CC BY
4Cl RUSSIAN JOURNAL OF ECOSYSTEM ECOLOGY Vol. 7 (4), 2022
Reœived 30.08.2022 Revised 05.11.2022 Accepted 08.12.2022 ^^^^rIGINALRESEARC^ Open Access
УДК 57-032+57-033 DOI 10.21685/2500-0578-2022-4-5
ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОБОСНОВАННЫЕ ПРИЕМЫ СЕЛЕКЦИИ ПРОДУКТИВНЫХ ШТАММОВ MORTIERELLA ALPINA PEYRONEL
Г. В. Ильина1, Д. Ю. Ильин2, А. Р. Дашкина3, И. А. Кузнецов4
ь 2 3 4 Пензенский государственный аграрный университет, Пенза, Россия
Аннотация. Актуальность и цели. В современный период в связи с возросшей экологической нагрузкой и ситуацией экономического кризиса значительное внимание исследователей в области биотехнологии обращено к природным источникам ценных веществ, позволяющих решить проблему их дефицита относительно недорогим, безопасным и экологичным путем, основанным на принципах и логике живого организма - продуцента. Представители трибы мортиерелловых грибов - грибы вида Mortierella alpina обладают способностью к синтезу арахидоновой кислоты, метаболиты могут служить основой для получения продуктов, способствующих формированию иммунитета животных и ростовых процессов растений. С практических позиций важным является известный факт качественной и количественной особенностей структуры жирнокислотно-го профиля мицелия разных штаммов, а требования к питательным средам могут выступать как лимитирующие развитие и реализацию продуктивного потенциала организма. Цель исследования - разработка приемов селекции продуктивных штаммов M. alpina, способных развиваться на разнообразных субстратах. На первом этапе работы решались следующие задачи: исследование продуктивных свойств мортиерелловых грибов, имеющихся в коллекции, и отбор наиболее перспективных штаммов; исследование возможностей повышения продуктивных свойств перспективных штаммов путем индуцированного мутагенеза и селекции; исследование влияния состава питательных сред на ростовые и продуктивные свойства штаммов; разработка способов иммобилизации культуры и поддержания биохимически стабильного состояния. Результаты. Проведенные исследования позволили установить перспективы осуществления приемов селекции штаммов продуцентов. Содержание жирных кислот в составе мицелия изученных групп мутантов различается, как и объемов продукции арахидоновой кислоты как целевого продукта в общем профиле ПНЖК. Реализация приемов индуцированного мутагенеза позволила получить серию фенотипических классов мутантов, которые были подвергнуты всестороннему изучению. Оценено отношение культур к питательным средам различного состава, осуществлен скрининг культур с наиболее стабильным жирнокислотным профилем, отвечающим практическим интересам. Выводы. Вариабельность мутантных штаммов M. alpina определяет формирование материала для скрининга термотолерантных продуктивных штаммов. Причем сохранение у отобранных штаммов культурально-морфологических и ростовых показателей на разных питательных средах в ряду поколений может служить маркером стабильности и продуктивных характеристик.
Ключевые слова: жирные кислоты, экологическая валентность, мутагенез, скриннинг, арахидоновая кислота
Для цитирования: Ильина Г. В., Ильин Д. Ю., Дашкина А. Р., Кузнецов И. А. Экологические обоснованные приемы селекции продуктивных штаммов Mortierella alpina Peyronel // Russian Journal of Ecosystem Ecology. 2022. Vol. 7 (4). https://doi.org/10.21685/2500-0578-2022-4-5
ENVIRONMENTALLY SOUND TECHNIQUES FOR SELECTION OF PRODUCTIVE STRAINS OF MORTIERELLA ALPINA PEYRONEL
G. V. Ilyina1, D. Yu. Ilyin2, A. R. Dashkina3, I. A. Kuznetsov4
ь 2 3 4 Penza State Agrarian University, Penza, Russia
Abstract. Background. In the modern period, due to the increased environmental burden and the situation of the economic crisis, considerable attention of researchers in the field of biotechnology is drawn to natural sources of valuable substances that allow solving the problem of their deficiency in a relatively inexpensive, safe and environmentally friendly way, based on the principles and logic of a living organism - the product -cent. Representatives of the tribe of Mortierella mushrooms - fungi of the species Mortierella alpina have the ability to synthesize arachidonic acid, metabolites can serve as the basis for obtaining products that contribute to the formation of animal immunity and plant growth processes. From a practical point of view, the well-known fact of the qualitative and quantitative features of the structure of the fatty acid profile of the mycelium of different strains is important,
© Ильина Г. В., Ильин Д. Ю., Дашкина А. Р., Кузнецов И. А. 2022 Данная статья доступна по условиям всемирной лицензии Creative Page 1 from 9
Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.0rg/licenses/by/4.0/), которая дает разрешение на неограниченное использование, копирование на любые носители при условии указания авторства, источника и ссылки на лицензию Creative Commons, а также изменений, если таковые имеют место.
