CC BY
40
ЭФФЕКТИВНОСТЬ СОЧЕТАННОГО ЛЕЧЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЦИТОСТАТИЧЕСКИМИ ПРЕПАРАТАМИ И ГМДП-А
Е.Р. Немцова1, O.A. Безбородова1, Н.Б. Морозова1, М.С. Воронцова1, Ю.Б. Венедиктова1, Т.Н. Андреева1, Е.И. Нестерова2, Т.М. Андронова2, Р.И. Якубовская1
Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Минздрава России; Россия, 125284Москва, 2-й Боткинский пр., 3; 2ЗАО «Пептек»; Россия, 117997Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 (Институт биоорганической химии РАН)
Цель исследования — оценка фармакологического действия препарата N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-ала-нил-D-глутаминовая кислота (ГМДП-А) как модификатора биологических реакций: экспериментальное изучение его модифицирующего действия в отношении химиотерапии традиционными препаратами.
Материалы и методы. Препараты: ГМДП-А, цисплатин, гемцитабин, циклофосфамид, 5-фторурацил. Перевиваемые опухоли мыши: лимфолейкоз Р-388 и саркома S-37 (солидный и асцитный варианты), меланома В-16, плоскоклеточный рак шейки матки РШМ-5, аденокарцинома толстой кишки С-26, карцинома толстой кишки АКАТОЛ (солидные варианты). Оценка эффективности: торможение роста опухоли, увеличение продолжительности жизни животных. Результаты. На моделях перевиваемых опухолей у конвенциональных животных изучено влияние ГМДП-А при варьировании дозы, кратности введения, срока начала лечения, пути и места введения на терапевтическую эффективность химиопрепа-ратов цисплатина (Р-388, S-37, В-16, РШМ-5), 5-фторурацила (С-26, АКАТОЛ), гемцитабина и циклофосфамида (Р-388). Показано, что ГМДП-А проявляет модифицирующие свойства в отношении биологической активности ряда цитостати-ческих препаратов: цисплатина, гемцитабина и циклофосфамида, усиливая их противоопухолевое действие, причем независимо от места его введения относительно опухолевого узла.
Заключение. Полученные результаты подтвердили потенциал ГМДП-А как модификатора биологических реакций. Ключевые слова: глюкозаминилмурамилдипептид, модификатор биологических реакций, химиотерапия
DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-2-13-22
EFFICACY OF COMBINED TREATMENT OF EXPERIMENTAL TUMORS WITH CYTOSTATIC AGENTS AND GMDP-A
E.R. Nemtsova1, O.A. Bezborodova1, N.B. Morozova1, M.S. Vorontsova1, J.B. Venediktova1, T.N. Andreeva1, E.I. Nesterova2, T.M. Andronova2, R.I. Yakubovskaya1
'P. Hertsen Moscow Oncology Research Institute — branch of the National Medical Research Radiological Centre of the Ministry of Health of the Russia; 3, 2nd Botkinskiy proezd, Moscow 125284, Russia; JSC «Peptek»; 16/10, Miklukho-Maklaya Str., Moscow 117997, Russia (Institute of Bioorganic Chemistry, RAS)
Objective of the study. To evaluate the pharmacological effects of N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamic acid (GMDP-A) as a modifier of biological reactions, i. e. to study its modifying action in regard to traditional cytostatic chemotherapy. Materials and methods. The used drug agents were GMDP-A, cisplatinum, gemcitabine, cyclophosphamide, 5-fluorouracil. The transplanted murine tumors were P-388 lymphocytic leukemia and S-37sarcoma (solid and ascites variants), B-16 melanoma, CC-5squamous cell carcinoma of the cervix uteri, C-26 adenocarcinoma of the colon, and AKATOL carcinoma of the colon (solid tumor variants). Efficacy indices were inhibition of tumor growth, and increase of life span of animals.
Results. In the models of transplanted tumors in conventional mice, the influence of GMDP-A has been studied on therapeutic efficacy of cisplatinum (P-388, S-37, B16, CC-5), 5-fluorouracyl (C-26, AKATOL), gemcitabine and cyclophosphamide (P-388) by using variations in single and total doses, time of the start of the treatment, as well as the route and site of the injection. It has been shown that GMDP-A has modified the efficacy of some cytostatic agents (cisplatinum, gemcitabine and cyclophosphamide) enhancing their antitumor activity irrespective of the location of the site of injection in regard to the tumor node. Conclusion. The obtained results proved the potency of GMDP-A as a modifier of biological reactions.
