CC BY
4
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ И КОНЦЕНТРАЦИЙ МОНООКСИДА АЗОТА НА КРИСТАЛЛОГЕННЫЕ СВОЙСТВА СЫВОРОТКИ КРОВИ IN VITRO
А.К. Мартусевич1, Е.С. Голыгина1,3, Л.К. Ковалева2, К.Б. Шумаев4 гФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России, Нижний Новгород
2ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России, Краснодар
4ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Москва 3ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет», Нижний Новгород
Abstract
The aim of the work was to study the crystallogenic properties of blood under the influence of different concentrations of gaseous and bound nitric oxide in vitro. The experiment was performed on whole blood samples (n=20), divided into 6 portions (one intact and five experimental). Direct bubbling of four blood samples with NO-containing gas generated by the Plazon device (NO concentration - 800 ppm) and an experimental device for the synthesis of nitric oxide (20, 50 and 100 ppm) were performed for treatment. In the fifth experimental blood sample 0.1 ml. solution of dinitrosyl iron complex was added. All the samples were tested on crystallogenic properties of blood serum by the teziocrystalloscopy method. It was found that the effect of nitric oxide on the crystallogenic properties of blood serum is determined by its form (free or bound), as well as the current concentration.
Key words: nitric oxide, dinitrosyl iron complexes, blood, crystallogenic properties, biocrystallomics
Целью работы являлось провести исследование кристаллогенных свойств крови in vitro при воздействии различных концентраций газообразного и депонированного оксида азота. Эксперимент выполнен на образцах цельной крови (n=20), разделяемых на 6 порций (интактную и 5 опытных, подвергавшихся обработке). Для обработки производили прямой барботаж четырех опытных образцов крови газообразным оксидом азота, генерируемым аппаратом «Плазон» (концентрация NO - 800 ppm), а также экспериментальным аппаратом для синтеза оксида азота (концентрация NO -20, 50 и 100 ppm). В пятый опытный образец крови добавляли 0,1 мл. раствора динитрозильного комплекса железа. Для всех образцов производили изучение кристаллогенных свойств сыворотки крови методом тезиокристаллоскопии. Установлено, что влияние оксида азота на кристаллогенные свойства сыворотки крови
определяется его формой (свободная или депонированная), а также действующей концентрацией.
Ключевые слова: оксид азота, динитрозильные комплексы железа, кровь, кристаллогенные свойства, биокристалломика
В настоящее время к биологическим эффектам монооксида азота (NO) приковано внимание научной общественности, что обусловлено их плейотропностью, а также значительной клинико-физиологической значимостью [1, 4, 5, 8]. Ранее было показано, что NO способен влиять на окислительный и энергетический метаболизм [5-6, 9] и состояние некоторых детоксикационных энзимов крови [6], а также изменять кристаллогенные свойства сыворотки крови, находясь в достаточно высокой концентрации [3]. Однако в целом исследования в обсуждаемой области немногочисленны. Кроме того, ни отечественными, ни зарубежными авторами не были получены сведения о характере действия на кристаллогенные свойства низких доз оксида азота, обладающих, согласно предположениям упомянутых авторов, более благоприятным влиянием на метаболизм крови.
Материалы и методы
Эксперимент выполнен на образцах цельной крови, полученной на Нижегородской областной станции переливания крови (г. Нижний Новгород) от практически здоровых доноров (п=20).
Изучался характер реакции цельной консервированной крови на воздействие двух форм оксида азота:
- свободного (в составе газовых смесей);
- депонированного (в составе глутатион-содержащих динитрозильных комплексов железа).
Для проведения эксперимента каждый образец крови разделяли на 6 порций (интактную, на которую не оказывали воздействий, и 5 опытных, подвергавшихся обработке). Объем каждой порции составлял 5 мл.
Для обработки производили прямой барботаж четырех опытных образцов крови газообразным оксидом азота, генерируемым аппаратом «Плазон» при стандартной мощности (концентрация NO - 800 ppm), а также экспериментальным аппаратом ("NO-генератор") для синтеза оксида азота, созданным в Российском федеральном ядерном центре - Всероссийском НИИ экспериментальной физики [2]. Используемые концентации в этом случае составляли 20, 50 и 100 ppm.
Время барботирования - 3 мин., экспозиция после воздействия - 5 мин.
Динитрозильные комплексы железа с глутатионовыми лигандами (ДНКЖ) синтезировали по методике А.Ф. Ванина (2009, 2011) [7, 10]. Концентрация соединения в физиологическом растворе, определяемая спектрофотометрически по известной экстинкции при длинах волны 310 и 360 нм, составляла 3,1 ммоль/л.
По завершении экспозиции производили центрифугирование всех образцов при 1500 об/мин в течение 15 мин.
В образцах производили сравнительное изучение кристаллогенных свойств сыворотки крови методом тезиокристаллоскопии.
Полученные данные были обработаны статистически в программном пакете Statistica 6.1 for Windows.