and the requirements for nutrient media can act as limiting the development and realization of the productive potential of the organism. The aim of the study is to develop techniques for selecting productive strains of M. alpina capable of developing on various substrates. At the first stage of the work, the following tasks were solved: the study of the productive properties of Mortierella fungi present in the collection and the selection of the most promising strains; study of the possibilities of increasing the productive properties of promising strains by induced mutagenesis and selection; study of the influence of the composition of nutrient media on the growth and productive properties of strains; development of ways to immobilize the culture and maintain a biochemically stable state. Results. The conducted studies allowed to establish the prospects for the implementation of methods of selection of producer strains. The content of fatty acids in the composition of the mycelium of the studied groups of mutants differs, as well as the volume of production of arachidonic acid, as the target product, in the general profile of PUFAs. Implementation of the methods of induced mutagenesis made it possible to obtain a series of phenotypic classes of mutants, which were subjected to a comprehensive study. The ratio of cultures to nutrient media of various compositions was assessed, and cultures with the most stable fatty acid profile that met practical interests were screened. Conclusions. The variability of M. alpina mutant strains determines the formation of material for screening thermotolerant productive strains. And the preservation in selected strains, cultural, morphological and growth indicators on different nutrient media in a number of generations can serve as a marker of stability and productive characteristics.
Keywords: fatty acids, ecological valency, mutagenesis, screening, arachidonic acid
For citation: Ilyina G.V., Ilyin D.Yu., Dashkina A.R., Kuznetsov I.A. Environmentally sound techniques for selection of productive strains of Mortierella alpina Peyronel. Russian Journal of Ecosystem Ecology. 2022,7(4). (In Russ.). Available from: https://doi.org/10.21685/2500-0578-2022-4-5
Введение
В современный период в связи с возросшей экологической нагрузкой и ситуацией экономического кризиса значительное внимание исследователей в области биотехнологии обращено к природным источникам ценных веществ, позволяющих решить проблему их дефицита относительно недорогим, безопасным и экологичным путем, основанным на принципах и логике живого организма - продуцента. Представители трибы мортиерелловых грибов -грибы вида Mortierella alpina обладают способностью к синтезу арахидоновой кислоты, метаболиты могут служить основой для получения продуктов, способствующих формированию иммунитета животных и ростовых процессов растений. С практических позиций важным является известный факт качественной и количественной особенностей структуры жирнокис-лотного профиля мицелия разных штаммов, а требования к питательным средам могут выступать как лимитирующие развитие и реализацию продуктивного потенциала организма. Цель исследования - разработка приемов селекции продуктивных штаммов M. alpina, способных развиваться на разнообразных субстратах. На первом этапе работы решались следующие задачи: исследование продуктивных свойств мортиерелловых грибов, имеющихся в коллекции и отбор наиболее перспективных штаммов; исследование возможностей повышения продуктивных свойств перспективных штаммов путем индуцированного мутагенеза и селекции; исследование влияния состава
питательных сред на ростовые и продуктивные свойства штаммов; разработка способов иммобилизации культуры и поддержания биохимически стабильного состояния.
Результаты исследований
На первом этапе исследований было проведено изучение особенностей развития и продуктивных характеристик выделенных самостоятельно из почв грибов рода Mortierella. Культуры, ставшие объектами исследований, были выделены из почв, расположенных на территории Пензенской области в период времени с 2016 по 2020 г. и сохраняются в коллекции микробных культур кафедры «Биология, биологические технологии и ветеринарно-санитарная экспертиза» ФГБОУ ВО Пензенский ГАУ. Математическую обработку данных производили с использованием функций Excel и программы Статистика.
Для уточнения родовой и видовой принадлежности культур грибов пользовались определителями Мирчинк [1]. Было высеяно 25 вытяжек из почв, отобрано и изучено 64 культуры и только 3 из них определены как принадлежащие к роду Mortierella. Выделение, культивирование, оценки ростовых параметров мицелиальных культур, а также их хранение осуществляли в соответствии с общепринятыми в практической микологии методиками. Для дальнейших исследований отобраны две культуры вида Mortierella alpina, известного как продуцент полиненасыщенной арахидоновой кислоты с ценными свойствами [2, 3].