Key words: glucosaminylmuramyldipeptide, modifier of biological reactions, chemotherapy
Контакты: Елена Романовна Немцова nemtz@yandex.ru
Введение
Химиотерапия и ее сочетание с другими консервативными методами являются основными способами лечения больных с распространенными злокачественными процессами, однако во многих случаях эффективность этих способов до настоящего времени остается ограниченной [1]. Поэтому поиски возможностей повысить терапевтическую эффективность консервативного противоопухолевого лечения очень актуальны.
Начиная с конца прошлого столетия одним из активно разрабатываемых направлений стало создание лекарственных препаратов на основе производных мурамилдипептидов, обладающих иммуно-модулирующими свойствами и противоопухолевой активностью [2].
^ацетилмурамил^-аланил^-изоглутамин (МДП) является минимальной функционально активной структурной единицей муреина — пептидогликана клеточных стенок грамотрицательных бактерий. Его производное — ^ацетилглюкозаминил^-ацетилмурамил^-ала-нил^-изоглутамин (ГМДП), который отличается от МДП наличием остатка N-ацетилглюкозамина, присоединенного к N-ацетилмурамовой кислоте, проявляет сходные с МДП физиологические свойства. ГМДП при этом имеет ряд преимуществ по сравнению с МДП: он менее токсичен и проявляет большую противоопухолевую и адъювантную активность.
Механизм действия ГМДП обусловлен наличием 2 взаимосвязанных биомишеней: YB1 — полифункционального белка, который участвует в процессах пролиферации, дифференцировки, иммунных процессах и ответе клеток на стрессовые воздействия, и внутриклеточного рецептора врожденного иммунитета NOD2 (nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2) [3—5]. Эти мишени расположены в одном компартменте клеток — цитозоле, и показано, что образование комплекса между ГМДП, YB1 и NOD2 опосредует биологическую активность ГМДП. В последние годы было доказано, что взаимодействие ГМДП и NOD2 является абсолютно специфичным [6]. NOD2-рецепторы были обнаружены в основном в фагоцитирующих клетках — моноцитах/макрофагах, гранулоцитах, дендритных клетках, которые обеспечивают различные фазы иммунного ответа. Связывание ГМДП с YB1 и NOD2-рецептором приводит к каскаду процессов, ответственных за стимуляцию иммунитета: активации фактора транскрипции NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), которая вызывает его транслокацию в ядро и активацию транскрипции генов, кодирующих цитокины [7]. Это, в свою очередь, приводит к стимуляции эффек-торных функций фагоцитов, пролиферации Ти В-лимфоцитов, восстановлению Т-хелперного
баланса и повышению синтеза специфических антител. В то же время ГМДП-индуцированная стимуляция синтеза ряда интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12) и фактора некроза опухоли альфа (ФНО-а) обусловливает активацию противоопухолевого иммунного ответа [8—10]. Усиление продукции колониестиму-лирующих факторов приводит к стимуляции лейко-поэза, а увеличение синтеза у-интерферона — к повышению активности естественных киллеров. Известна также способность ГМДП дозозависимо увеличивать экспрессию опухоль-ассоциирован-ных антигенов на трансформированных клетках, что усиливает иммуногенность последних и тем самым повышает вероятность развития эффективного противоопухолевого иммунного ответа [11]. Таким образом, ГМДП активирует многие звенья и врожденной, и адаптивной иммунной системы, что характеризует его как представителя малых молекул с иммунными свойствами [12].
Выявлено также, что ГМДП ингибирует систему цитохрома Р-450, в результате чего снижается скорость окисления ксенобиотиков [13]. Это коррелирует со способностью ГМДП потенцировать действие некоторых цитостатиков, возможно, за счет замедления их метаболизма [14].
