБОУ ВО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия», Нижний Новгород, Россия
ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия», Киров, Россия
Целью данной работы явилась оценка влияния инъекций различных концентраций динитрозильных комплексов железа с глутатионовыми лигандами (ДНКЖ) на кристаллизацию сыворотки крови крыс. Эксперимент выполнен на 60 крысах линии Вистар, разделенных на 6 равных групп. С животными интактной группы (n=10) не производили никаких манипуляций, кроме однократного взятия крови. Контрольная группа (n=10) включала животных, которым внутрибрюшинно вводили 1 мл. физиологического раствора. Крысы основных (третьей, четвертой, пятой и шестой; по n=10) групп получали ежедневные инъекции 1 мл. водного раствора ДНКЖ (0,15; 0,30; 0,45 и 0,60 мМ/инъекцию соответственно). У животных контрольной и основных групп забирали образцы крови сразу после завершения полного курса инъекций, у крыс интактной группы - однократно. Изучали кристаллогенные свойства сыворотки крови, полученной из всех образцов, методом классической кристаллоскопии. Установлено активирующее действие глутатион-содержащих ДНКЖ на кристаллогенный потенциал сыворотки крови здоровых крыс. Оно проявилось в увеличении плотности кристаллических элементов и их усложнении, причем, как и для метаболических показателей, максимальная выраженность данной тенденции соответствовала концентрациям 0,3 и 0,45 мМ.
Ключевые слова: оксид азота, динитрозильные комплексы железа, сыворотка крови, кристаллизация
The aim of this article is estimation of influence of different concentrations of dinitrosyl iron complexes with glutathione ligands (DNIC) on crystallization of rats blood serum. We formed 6 equal groups. We got a blood samples from animals of intact group (n=10) at once. Rats of control group (n=10) got 10 intraperitoneal injections of saline, and rats of third, fourth, fifth and sixth groups (n=10 in each group) got 10 intraperitoneal injections of DNIC water solution, respectively. Crystallogenic properties of each blood sample were tested with classic crystalloscopy. We state that glutathione-
containing DNIC activates crystallogenic potential of rats' blood serum. Maximal activation was fixed for 0,3 and 0,45 mM of DNIC.
Key words: nitric oxide, dinitrosyl iron complexes, blood serum, crystallization
Известно, что способность биологического субстрата к дегидратационной структуризации - одна из интегральных характеристик его компонентного состава и физико-химических свойств [1, 2, 4-6, 8-16]. При этом кристаллоскопическое исследование информативно для физиологических и патологических состояний как в отношении организма человека [6, 8, 11-13], так и животных [4]. Следовательно, изучение кристаллогенных свойств биологических жидкостей может отображать и влияние оксида азота и его производных на биосистемы in vitro и in vivo, однако подобные данные в литературе отсутствуют. Нашим исследовательским коллективом впервые было показано, что обработка газообразным NO в высокой концентрации негативно трансформирует результат кристаллизации образцов сыворотки крови человека преимущественно за счет стимуляции нитрозилирования белковых макромолекул [1, 3, 7, 10], тогда как в экспериментах in vivo подобные эффекты ранее не изучались [17, 18]. Поэтому целью данной работы явилась оценка влияния инъекций различных концентраций ДНКЖ на собственную и инициированную кристаллизацию сыворотки крови крыс.
Материалы и методы исследований
Эксперимент выполнен на 60 половозрелых крысах-самцах линии Вистар, разделенных на 6 равных по численности групп. С животными интактной группы (n=10) не производили никаких манипуляций, кроме однократного взятия крови. Контрольная группа (n=10) включала животных, которым внутрибрюшинно вводили 1 мл. физиологического раствора. Крысы основных (третьей, четвертой, пятой и шестой; по n=10) групп получали ежедневные инъекции 1 мл. водного раствора динитрозильных комплексов железа с глутатионовыми лигандами (ДНКЖ). Количество вводимого соединения составило 0,15; 0,30; 0,45 и 0,60 мМ/инъекцию для указанный групп соответственно. Синтез ДНКЖ производили по методу, предложенному А.Ф. Ваниным (2005).
У животных контрольной и основных групп забирали образцы крови сразу после завершения полного курса инъекций (на 11 -е сутки эксперимента). Для получения сыворотки крови производили центрифугирование всех образцов при 1500 об/мин в течение 15 мин. Затем сыворотку крови в объеме 100 мкл. наносили на предметное стекло и приготавливали микропрепараты высушенной биологической жидкости в соответствии с методом кристаллоскопии, позволяющим оценивать собственную кристаллогенную активность биосреды [810]. Высушенные микропрепараты оценивали морфологически (путем описания особенностей структуризации высушенного образца биологической жидкости) и визуаметрически (с применением собственной системы параметров) [8, 10]. Основными визуаметрическими показателями, оцениваемыми в балльной шкале, служили кристаллизуемость (отражает количественную сторону кристаллизации -плотность кристаллических элементов в фации), индекс структурности
(характеризует сложность структуропостроения), степень деструкции фации (представляет собой индикатор качественной стороны процесса - правильности образования структур) и выраженность краевой зоны микропрепарата.