За время исследований изучили культурально-морфологические и продуктивные свойства культур, сопоставили их с известными из литературных источников характеристиками [4]. Наши исследования, проведенные по стандартным микологическим методикам, показали, что указанные штаммы обладают специфическими культу-рально-морфологическими свойствами [5, 6].
Скорость роста штаммов составляет соответственно 3,43 мм/сут и 8,1 мм/сут, характерен развитый воздушный мицелий белого цвета, однако только для штамма № 2. При изучении культурально-морфологических свойств штаммов вида M. alpina обнаружены существенные визуальные отличия. Различались тип мицелия, его структура и степень пигментации (рис. 1).
Рис. 1. Внешний вид вегетативного мицелия исходных штаммов Mortierella alpine: слева - штамм № 1, справа - штамм № 2
Fig. 1. Appearance of the vegetative mycelium of the original strains of Mortierella alpine: on the left - strain no. 1, on the right - strain no. 2
Мицелий обоих штаммов устойчив к внешним воздействиям, в условиях холодильника не проявляет признаков деградации в течение 9-12 месяцев хранения. Штамм № 1 является самым медленнорастущим, но характеризуется максимальной плотностью мицелия. Штамм № 2 (быстрорастущий) характеризуется развитым воздушным мицелием белого цвета, который быстро стареет с признаками деградации и выраженной экссудацией. Это единственный штамм, предпочитающий натуральным питательным средам синтетические (среду Сабуро).
Все выращенные штаммы рода Mortierella культивировали в глубинных условиях с целью наращивания достаточных для анализа объемов вегетативной биомассы мицелия. Культивирование глубинного мицелия осуществлялось при постоянном перемешивании в условиях микробиологической качалки при температуре от 25 до 30 °C. Если M. alpina культивируется при температуре ниже 18 °C, она начинает вырабатывать ЭПК. Таким образом, необходимо увеличивать температуру до значений, вызывающих предпочтительно продукцию APK. Отфильтрованную биомассу мицелия высушивали под вакуумом до постоянной массы и подвергали экстракции. Извлечение липидов производили, используя методику Фолча с модификациями [7]. Для экстракции использовали две системы растворителей: система А - хлороформ-этанол (1:2); система B - хлороформ-
этанол (2:1). Содержание реакционноспособ-ных для трансэтерификации жирных кислот в массе субстрата, обросшего мицелием, определяли хроматографически на хроматографе «Кристалл-5000.1» с пламенно-ионизационным детектором, оснащенным набивной колонкой с насадкой - 5 % SE-30, нанесенной на носитель «Инертон» [8]. В качестве продуктивных показателей изучены спектры жирнокислотного состава мицелиальной биомассы мицелия штаммов № 1, № 2, M. alpina. Результаты экспериментов, проведенных в трехкратной повторности, были обработаны при помощи инструментов статистики [9]. Были идентифицированы следующие жирные кислоты (табл. 1).
Как видно из таблицы, наибольшее расхождение между изученными штаммами в плане жирнокислотного состава обнаруживается для арахидоновой кислоты. Следует отметить, что во всех образцах содержится заметное количество высококипящих компонентов, по всей видимости, не являющихся высшими жирными кислотами. В образцах штамма № 1 M. alpina обнаружено значительное содержание арахи-доновой кислоты на уровне 122,0 мг/г сухого вещества, в образцах штамма № 2 - 48,2 мг/г сухого вещества. Таким образом, установлено, что продуктивность штаммов различна, наиболее перспективным продуцентом представляется штамм № 1M. alpina.