Y Dong и соавт. [15] выявили, что МДП, конъюги-рованный с паклитакселом, значительно усиливал противоопухолевую и антиметастатическую активность цитостатика на модели карциномы легких Льюис у мышей. Авторы предположили, что механизм действия МДП связан именно с его способностью ингибировать NOD2-сигналинг, обусловливающий развитие воспалительных реакций и усиливающий пролиферацию клеток. На клетках плоскоклеточного рака языка человека YD-10B были получены аналогичные результаты: МДП ингибировал NOD2-сигналинг, что приводило к индукции апоптоза и ингибированию пролиферации клеток [16]. Ранее потенцирование противоопухолевого эффекта цисплатина и ФНО-а наблюдали при их сочетании с ГМДП на различных по гистогенезу опухолевых клетках: выживаемость клеток линий MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека), U-937 (гистиоцитарная лимфома человека), В-16 (меланома мыши), L-929 (фибросаркома мыши) и асцитной карциномы Эрлиха мыши значительно снижалась при применении комбинаций ГМДП/циспла-тин/ФНО-а, ГМДП/цисплатин или ГМДП/ФНО-а по сравнению с индивидуальным применением цито-статика или цитокина [17]. В то же время ГМДП не изменял цитотоксичность цисплатина или ФНО-а в отношении нормальных клеток — лимфоцитов и перитонеальных макрофагов человека и клеток костного мозга мыши.
Все вышесказанное обусловливает перспективность включения иммунотерапевтического лекарствен-
ного средства ГМДП — представителя 3-го поколения иммунопрепаратов — в схемы противоопухолевой терапии. Однако из-за высокой пирогенности ГМДП не нашел применения в онкологической клинической практике. В связи с этим актуален поиск производных ГМДП, близких ему по фармакологическим свойствам, но менее пирогенных.
В ЗАО «Пептек» разработан способ получения близкого аналога ГМДП — ^ацетилглюкозами-нил^-ацетилмурамил^-аланил^-глутаминовой кислоты (ГМДП-А) [18], имеющего многократно меньшую пирогенность, чем ГМДП. Было выявлено, что при подкожном введении ГМДП-А демонстрирует широкий спектр иммуномодулирующего действия, механизм которого близок к механизму действия ГМДП.
Настоящая работа посвящена изучению фармакологического действия препарата ГМДП-А как модификатора биологических реакций, а именно экспериментальному изучению его модифицирующего действия в отношении химиотерапии традиционными препаратами.
Материалы и методы
Животные
В работе использовали мышей, полученных из питомника Научного центра биомедицинских технологий РАМН (филиал «Андреевка»):
С57В1^, самки;
Ва1Ь/с, самки;
B6D2F1 - (С57В1Д^ х DBA2) F1, самки.
Возраст мышей: 7-8 нед.
Вес тела мышей перед инокуляцией опухоли: 18-25 г.
Экспериментальные опухоли
В работе использовали модели опухолей мыши: лимфолейкоз Р-388 (мыши B6D2F1, самки), меланому В-16 (мыши С57В1^, самки), рак шейки матки РШМ-5 и саркому S-37 (мыши B6D2F1, самки), аденокарци-ному толстой кишки С-26 и аденокарциному толстой кишки АКАТОЛ (мыши Ва1Ь/с, самки).
Для получения солидного варианта роста (опухоли В-16, РШМ-5, S-37, С-26 и АКАТОЛ) опухолевый материал прививали подкожно (п/к) на правый бок животных, для получения асцитного варианта (опухоли S-37 и Р-388) — внутрибрюшинно (в/б).
Препараты, дозы, путь введения
Субстанцию ГМДП-А (ЗАО «Пептек») перед введением растворяли в стерильной воде для инъекций до концентрации 1 мг/мл (0,1 %) и вводили мышам ежедневно п/к в разовой дозе 3,75 мг/кг: 5-кратно (курсовая доза 18,75 мг/кг), 10-кратно (курсовая доза 37,5 мг/кг) или 20-кратно (курсовая доза 75,0 мг/кг). Дизайн исследования для каждой модели опухоли описан в разделе «Результаты».
Готовую лекарственную форму «ГМДП-А, раствор для подкожного введения 10 мг/мл» (ОАО «ВНЦ БАВ») перед введением разводили в 10 раз водой для инъекций до концентрации 1,0 мг/мл, вводили мышам ежедневно п/ к в разовой дозе 3,75 мг/кг (аналогично субстанции), кратность введения зависела от модели опухоли, суммарная доза указана в разделе «Результаты» для каждой модели.