Результаты и обсуждение
Описание дегидратированных образцов плазмы крови производили морфологически и с применением системы визуаметрических параметров, характеризующих качественные и количественные стороны процесса кристаллизации биосреды (кристаллизуемость, индекс структурности, степень деструкции фации, выраженность краевой зоны).
Для контрольного микропрепарата высушенной биологической жидкости был характерен типичный физиологический рисунок фации с умеренными признаками кристаллизации в центральной зоне и многочисленными регулярными аркообразными разломами в краевой зоне (рис. 1А).
Концентрация оксида азота 20 ppm способствовала умеренной оптимизации кристаллоскопической картины биосубстрата (рис. 1 Б). Это проявлялось в формировании регулярных центростремительных разломов, расширение радиуса краевой зоны.
При увеличении концентрации оксида азота до 50 ppm наблюдали умеренное обеднение кристаллического компонента фации с одновременным сужением краевой зоны микропрепарата, сопоставимым с выявленным в контрольном образце высушенной биологической жидкости (рис. 1 В).
Использование самой высокой концентрации NO от экспериментального NO-генератора» РФЯЦ (100 ppm) способствовала оптимизации сети разломов картины (с формированием дугообразных разломов), стимулировала непосредственное кристаллообразование в центральной и промежуточной зонах фации, а также обеспечивала относительную неоднородность текстуры образца (рис. 1Г). Кроме того, наблюдалась тенденция к хаотизации «дополнительных» разломов краевой зоны микропрепарата, соединяющих основные между собой.
Морфологическое описание особенностей структуризации сыворотки крови позволило установить, что обработка крови высокими дозами NO (800 ppm) приводит к образованию в краевой зоне микропрепарата рельефной полосы, в которой конденсируются нитрозилированные белки (рис. 1Д).
Наиболее выраженной прокристаллогенной активностью обладает водный раствор ДНКЖ, при введении которого в биологическую жидкость наблюдали как стимуляцию образования одиночно-кристаллических и дендритных структур в целом, так и их усложнение. Следует отметить, что в этом случае большинство элементов имеют правильную конфигурацию (рис. 1Е).
А. Контрольный образец
Б. Обработка крови газообразным N0 в концентрации 20 ррт
В. Обработка крови газообразным N0 в концентрации 50 ррт
Г. Обработка крови газообразным N0 в концентрации 100 ррт
Д. Обработка крови газообразным N0 в концентрации 800 ррт
Е. Обработка крови ДНКЖ (3 ммоль/л)
Рис. 1. Картины кристаллизации образцов плазмы крови при ее обработке различными формами и концентрациями оксида азота
Выявленные с помощью морфологического описания микропрепаратов сыворотки крови тенденции, характеризующие дозозависимость действия концентраций NO, были подтверждены результатами анализа кристаллогенных
свойств сыворотки крови с использованием визуаметрических параметров. Так, при обработке образцов биологической жидкости газовым потоком от аппарата «Плазон» имеет место отчетливое ингибирование собственной кристаллизации биосреды, что проявляется в значимом снижении как кристаллизуемости, так индекса структурности кристаллограмм (р<0,05 для обоих случаев). При воздействии газового потока от другого генератора (100 ррт) результат кристаллизации практически не отличается от фаций интактной биологической жидкости (рис. 2 и 3).
Рис. 2. Уровень кристаллизуемости плазмы крови при ее обработке различными формами и концентрациями оксида азота
При барботировании крови наиболее низкими концентрациями оксида азота (50 и 20 ррт), наблюдается стимулирующее действие на кристаллизацию плазмы крови, что четко просматривается как морфологически, так на основании оценки визуаметрических параметров, в частности - кристаллизуемости и индекса структурности (рис. 2 и 3).
Введение в кровь водного раствора ДНКЖ в большей степени усиливает кристаллогенную активность биосреды.
Наиболее четко негативные и позитивные эффекты наблюдаются на примере СДФ, она возрастает практически до максимальных величин (с 0,75±0,15 балла до 2,6±0,15 балла, р<0,05) в случаи использования Плазона. Наиболее оптимальные значения, то есть минимальная деструкция наблюдается в случае использования ДНКЖ и самых низких концентраций N0. При этом, минимальная среди использованных концентраций оксида азота (20 ррт)
снижает выраженность деструктивных изменений кристаллов с 0,75±0,15 балла до 0,36±0,14 балла (р<0,05; рис. 4).
Рис. 3. Индекс структурности плазмы крови при ее обработке различными формами и концентрациями оксида азота
Рис. 4. Степень деструкции элементов образцов плазмы крови при ее обработке различными формами и концентрациями оксида азота
Повышение концентрации приводит к дозозависимому нарастанию параметра, практически выходящему на плато при воздействии на образцы цельной крови 50 ррт N0. Следует подчеркнуть, что даже наиболее высокая концентрация оксида азота (100 ррт) не вызывает значительного увеличения значения степени деструкции фации, остающейся в пределах 1,5 баллов.