Таблица 1
Жирнокислотный состав мицелия штаммов грибов рода Mortierella (повторность трехкратная, р < 0,05)
Table 1
Fatty acid composition of the mycelium of fungal strains of the genus Mortierella (threefold repetition, p < 0,05)
Жирные кислоты Штамм № 1 M. alpina Штамм № 2 M. alpina
С 14:0 (миристиновая) 0,09 ± 0,01 0,13 ± 0,01
С 16:0 (пальмитиновая) 0,86 ± 0,12 0,74 ± 0,02
С 16:1 (пальмитолеиновая) 0,38 ± 0,1 0,19 ± 0,01
С 18:0 (стеариновая) 0,61 ± 0,13 0,042 ± 0,001
С 18:1 (олеиновая) 102,0 ± 3,13 79,0 ± 1,14
С 18:2 (линолевая) 0,19 ± 0,02 0,12 ± 0,03
С 18:3 (альфа-линоленовая) 0,36 ± 0,01 0,06 ± 0,003
С 20:0 (арахидоновая) 122,0 ± 3,11 48,2 ± 2,19
С 24:0 (лигноцериновая) 0,011 ± 0,007 0,016 ± 0,001
Высококипящие компоненты > 0,60 > 0,75
Обнаруженное относительно более низкое содержание арахидоновой кислоты в биомассе мицелия штамма № 2 M. alpina нельзя считать «приговором» для этого штамма. Само наличие продукта, пусть и в незначительной концентрации, тем не менее свидетельствует о хорошем потенциале культуры. В этой связи целесообразно проведение селекционной работы, в результате которой возможно получение высокопродуктивных изолятов.
Селекционная работа, осуществляемая в отношении микроорганизма-продуцента, как и любого другого биологического объекта, проводится с целью улучшения его продуктивных свойств и направлена на преобразование его генетической программы [10-12]. Наиболее распространенными и используемыми подходами в селекции микроорганизмов рассматриваются гибридизация, мутагенез и трансгенез. Для получения необходимого материала для селекции и осуществления скрининга продуктивных штаммов нами были использованы приемы индуцированного мутагенеза. Основной действующий мутагенный фактор в данном случае представлен химическими агентами, но для получения максимального эффекта прибегали дополнительно к воздействию физических факторов, используя первые и вторые в комплексе [13]. В качестве исходных (родительских) культур были использованы штаммы № 1 и № 2 M. alpina. На первом этапе вегетативный мицелий родительских штаммов при помощи стеклянных шариков на шейкере дробился в стерильном физиологическом растворе до отдельных клеток. Клеточная суспензия наносилась на дно чашек Петри в стерильных условиях тонким слоем и экспонировалась необходимый период времени под облучателем
(бактерицидная лампа Т8 UGL-S02A-15W/UVCB WHITE Uniel, обеспечивающая УФ-излучение с длиной волны 254 нм); затем споры и фрагменты мицелия обрабатывались водными растворами химических мутагенов (бромистый этидий (cas: 1239-45-8), метилме-тансульфонат (cas:66-27-3)) в концентрации 0,001 %, время экспозиции - 120 мин. После соответствующего воздействия осуществляли рассев клеток на питательные среды для получения мутантных штаммов. С использованием такого подхода была достигнута необходимая для ведения селекционной работы гетерогенность мутантных штаммов. Масса гетерогенных штаммов служит источником для проведения отбора наиболее продуктивных форм. Вместе с этим необходимо учитывать, что в живых клетках действуют разнообразные репарационные механизмы, поэтому устойчивые генетические изменения формируются не всегда. При этом значительные дозы мутагенных факторов зачастую являются летальными для клеток, оказавшихся под их воздействием. В связи с этим первостепенное значение имеет подбор оптимальных доз мутагенных факторов. Такая цель может быть достигнута изучением соотношений между долей выживших клеток и количеством полученных фенотипических классов. В нашей работе эта величина для обоих веществ находилась на уровне 0,001 %. Для установления оптимальных концентраций мутагенов изучено воздействие концентраций бромистого этидия и метилметансульфоната от 1,0 х 10-5 до 1,0 х 10-1 % от массы среды. Полученные результаты приведены на рис. 2, 3.
Использование данного метода позволило определить оптимальную концентрацию химических мутагенов, которая приводит к форми-
рованию значительном гетерогенности мутантов и не вызывает их гибели. Такая концентрация установлена на уровне 1,0 х 10-4 % от массы среды для метилметансульфоната и 1,0 х 10-3 % от массы среды для бромистого этидия. После получения гетерогенного набора мутантных изолятов и фиксации их в чистой культуре проводили оценку их продуктивности. На первом
плане при оценке перспективности штамма лежит исследование жирнокислотного профиля мицелия, но при этом немаловажными характеристиками являются ростовые параметры (темпы развития вегетативного мицелия), дыхательная активность, требовательность к условиям культивирования и др.