Цисплатин-ТЕВА (Pharmachemie B.V., Нидерланды, для Teva Pharmaceutical Industries Ltd., Израиль), международное непатентованное наименование (МНН) — цисплатин, вводили внутривенно (в/в) однократно в дозе 4 мг/кг: 1 /2 терапевтической дозы (ТД) через 24 ч или на 5-е (10-е) сутки после инокуляции опухоли за 1 ч до 1-го введения ГМДП-А. Использовали на моделях опухолей Р-388, S-37, РШМ-5 и В-16.
Фторурацил-ЛЭНС (ООО «ЛЭНС-Фарм», дочерняя компания ОАО «ВЕРОФАРМ», Россия), МНН -5-фторурацил, вводили однократно в / в в дозе 125 мг/кг (1/2 ТД) через 24 ч или на 5-е сутки после инокуляции опухоли за 1 ч до 1-го введения ГМДП-А. Использовали на моделях опухолей С-26 и АКАТОЛ.
Гемзар (ЗАО «Биокад», Россия), МНН — гемци-табин, вводили в/в однократно в дозе 120 мг/кг (1/2 ТД) через 24 ч после инокуляции опухоли за 1 ч до 1-го введения ГМДП-А. Использовали на модели опухоли Р-388.
Циклофосфан (Baxter Oncology GmbH, Германия), МНН — циклофосфамид, вводили однократно в/в в дозе 50 мг/кг (1/5 ТД) через 24 ч после инокуляции опухоли за 1 ч до 1-го введения ГМДП-А. Использовали на модели опухоли Р-388.
Лечение в опытных группах животных с солидными опухолями S-37, В-16, С-26 проводили на ранние сроки развития опухолей и отсроченно (1-е и 5-е сутки после инокуляции опухоли соответственно) в различных режимах: при 5-, 10- или 20-кратном ежедневном введении ГМДП-А п/к в зону, близко расположенную к опухоли. Мышам с асцитной формой опухоли ГМДП-А вводили 10-кратно в/б.
На моделях РШМ-5, АКАТОЛ и Р-388 сравнивали влияние сочетанного лечения ГМДП-А при п/к введении в зону, близко расположенную к опухоли, и симметричную область на противоположной стороне тела мыши.
За животными наблюдали до конца их жизни, регистрировали общее состояние животных, размеры опухоли и сроки гибели животных. У половины от общего числа животных в экспериментальных группах проводили аутопсию для оценки генерализации опухолевого процесса: у мышей с лимфолей-козом Р-388 — на 23-и сутки после инокуляции опухолевого материала, с меланомой В-16 — на 22-е
16 Оригинальные статьи
сутки, с опухолями РШМ-5, АКАТОЛ и С-26 — и/или вторичных (метастатических) очагов экспери-на 40-41-е сутки после прививки опухоли. ментальных перевиваемых опухолей (солидные и ас-Оценка противоопухолевой и антиметастатической цитные варианты) не было выявлено ни для одной эффективности из перечисленных выше опухолей (см. раздел «Ма- Противоопухолевую эффективность сочетанного териалы и методы»). лечения оценивали по общепринятым критериям: Однако на моделях иммунозависимых опухолей динамика изменения объема опухоли (v, мм3) = dt х (лимфолейкоз Р-388, меланома В-16, рак шейки d2 х d3 х 0,52, где dp d2 и d3 — 3 взаимно перпендику- матки РШМ-5) прослеживалась тенденция к проти-лярных диаметра опухоли, уровень торможения ро- воопухолевому действию ГМДП-А по торможению ста опухоли (ТРО, %) = (V — V ) / V х 100, где роста первичных очагов. Учитывая данные литерату-Vоп — объем опухоли в опытной группе, V, — объем ры, можно предположить, что этот эффект обуслов-опухоли в контрольной группе, и увеличение продол- лен воздействием ГМДП-А на иммунную систему жительности жизни (УПЖ, %) животных [19]. животных. На моделях Р-388 и РШМ-5 не было от-Влияние лечения на генерализацию опухолевого мечено значимого различия в эффективности лече-процесса у мышей с лимфолейкозом Р-388 и на мо- ния мышей при введении ГМДП-А в зону, близко делях с лимфогенным метастазированием опухоли расположенную к опухоли, или