Введение в кровь водного раствора ДНКЖ уменьшает степень деструкции фации практически в 2 раза (0,75±0,15 балла до 0,4±0,14 балла)
Анализируя выраженность краевой зоны микропрепарата, указывающая на относительное содержание нативного белка в пробе, наиболее оптимальные результаты можно наблюдать при использовании ДНКЖ и самых низких концентраций N0 (50 и 20 ррт). Так, выявленные на основании морфологической оценки кристаллограмм сыворотки крови особенности краевой зоны фации выразились при визуаметрии в повышении значения параметра с 1,10±0,12 до 1,65±0,14 балла при концентрации N0 20 ррт и с 1,10±0,12 до 0,9±0,12 балла при концентрации N0 50 ррт (р<0,05).
Рис. 5. Выраженность краевой зоны образцов плазмы крови при ее обработке различными формами и концентрациями оксида азота
Дальнейшее увеличение воздействующей дозы N0 приводило к резкому сужению краевой зоны с соответствующим падением уровня показателя, достигающим максимума (0,41±0,12 балла, р<0,05) при обработки образцов крови концентрацией оксида азота 100 ррт (рис. 5). Ложноположительным результатом являются данные, которые были получены при обработки крови газовым потоком от Плазона (концентрация N0 800 ррт). В данном случае образуется широкая зона (1,66±0,12 балла р<0,05), но краевую зону, в которой конденсируются нитрозилированные белки, нельзя отделить от промежуточной.
Заключение
Результаты проведенных экспериментов позволили установить, что результат влияния монооксида азота на кристаллогенные свойства сыворотки крови непосредственно определяется концентрацией NO и его формой доставки (свободной или депонированной). При этом наиболее выраженный стимулирующий эффект выявлен для депонированной формы оксида азота -динитрозильных комплексов железа с глутатионовыми лигандами.
Низкие концентрации монооксида азота оказывают модулирующее действие на кристаллогенные свойства сыворотки крови человека, наиболее оптимальным эффектом, проявляющимся в увеличение выраженности краевой зоны и формировании в ней регулярных центростремительных разломов, обладает концентрация NO 20 ppm.
Напротив, высокие концентрации оксида азота (800 ppm) способствуют ингибированию кристаллогенной активности биосреды, многократно повышая степень деструкции формирующихся структурных элементов и способствуя формированию дополнительной полосы в краевой зоне микропрепарата.
Исследование поддержано грантом РФФИ№19-015-00444_а.
Список литературы
1. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств. М.: Вузовская книга, 2004. 360 с.
2. Карелин В.И., Буранов С.Н., Пименов О.А. с соавт. Плазмохимическая установка для NO-терапии // Медиаль. 2013. №4. С. 46.
3. Мартусевич А.К., Симонова Ж.Г. Кристаллогенные свойства биологической жидкости при введении химического агента // Современные технологии в медицине. 2011. №1. С. 95-98.
4. Мартусевич А.К., Перетягин С.П. Молекулярная стереотипия в реализации эффекта некоторых лечебных физико-химических факторов: роль NO // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2012. №2, Ч. 3. С. 205-210.
5. Мартусевич А.К., Соловьева А.Г., Перетягин С.П., Ванин А.Ф. Экспериментальная оценка влияния динитрозильных комплексов железа на энергетический метаболизм эритроцитов при термической травме // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2014. Т. 77, №2. С. 16-20.
6. Мартусевич А.К., Соловьева А.Г., Перетягин С.П. с соавт. Влияние различных концентраций оксида азота (NO) на интенсивность процессов липопероксидации в плазме крови in vitro // Медицинский альманах. 2013. №3. С. 76-77.
7. Borodulin R.R., Kubrina L.N., Shvydkiy V.O. et al. A simple protocol for the synthesis of dinitrosyl iron complexes with glutathione: EPR, optical, chromatographic and biological characterization of reaction products // Nitric oxide. 2013. Vol. 35. P. 110-115.
BHopagHKa^w h ÂHTHOKCHgaHTbi. 2019 TOM 6, №2
46
8. Chen Z., Foster M.W., Zhang J. et al. An essential role for mitochondrial aldehyde dehydrogenase in nitroglycerin bioactivation // PNAS. 2005. Vol. 102. N 34. P. 12159-12164.
9. Martusevich A.K., Soloveva A.G., Peretyagin S.P., Vanin A.F. Action of gaseous nitric oxide on some physical and chemical parameters of human blood samples // J. Biomedical Science and Engineering. 2014. Vol. 7, №9. P. 675-681.
10. Vanin A.F. Dinitrosyl-iron complexes with thiolate ligands: physico-chemistry, biochemistry and physiology // Nitric Oxide Biol. Chem. 2009. Vol. 21. P. 136-149.
11. Vanin A.F., Chazov E.I. Prospects of desingning medicines with diverse therapeutic activity on the basis of dinitrosyl iron complexes with thiol-containing ligands // Biophysics. 2011. Vol. 56, №2. P. 268-275.