5s
cL о с
о х -О X
»о о
О) X
s
с: о
120 100 80 60 40 20
IfW
20
15 3
0,00001 0,000 1 0,001 0,01
од
Cf
0J
_Q СО
х о х и
10 §г £
>- 5
5 g g
g ï о £ ¥
о 5 ? i
Концентрации мутагенов, % от массы среды ш Бромистый этидий ¡^м Мелил метансульфонат
Бромистый этидий Метил метансульфонат
Рис. 2. Эффект использования химических мутагенов на фенотипическую диссоциацию изолятов родительского штамма № 1 M. alpine: столбцы - количество полученных фенотипических классов; линии графика - доля жизнеспособных спор в мутантном поколении (повторность трехкратная, р < 0,05, планки погрешностей - ошибка средней)
Fig. 2. Effect of the use of chemical mutagens on the phenotypic dissociation of M. alpine parental strain no. 1 isolates: the columns show the number of obtained phenotypic classes; the graph lines - the proportion of viable spores in the mutant generation (threefold repetition, p < 0.05, error bars - mean error)
120
cL 100
ю
80
60
40
Й 20
rîw
i6
14 x 3 и
12 3 Я
<o
10
а- о
л О «
О X
с s
а* 5 a s
S fc
0,00001 0,0001
0,001
0,01
0,1
о § 5 «
Концентрации мутагенов, % от массы среды
i Бромистый этидий ■Бромистый этидий
• Мелилметансульфонат ■Метилметансульфонат
Рис. 3. Эффект использования химических мутагенов на фенотипическую диссоциацию изолятов родительского штамма № 2 M. alpine: столбцы - количество полученных фенотипических классов; линии графика - доля жизнеспособных спор в мутантном поколении (повторность трехкратная, р < 0,05, планки погрешностей - ошибка средней)
Fig. 3. Effect of the use of chemical mutagens on the phenotypic dissociation of M. alpine parental strain no. 2 isolates: the columns show the number of obtained phenotypic classes; the graph lines - the proportion of viable spores in the mutant generation (threefold repetition, p < 0.05, error bars - mean error)
В ходе изучения особенностей мутантных штаммов M. alpine обнаружено, что потенциал родительского штамма № 1 в плане получения серии продуктивных мутантов оказался выше, чем таковой у штамма № 2. Сам по себе штамм № 1 обладал наиболее значительным продуктивным потенциалом в отношении арахидоно-вой кислоты и пониженными, по сравнению со штаммом № 2, темпами роста мицелия. Полученные от штамма № 1 мутанты характери-
зовались разнообразием культурально-морфо-логических параметров, при этом в среднем для них были характерны относительно невысокие скорости роста. Установлена значительная гетерогенность и для мутантов, полученных от родительского штамма № 2, для них в основном были отмечены высокие скорости роста. В жирнокислотных профилях указанных групп мутантов установлены значительные различия была на уровне прочих жирных кислот (табл. 2).
Таблица 2
Накопление биомассы и синтетическая продуктивность жирных кислот мицелием мутантных штаммов Mortierella alpine при глубинном культивировании (среда Чапека, 5 суток, 26 °С, повторность трехкратная, р < 0,05)
Table 2
Biomass accumulation and synthetic productivity of fatty acids by mycelium of mutant strains of Mortierella alpine during submerged cultivation (Czapek's medium, 5 days, 26 °C, threefold repetition, p < 0,05)
Штамм Биомасса воздушно-сухого мицелия, г Суммарное содержание жирных кислот, мг/г воздушно-сухого мицелия Доля арахидоновой кислоты в профиле ПНЖК, %
Исходный штамм M.alpine, № 1
MrtA-1 (исходный, контроль) 3,43 ± 0,11 113,70 ± 5,3 16,9 ± 2,5
MrtA-1-04 3,28 ± 0,15 215,30 ± 3,8 31,3 ± 1,9
MrtA-1-07 4,35 ± 0,20 146,61 ± 2,6 26,6 ± 3,1
MrtA-1-11 2,45 ± 0,12 239,31 ± 10,1 33,2 ± 3,7
MrtA-1-12 4,26 ± 0,14 153,40 ± 12,2 18,1 ± 2,7
MrtA-1-14 3,21 ± 0,33 198,24 ± 11,7 16,9 ± 1,8
MrtA-1-16 2,44 ± 0,66 253,16 ± 20,1 28,4 ± 3,3
Исходный штамм M.alpine, № 2
MrtA-2 (исходный, контроль) 8,10 ± 0,15 92,60 ± 4,66 12,2 ± 1,8
MrtA-2-02 9,28 ± 0,22 85,24 ± 4,47 9,6 ± 0,7
MrtA-2-05 11,43 ± 0,34 79,35 ± 5,57 11,2 ± 1,6
MrtA-2-06 12,66 ± 0,33 69,46 ± 7,36 10,9 ± 1,6
MrtA-2-10 6,24 ± 0,25 133,37 ± 8,33 16,4 ± 2,1
MrtA-2-12 7,54 ± 0,37 112,25 ± 15,47 15,3 ± 1,6
MrtA-2-13 9,14 ± 0,60 81,74 ± 18,25 16,1 ± 1,3
Содержание жирных кислот в составе мицелия изученных групп мутантов различается, как и доли арахидоновой кислоты, как целевого продукта, в общем профиле ПНЖК. В образцах, полученных в результате мутагенеза от исходного штамма № 1, обнаружено наиболее значительное пропорциональное содержание арахидоновой кислоты. Заметно, что объемы продукции жирных кислот выше у изолятов, характеризующихся относительно низкими темпами развития вегетативного мицелия. Это свидетельствует о том, что у продуктивных штаммов процессы вторичного метаболизма запускаются в более ранние сроки и превалируют над процессами первичного, определяющими вегетативный рост [11, 14].