в зону, удаленную (РШМ-5, S-37) оценивали по частоте обнаружения от места инокуляции опухоли. Это свидетельствует вторичных опухолевых очагов (А, % — процент жи- в пользу дистантного действия ГМДП-А, которое вотных с метастазами в лимфатических узлах по от- свойственно различным иммуномодулирующим ношению к общему количеству животных в группе) средствам, и может косвенно подтверждать иммун-и уровню торможения их роста (TA, %) = Мк (V,) — ный механизм воздействия. Моп(V )/ Мк(V) х 100, где Моп(V ) — средняя сум- Полученные в предварительных опытах резуль-марная масса пораженных опухолью лимфатических таты послужили основанием для развития исследо-узлов в пересчете на 1 мышь в опытной группе, Мк ваний с использованием химиоиммунологической (Vx) — средняя суммарная масса пораженных опухо- комбинации и изучения ГМДП-А в качестве моди-лью лимфатических узлов в пересчете на 1 мышь фикатора биологических реакций, а именно изуче-в контрольной группе. ния его модифицирующего действия в отношении На моделях меланомы В-16, карцином С-26 эффективности химиотерапии традиционными ци-и АКАТОЛ оценивали частоту метастазирования тостатическими препаратами. опухоли в легкие (ЧМ, %) и уровень торможения Исследовали как субстанцию, так и готовую ле-метастазирования (ТМ, %), рассчитанный по вели- карственную форму ГМДП-А. Они не различались чинам средней массы легких у животных в опытной по физиологическому действию на различных моде-и контрольной группах [20]. лях, поэтому в дальнейшем будут приведены объеди-Критериями эффективности противоопухолевых ненные данные по обоим лекарственным средствам. свойств лекарственных средств являлись ТРО >70 %, На модели лимфолейкоза Р-388 (солидный вари-УПЖ >50 %, ТА (ТМ) >75 % [19]. ант) сравнили эффективность сочетанного лечения мышей цисплатином и ГМДП-А при различных схе-Статистический анализ мах воздействия: при раннем и отсроченном начале Для анализа результатов исследования исполь- лечения (курсовая доза ГМДП-А 37,5 мг/кг), зовали стандартную компьютерную программу при раннем начале лечения и различной курсовой STATISTICA версии 8. Для цифровых данных, объ- дозе ГМДП-А (37,5 и 78,5 мг/кг), а также при п/к ема опухоли, лимфатических узлов и веса лимфати- введении ГМДП-А (курсовая доза 78,5 мг/кг) в зону, ческих узлов или легких вычисляли групповое близко расположенную к опухоли, или в симметрич-среднее арифметическое (М) и стандартную ошиб- ную область тела на противоположном боку живот-ку среднего (± m). Для оценки достоверности раз- ного. личий между опытной и контрольной группами Показано, что введение ГМДП-А достоверно применяли Т-критерий Стьюдента. Различия между повышало терапевтическое действие химиотерапии группами считали статистически достоверными с использованием низкоэффективной дозы циспла-прир <0,05. тина ('/2 ТД). При этом выраженное улучшение результатов лечения по показателям ТРО и ТА наблю-Результаты и обсуждение далось не только при раннем, но и при отсроченном В предварительных опытах оценили эффектив- начале лечения: ТРО и ТА в группах сочетанной те-ность противоопухолевого действия ГМДП-А в мо- рапии на 30—40 % превышало таковое в группах нотерапии (данные не представлены). Биологически цисплатина (рис. 1, табл. 1). Однако продолжитель-значимое влияние ГМДП-А на рост первичных ность жизни животных во всех группах оставалась
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 2'2017 том 16 |vol. 16
с; о
£
ю О
800п
700-
600
500-
400
300-
200
100- •...........