Полученные данные были обработаны статистически в программном пакете Statistica 6.1 for Windows. Нормальность распределения значений параметров оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. С учетом характера распределения признака для оценки статистической значимости различий применяли Н-критерий Краскала-Уоллеса.
Результаты исследования Установлено, что введение животным физиологического раствора, не содержащего естественного донора оксида азота, не оказывало значимого воздействия на параметры собственной кристаллизации биологической жидкости.
1,8 1,6 1,4 1,2
I 1
ю0,8 0,6 0,4 0,2 0
интактные
контроль
0,15 мМ 0,3 мМ 0,45 мМ ДНКЖ
0,6 мМ
Рис. 1. Влияние инъекций динитрозильных комплексов железа на индекс структурности фаций сыворотки крови крыс
В то же время применение растворов ДНКЖ модифицировало уровень этих показателей. В частности, минимальная из использованных доз соединения (0,15 мМ) умеренно, но значимо повышала индекс структурности фаций сыворотки крови (р<0,05 по сравнению с интактными животными). Этот параметр отражает сложность структуропостроения элементов фации, а диапазон от 1 до 2 усл. ед. характеризуется присутствием в микропрепарате как одиночно-кристаллических, так и дендритных элементов, причем увеличение значения показателя свидетельствует о повышении доли последних в кристаллограмме.
Максимальное нарастание индекса структурности определялось при введении крысам физиологического раствора, включающего 0,3 мМ ДНКЖ (рис. 1). В этом случае уровень параметра превышал физиологические значения в 1,47 раза (р<0,05), а значение показателя, достигнутое при концентрации агента 0,15 мМ - в
1,2 раза ф<0,05). Интересно, что дальнейшее увеличение концентрации соединения приводило к менее выраженному повышению индекса структурности. Следует отметить, что при концентрации ДНКЖ 0,6 мМ данный показатель, с одной стороны, был на 28,7% выше уровня, характерного для интактных крыс ф<0,05), и, с другой стороны, на 14,2% ниже цифр, выявленных для 0,3 мМ соединения ф<0,05). Таким образом, стимулирующее действие изучаемого вещества на индекс структурности также параболически дозозависимо.
1,8 1,6 1,4 1,2
I 1 1§0,8
0,6 0,4 0,2 0
■ I
интактные
контроль
0,15 мМ
0,3 мМ
0,45 мМ
0,6 мМ
ДНКЖ
Рис. 2. Влияние инъекций динитрозильных комплексов железа на кристаллизуемость фаций сыворотки крови крыс
Сходная динамика изменения была зафиксирована и в отношении кристаллизуемости фаций сыворотки крови - основного количественного критерия оценки собственной кристаллизации последней (рис. 2). В этом плане значимо, что сдвиги индекса структурности и кристаллизуемости, выражающееся в повышении обоих параметров при внутрибрюшинном введении животным ДНКЖ, однонаправлены и указывают на активацию кристаллогенных свойств биологической жидкости. В то же время, если максимальный градиент индекса структурности отмечен при использовании ДНКЖ в концентрации 0,3 мМ, то наиболее выраженное увеличение кристаллизуемости было зарегистрировано при введении 0,45 мМ ДНКЖ (+335% по сравнению с интактными животными; p<0,05). Следует заметить, что и при применении иных концентраций агента сдвиги параметра существенны и составляют более 3,2 раза ф<0,05 для всех рассмотренных воздействий).
Единственной монотонной завимостью для изученных концентраций физиологического донора оксида азота является его влияние на степень деструкции кристаллоскопических фаций (рис. 3). Установлено, что данный показатель умеренно нарастает с увеличением действующей дозы ДНКЖ, однако
остается в пределах 0,7 усл. ед. при всех концентрациях кроме 0,6 мМ. Подобный уровень параметра свидетельствует о слабой выраженности деструктивных процессов при формировании кристаллических элементов фации, косвенно указывая на отсутствие значимого токсического эффекта соединения [8, 10, 16]. Умеренное разрушение структур образца отмечается лишь при введении крысам наиболее высокой из примененных концентраций вещества (0,6 мМ).