Целесообразно продолжение селекционной работы, в результате которой возможно полу-
чение еще более высокопродуктивных изоля-тов, в частности, обладающих характеристиками мутантов, полученных от штамма № 1, таких как MrtA-1-04, MrtA-1-11 и MrtA-1-16.
При работе с родительскими штаммами было установлено, что культуры грибов предъявляют неоднозначные требования к питательным средам. Из большого спектра плотных питательных сред (агар на основе отвара зерна, синтетические среды Райстрика, Чапека, Сабу-ро и др.) оптимальной средой для длительного культивирования и хранения всех штаммов оказался КГА, для развития в условиях глубинной культуры - среда Чапека. Развитие родительских штаммов M. alpina стимулировалось добавлением в питательную среду дополнительных источников аммонийного азота. Основываясь на данных, полученных для родитель-
ских культур, проведено изучение влияния особенностей питательных сред на темпы роста и продуктивность наиболее перспективных мутантных изолятов: MrtA-1-04, MrtA-1-11 и MrtA-1-16. Кроме влияния на накопление биомассы мицелия и продуктивность синтеза жирных кислот дополнительного источника
азота изучена также эффективность использования дополнительных источников углеводов: глюкозы и глицерина. Полученные результаты свидетельствуют о симуляции роста биомассы всех изученных штаммов дополнительным источником азота (нитрат аммония, 0,25 % от массы среды) (табл. 3).
Таблица 3
Влияние дополнительного источника азота на ростовые и продуктивные характеристики штаммов M. alpina (Na2NO3 0,25 % от массы среды, среда Чапека, 5 суток, 26 °С, повторность трехкратная, р < 0,05)
Table 3
Influence of an additional source of nitrogen on the growth and productive characteristics of M. alpina strains (Na2NO3, 0,25 % of the mass of the medium, Czapek's medium, 5 days, 26 °C, threefold repetition, p < 0,05)
Штамм Биомасса воздушно-сухого мицелия, г (% от контроля) Суммарное содержание жирных кислот, мг/г воздушно-сухого мицелия (% от контроля) Доля арахидоновой кислоты в профиле ПНЖК, % (% от контроля)
MrtA-1-04 4,15 ± 0,33 (+26,5 %) 199,0 ± 9,3 (-7,44 %) 34,9 ± 2,3 (+11,5 %)
MrtA-1-11 2,99 ± 0,16 (+22,0 %) 204,1 ± 4,7 (-14,8 %) 34,6 ± 1,6 (+4,2 %)
MrtA-1-16 3,13 ± 0,33(+28,3 %) 220,8 ± 7,6 (-12,7 %) 30,2 ± 1,3 (+8,4 %)
Однако обогащение среды источником азота сократило суммарную продукцию жирных кислот. Обнаруженное влияние тем не менее следует рассматривать как позитивное, поскольку снижение содержания жирных кислот произошло за счет доли предельных, а доля ненасыщенных, в частности арахидоновой кислоты, незначительно возросла. Таким образом, коррекцией питательного субстрата по источникам азота можно увеличить выработку целевого продукта у продуктивных мутантных штаммов еще на 4,2-11,5 %.
Внесение дополнительных источников углеводов неоднозначно сказалось на продуктив-
ных показателях изученных штаммов. В частности, внесение глюкозы дополнительно в количестве 1,0 % от массы среды стимулировало развитие биомассы на первых этапах, а затем, к окончанию культивирования, рост биомассы замедлялся, поэтому итоговые показатели были на уровне или незначительно ниже контрольных. Продукция жирных кислот оказалась угнетена у всех изученных штаммов, причем пропорционально и в отношении ПНЖК. Применение же глицерина в количестве 1,0 % от массы среды стимулировало все учтенные показатели (табл. 4).