0 —В—
с; о
X
ф
ю О
10 12 14 16 1i День роста опухоли
20
800-, 700600 500 400 300 200 100 0
10 12 14 16 18 20 День роста опухоли
рис. 1. Влияние ГМДП-А на лечебное действие цисплатина у мышей BDF1 с солидным вариантом лимфолейкоза Р-388 в зависимости от режима воздействия. Начало лечения на 1-е сутки (а) или на 5-е сутки (б) после инокуляции опухоли. Воздействие: ■ — цисплатин внутривенно однократно и ГМДП-А подкожно 10-кратно; □ — цисплатин внутривенно однократно и ГМДП-А подкожно 20-кратно; О — цисплатин внутривенно однократно; * — вода для инъекций подкожно 10-кратно; • — вода для инъекций подкожно 20-кратно; О — без воздействия. Дозы: ГМДП-А — разовая доза 3,75 мг/кг; цисплатин — 4 мг/кг. Кривые отражают динамику роста первичной опухоли, данные представлены в виде М ± т (п = 10)
таблица 1. Влияние ГМДП-А на показатели продолжительности жизни и генерализации опухолевого процесса у мышей с солидным вариантом лимфолейкоза Р-388, получавших лечение цисплатином, в зависимости от режима воздействия
б
а
Группа режим воздействия СПЖ, дни УПЖ, % А, % та, %
начало лечения на 1-е сутки роста опухоли
1 Цисплатин + ГМДП-А, 10-кратно 25 ± 1 4 100 88
2 Цисплатин + ГМДП-А, 20-кратно 27 ± 1 13 100 80
3 Цисплатин 23 ± 1 —4 100 49
4 Вода для инъекций, 20-кратно 24 ± 1 0 100 4
начало лечения на 5-е сутки роста опухоли
5 Цисплатин + ГМДП-А, 10-кратно 25 ± 3 4 100 83
6 Цисплатин 24 ± 1 0 100 50
7 Вода для инъекций, 10-кратно 24 ± 1 0 100 — 1
8 Без воздействия 24 ± 1 — 100 —
Примечание. Цисплатин — 4мг/кг в/в однократно; ГМДП-А — разовая доза 3,75мг/кг п/к. СПЖ — средняя продолжительность жизни; УПЖ — увеличение продолжительности жизни; А — частота обнаружения вторичного поражения лимфатических узлов; ТА — торможение роста вторичных опухолевых очагов.
сходной. Не обнаружено достоверных различий в модифицирующем действии ГМДП-А при п/к введении субстанции в непосредственной близости от опухоли или в отдаленной от опухоли симметричной области тела (рис. 2а, табл. 2).
Усиление терапевтического действия цитоста-тиков по всем исследованным показателям - ТРО, УПЖ и ТА, независимо от отдаленности места введения ГМДП-А по отношению к опухолевому очагу, было получено на модели Р-388 с использованием гемцитабина и циклофосфамида (рис. 2б, в, табл. 2).
На модели меланомы В-16 отмечено модифицирующее влияние ГМДП-А на терапевтическую эффективность цисплатина как при раннем, так и при отсроченном начале лечения. При этом на фоне слабого потенцирующего действия на эффект цитостатика в отношении ингибирования роста первичного очага меланомы (рис. 3) добавление в схему лечения мышей ГМДП-А в курсовой дозе 18,75 или 37,5 мг/кг приводило к выраженному торможению метастазирования опухоли, а при раннем начале лечения - к достоверному УПЖ животных (табл. 3).
800
700-
600
2
2
500-
X
> с 400
о
2
01 А 300-
Ю
О
200
100-
0
6
о &
с
о 5
Ф £
ю О
10 12 14 16 18 20 22 День роста опухоли
800-1 7006005004003002001000
10 12 14 16 18 20 22 День роста опухоли
На модели плоскоклеточного рака шейки матки РШМ-5 оценили влияние ГМДП-А на эффективность терапевтического действия цисплатина при начале лечения через 1 сут после инокуляции опухолевого материала и через 10 сут (срок обусловлен медленным ростом опухоли).
Выявлено, что при раннем начале лечения ГМДП-А усиливал терапевтическое действие цис-платина, особенно при длительном (10-кратном) введении (курсовая доза 37,5 мг/кг) (рис. 4). Показатели ТРО, УПЖ и ТА в группах животных, получавших сочетание цисплатина и ГМДП-А, были выше, чем в группе животных, получавших только цисплатин. Однако более позднее начало лечения с применением указанных схем оказалось неэффективным (табл. 4).