1,2
о 0,4
0,2
.|||||
0,15 мМ 0,3 мМ 0,45 мМ 0,6 мМ
интактные контроль ДНКЖ
интактные
Рис. 3. Влияние инъекций динитрозильных комплексов железа на степень деструкции фаций сыворотки крови крыс
2,5
ми
55
0,5
МИМ
0,15 мМ 0,3 мМ 0,45 мМ 0,6 мМ интактные контроль ДНКЖ
Рис. 4. Влияние инъекций динитрозильных комплексов железа на выраженность краевой зоны в фациях сыворотки крови крыс
1
0
3
2
1
0
Однотипность выявлена нами и для выраженности краевой белковой зоны микропрепарата при действии различных концентраций ДНКЖ (рис. 4). Так, при всех используемых дозах соединения регистрировали умеренное снижение значения данного показателя, выраженность которого постепенно уменьшалась по мере нарастания концентрации вводимого агента. При этом лишь при применении 0,6 мМ раствора ДНКЖ отличия от животных интактной и контрольной группы не имели статистической значимости.
Заключение
В целом, однозначно установлено активирующее действие инъекций глутатион-содержащих ДНКЖ на кристаллогенный потенциал сыворотки крови здоровых крыс. Оно проявилось в увеличении плотности кристаллических элементов и их усложнении, причем, как и для метаболических показателей, максимальная выраженность данной тенденции соответствовала концентрациям 0,3 и 0,45 мМ.
Список литературы
1. Ашихмин С.П., Мартусевич А.К. Особенности дегидратации сыворотки крови при действии свободного и депонированного оксида азота in vitro // Врач-аспирант. 2014. №6. С. 30-34.
2. Бузоверя М.Э. с соавт. Морфометрический анализ фаций сыворотки крови // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. №9. С. 22-23.
3. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств. М.: Вузовская книга, 2004. 360 с.
4. Громова И.П. Кристаллоскопический способ изучения сыворотки крови в токсиколого-гигиеническом эксперименте методом «открытая капля» // Гигиена и санитария. 2005. №2. С. 66-69.
5. Залеский М. Г., Гетлинг А. В. Конвентивные потоки в каплях воды и биологической жидкости («ЛИТОС-система») на твердой подложке // Вестник новых медицинских технологий. 2005. Т. 12, №3-4. С. 43-45.
6. Кидалов В.Н., Хадарцев А.А., Якушина Г.Н. Тезиографические исследования крови и их практические возможности // Вестник новых медицинских технологий. 2004. Т. 11. №1-2. С. 23-25.
7. Мартусевич А. К., Перетягин С. П., Соловьева А. Г., Ванин А. Ф. Оценка некоторых молекулярных эффектов газообразного оксида азота на кровь человека in vitro // Биофизика. 2013. Т. 58, №5. С. 871-875.
8. Мартусевич А.К. Биокристалломика в молекулярной медицине / Под ред. В.Л. Эмануэля. СПб.: Издательство СПбГМУ - Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2011. 112 с.
9. Мартусевич А.К. с соавт. Физиология и патология кристаллостаза: общая парадигма и перспективы изучения // Вестник Нижегородского университета им Н.И. Лобачевского. 2010. №1. С. 135-139.
10. Мартусевич А.К., Перетягин С.П. Модификация дегидратационной структуризации сыворотки крови при ее обработке оксидом азота // Биофизика. 2013. Т. 58, №6. С. 1038-1042.
11. Рапис Е.Г. Белок и жизнь. Самоорганизация, самосборка и симметрия наноструктурных супрамолекулярных пленок белка. М.: МИЛТА-ПКП ГИТ, 2003. 368 с.
12. Савина Л.В., Клименко Е.Ф., Яковенко М.С. с соавт. Метаболические структуры сыворотки крови - маркеры острого панкреатита // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2006. №3. С. 62-67.
13. Савина Л.В., Павлищук С.А., Самсыгин В.Ю. с соавт. Поляризационная микроскопия в диагностике обменных нарушений // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. №3. С. 11-13.
14. Тарасевич Ю.Ю. Механизмы и модели дегидратационной самоорганизации биологических жидкостей // Успехи физических наук. 2004. Т. 174. №7. С. 779-790.
15. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н. Морфология биологических жидкостей человека. М.: Хризопраз, 2001. 304 с.
16. Ющенко А.А. Даудова А.Д., Аюпова А.К., Урляпова Н.Г. Использование морфоструктурной реакции сыворотки крови в токсикологической оценке лекарственных средств // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004. №7. С. 113-117.
17. Kumar P. et al. Use of inhaled nitric oxide in preterm infants // Pediatrics. 2014. Т. 133, №1. С. 164-170.
18. Nitric Oxide. Basic Research and Clinical Application / Ed. R.J. Gryglewsky, P. Minuz. Amsterdam; Berlin; Oxford; Tokyo; Washington: IOS Press, DC, 2001.