Таблица 4
Влияние дополнительных источников углерода на ростовые и продуктивные характеристики штаммов M. alpina (C6H12O6, C3H8O3 1,0 % от массы среды, среда Чапека, 5 суток, 26 °С,
повторность трехкратная, р< 0,05)
Table 4
The influence of additional carbon sources on the growth and productive characteristics of M. alpina strains (C6H12O6, C3H8O3 1,0 % of the medium weight, Czapek's medium, 5 days, 26 °C,
threefold repetition, p < 0,05)
Штамм Биомасса воздушно-сухого мицелия, г (% от контроля) Суммарное содержание жирных кислот, мг/г воздушно-сухого мицелия (% от контроля) Доля арахидоновой кислоты в профиле ПНЖК, % (% от контроля)
С6Н12О6
MrtA-1-04 2,66 ± 0,11 (-18,9 %) 202,1 ± 4,6 (-2,8 %) 29,3 ± 0,9 (-4,5 %)
MrtA-1-11 2,01 ± 0,11 (-17,9 %) 216,8 ± 9,3 (-9,4 %) 28,8 ± 2,3 (-13,9 %)
MrtA-1-16 2,23 ± 0,33 (-8,6 %) 220,1 ± 8,4 (-9,5 %) 23,9 ± 3,7 (-15,8 %)
СзНвОз
MrtA-1-04 4,01 ± 0,09 (+40,5 %) 229,5 ± 5,6 (+6,7 %) 39,6 ± 1,7 (+26,5 %)
MrtA-1-11 3,15 ± 0,13 (+28,6 %) 251,8 ± 8,9 (+5,01 %) 37,3 ± 5,3 (+13,6 %)
MrtA-1-16 3,31 ± 0,73 (+35,7 %) 264,4 ± 13,3 (+4,4,5 %) 33,2 ± 6,6 (+17,9 %)
Особого внимания заслуживает увеличение в полученном продукте доли ПНЖК, о чем свидетельствует установленная стимуляция синтеза арахидоновой кислоты.
Основной концепцией, определяющей проведение исследований в данном контексте, является возможность удешевления компонентов субстратов для культивирования без снижения объемов наращиваемой биомассы мицелия. Если для проведения исследований в лабораторных масштабах оптимально использование среды Чапека, то в масштабах производства закуп-
закупки дорогостоящих компонентов (сахаров в качестве источника углерода) ощутимо увеличат себестоимость продукта. В связи с этим изучены возможности культивирования мицелия на среде, содержащей в качестве источника углерода 60,0 г/л среды свекловичной мелассы, представляющей собой отход сахарного производства. Полученные результаты исследований свидетельствуют о сопоставимости результатов культивирования мутантных штаммов M. alpina (рис. 4).
Рис. 4. Показатели роста и продуктивные свойства мутантных штаммов M. alpina при культивировании на среде Чапека (контроль) и среде на основе свекловичной мелассы в качестве источника углерода (опыт) (повторность трехкратная, р < 0,05, планки погрешностей - ошибка средней)
Fig. 4. Growth rates and productive properties of M. alpina mutant strains during cultivation on Czapek's medium (control) and beet molasses-based medium as a carbon source (experiment) (threefold repetition, p < 0,05, error bars - mean error)
Это говорит о возможностях снижения заложенной себестоимости целевого продукта -
смеси микробных масел с преобладанием арахидоновой кислоты.
Список литературы
1. Мирчинк Т. Г. Почвенная микология. М. : МГУ, 1976. 206 с.
2. Калугин С. А., Петрухина Г. Н., Макаров В. А. Влияние нового отечественного концентрата № 3 полиненасыщенных жирных кислот эпадена на функциональную активность invitro // Эксперим. и клин. фармакология. 2000. Т. 63, № 1. С. 45-50.
3. Гаврисюк В. К., Ячник А. И., Лещенко С. И. [и др.]. Перспективы применения омега-3 полиненасыщенных жирных кислот в медицине // Фарм. вюник. 1999. № 3. С. 39-41.
4. Stamets P. Growing gourmet and medicinal mushrooms. Berkeley : Ten Speed Press, 1993. 552 p.
5. Гарибова Л. В., Ильина Г. В. Региональные коллекции мицелиальных культур как возможность сохранения природного разнообразия штаммов базидиомицетов // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2009. № 1. С. 38-39.