Увеличение разовой дозы ГМДП-А до 7,5 мг/кг и курсовой дозы до 150,0 мг/кг не приводило к увеличению выраженности противоопухолевого эффекта сочетанного воздействия. Как и на других
10 12 14 16 18 20 22 День роста опухоли
Рис. 2. Влияние ГМДП-А на лечебное действие цисплатина (а), гем-цитабина (б) и циклофосфамида (в) у мышей BDF1 с солидным вариантом лимфолейкоза Р-388 в зависимости от места введения ГМДП-А. Начало лечения на 1-е сутки после инокуляции опухоли. Воздействие: ■ — цитостатик однократно и ГМДП-А 20-кратно, введение подкожно рядом с опухолевым узлом; ▼ — то же, введение ГМДП-А в симметричную область на противоположной стороне тела животного; О — цитостатик внутривенно однократно; • — вода для инъекций подкожно 20-кратно. Дозы: ГМДП-А — разовая доза 3,75 мг/кг; цисплатин — 4 мг/кг; гемцитабин — 120 мг/кг; ци-клофосфамид — 50 мг/кг. Кривые отражают динамику роста первичной опухоли, данные представлены в виде М± т (п = 10)
опухолевых моделях, у мышей с опухолью РШМ-5 не выявлено отличий в эффекте модифицирующего действия при введении ГМДП-А рядом с подкожной опухолью или в симметричную область на противоположной стороне тела животного (данные не представлены).
Таким образом, сравнительная оценка эффективности потенцирующего действия ГМДП-А на чувствительных моделях (Р-388, В-16 и, в меньшей степени, РШМ-5) показала, что в схемах сочетанной терапии с редуцированными дозами цитостатиков препарат позволяет обеспечить уровень терапевтического действия, отвечающий требованиям эффективности по критериям, принятым для оценки активности противоопухолевых средств.
На других опухолевых моделях — саркоме S-37 (солидный и асцитный варианты), аденокарциномах толстой кишки С-26 и АКАТОЛ — не отмечено увеличения противоопухолевого действия цитостатиче-ских препаратов (цисплатин, 5-фторурацил)
а
в
таблица 2. Влияние ГМДП-А на показатели продолжительности жизни и генерализации опухолевого процесса у мышей с солидным вариантом лимфолейкоза Р-388, получавших лечение цитостатиками, в зависимости от места подкожного введения ГМДП-А
Группа режим воздействия СПЖ, дни УПЖ, % а, % та, %
Цисплатин и ГмдП-А
1 Цисплатин + ГМДП-А* 29 ± 2 21 100 55
2 Цисплатин + ГМДП-А** 34 ± 2 39 100 51
3 Цисплатин 26 ± 1 9 100 40
Гемцитабин и ГмдП-А
5 Гемцитабин + ГМДП-А* 38 ± 4 57 100 73
6 Гемцитабин + ГМДП-А** 34 ± 2 43 100 70
7 Гемцитабин 29 ± 2 21 100 69
Циклофосфамид и ГмДП-А
8 Циклофосфамид + ГМДП-А* 39 ± 2 61 100 88
9 Циклофосфамид + ГМДП-А** 37 ± 3 54 100 90
10 Циклофосфамид 31 ± 2 30 100 89
11 Вода для инъекций, 20-кратно 24 ± 3 0 100 -3
12 Без воздействия 24 ± 1 - 100 -
Примечание. Цисплатин — 4мг/кг в/в однократно; гемцитабин — 120мг/кг в/в однократно; циклофосфамид — 50мг/кг в/в однократно; ГМДП-А — разовая доза 3,75мг/кг п/к 20-кратно; *рядом с опухолевым узлом, **симметричная область на противоположной стороне тела животного. Начало лечения на 1-е сутки роста опухоли. СПЖ — средняя продолжительность жизни; УПЖ — увеличение продолжительности жизни; А — частота обнаружения вторичного поражения лимфатических узлов; ТА — торможение роста вторичных опухолевых очагов.