6. Бухало А. С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. Киев : Науковадумка, 1988. 144 с.
7. Folch I., Lace M., Stomley G. N. S. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tisshes // J. Biol. ^em. 1957. Vol. 246, № 3. Р. 479-509.
8. Герег Ш. Количественный анализ стероидов : пер. с англ. М. : Мир, 1985. 504 с.
9. Халафян А. А. Statistica 6. Статистический анализ данных. М. : Бином-Пресс, 2007. 512 с.
10. Инге-Вечтомов С. Г. Генетика с основами селекции : учебник для студентов высших учебных заведений. СПб. : Изд-во Н-Л, 2010. 720 с.
11. Лось Д. А. Структура, регуляция экспрессии и функционирование десатураз жирных кислот // Успехи биологической химии. 2001. Т. 41. С. 163-198.
12. Иванов А. И., Разживина Т. В. Дикорастущие популяции астрагала нутового (Astragaluscicer L.) как исходный материал для селекционной работы // Нива Поволжья. 2012. № 1. С. 9-13.
13. Егоров Н. С. Биотехнология. Книга 2: Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов. М. : Высшая школа, 1988. 208 с.
14. Ильина Г. В., Ильин Д. Ю., Сашенкова С. А. Приемы селекции олеагенных штаммов грибов // Нива Поволжья. 2017. № 2 (43). С. 18-23.
References
1. Mirchink T.G. Pochvennaya mikologiya = Soil mycology. Moscow: MGU, 1976:206. (In Russ.)
2. Kalugin S.A., Petrukhina G.N., Makarov V.A. Influence of a new domestic concentrate no.3 of polyunsaturated epadene fatty acids on the functional activity in vitro Eksperim. i klin. Farmakologiya = Experimental and clinical pharmacology. 2000;63(1):45-50. (In Russ.)
3. Gavrisyuk V.K., Yachnik A.I., Leshchenko S.I. et al. Prospects for the use of omega-3 polyunsaturated fatty acids in medicine. Farm. Visnik = Pharmacological bulletin. 1999;(3):39-41. (In Russ.)
4. Stamets P. Growing gourmet and medicinal mushrooms. Berkeley: Ten Speed Press, 1993:552.
5. Garibova L.V., Il'ina G.V. Regional collections of mycelial cultures as an opportunity to preserve the natural diversity of basidiomycete strains. Immunopatologiya, allergologiya, infektologiya = Immunopathology, allergology, infectology. 2009;(1):38-39. (In Russ.)
6. Bukhalo A.S. Vysshie s"edobnye bazidiomitsety v chistoy kul'ture = Higher edible basidiomycetes in pure culture. Kiev: Naukovadumka, 1988:144. (In Russ.)
7. Folch I., Lace M., Stomley G.N.S. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tisshes. J. Biol. shem. 1957;246(3):479-509.
8. Gereg Sh. Kolichestvennyy analiz steroidov: per. s angl. = Quantitative analysis of steroids: translated from English. Moscow: Mir, 1985:504. (In Russ.)
9. Khalafyan A.A. Statistica 6. Statisticheskiy analiz dannykh = Statistics 6. Statistical data analysis. Moscow: Binom-Press, 2007:512. (In Russ.)
10. Inge-Vechtomov S.G. Genetika s osnovami selektsii : uchebnik dlya studentov vysshikh uchebnykh zavedeniy = Genetics with the basics of selection: a textbook for students of higher educational institutions. Saint Petersburg: Izd-vo N-L, 2010:720. (In Russ.)
11. Los' D.A. Structure, regulation of expression and function of fatty acid desaturations. Uspekhi biologicheskoy khimii = Achievements in biological chemistry. 2001;41:163-198. (In Russ.)
12. Ivanov A.I., Razzhivina T.V. Wild-growing populations of cicer milk vetch (Astragalustsytser L.) as a starting material for selectional work. Niva Povolzh'ya = Niva of the Volga region. 2012;(1):9-13. (In Russ.)
13. Egorov N.S. Biotekhnologiya. Kniga 2: Sovremennye metody sozdaniya promyshlennykh shtammov mikroor-ganizmov = Biotechnology. Book 2: Modern methods for creating industrial strains of microorganisms. Moscow: Vysshaya shkola, 1988:208. (In Russ.)
14. Il'ina G.V., Il'in D.Yu., Sashenkova S.A. Selection techniques for settled strains of fungi. Niva Povolzh'ya = Niva of the Volga region. 2017;(2):18-23. (In Russ.)