а 1200 п
1000-
800-
о 600 H
£
S 400-
ю О
200
10 12 14 16 1 День роста опухоли
20
б 1200 п
1000-
800-
I 600
с
ф fi
ю О
400-
200
10 12 14 16 1 День роста опухоли
8 20
рис. 3. Влияние ГМДП-А на лечебное действие цисплатина у мышей C57Bl/6j с подкожно привитой меланомой B-16, в зависимости от режима воздействия. Начало лечения на 1-е сутки (а) или на 5-е сутки (б) после инокуляции опухоли. Воздействие: ■ — цисплатин внутривенно однократно и ГМДП-А подкожно 5-кратно; □ — цисплатин внутривенно однократно и ГМДП-А подкожно 10-кратно; О — цисплатин внутривенно однократно; • — вода для инъекций подкожно 10-кратно; О — без воздействия. Дозы: цисплатин — 4 мг/кг, ГМДП-А — разовая доза 3,75 мг/кг. Кривые отражают динамику роста первичной опухоли, данные представлены в виде М± m (n = 10)
0
0
при их сочетании с ГМДП-А в различных дозах и режимах. То есть, как и при монотерапии ГМДП-А, эффективность его добавления в схему химиотера-
певтического воздействия зависела от гистологической формы опухоли и проявлялась только в отношении иммунозависимых опухолей.
Таблица 3. Влияние ГМДП-А на показатели продолжительности жизни и генерализации опухолевого процесса у мышей С57Bl/6j с подкожно привитой меланомой В16, получавших лечение цисплатином, в зависимости от режима воздействия
Группа Режим воздействия СПЖ, дни УПЖ, % чм, % тм, %
Начало лечения на 1 -е сутки роста опухоли
1 Цисплатин + ГМДП-А, 5-кратно 29 ± 3 38 20 99
2 Цисплатин + ГМДП-А, 10-кратно 39 ± 1 86 20 99
3 Цисплатин 28 ± 3 33 20 99
4 Вода для инъекций, 10-кратно 22 ± 5 5 100 0
Начало лечения на 5 -е сутки роста опухоли
5 Цисплатин + ГМДП-А, 5-кратно 31 ± 4 48 20 99
Цисплатин + ГМДП-А, 10-кратно 28 ± 6 33 30 83
6 Цисплатин 25 ± 3 19 100 11
7 Вода для инъекций, 10-кратно 21 ± 2 0 100 0
8 Без воздействия 21 ± 3 - 100 -
Примечание. Цисплатин — 4мг/кг в/в однократно; ГМДП-А — п/к, разовая доза 3,75мг/кг. СПЖ — средняя продолжительность жизни; УПЖ — увеличение продолжительности жизни; ЧМ — частота метастазирования в легкие; ТМ — торможение роста метастазов в легких.
■
а 1600 -|
1400 -
1200 -
1 1000 -s
о 800600 400 200 0
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 День роста опухоли
б 2400
2000-
1600-
о
X
с
о
ю О
1200-
800-
400
о-
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 День роста опухоли
0
Рис. 4. Влияние ГМДП-А на лечебное действие цисплатина у мышей-гибридов F1 с подкожно привитым РШМ-5 в зависимости от режима воздействия. Начало лечения на 1-е сутки (а) или на 10-е сутки (б) после инокуляции опухоли. Воздействие: □ — цисплатин внутривенно однократно и ГМДП-А подкожно 10-кратно; ■ — цисплатин внутривенно однократно и ГМДП-А подкожно 5-кратно; О — цисплатин внутривенно однократно; • — вода для инъекций подкожно 10-кратно; О — без воздействия. Дозы: цисплатин — 4мг/кг; ГМДП-А — разовая доза 3,75 мг/кг. Кривые отражают динамику роста первичной опухоли, данные представлены в виде М ± т (п = 10)
Полученные данные коррелируют с результатами экспериментальных исследований противоопухолевой активности ГМДП, близкого аналога ГМДП-А, в различных моделях перевиваемых опухолей [14], в которых отмечена способность ГМДП угнетать рост экспериментальных опухолей и их метастазиро-вание in vivo. На основании анализа экспериментальных данных авторы предполагают, что отмеченные
эффекты обусловлены активирующим влиянием ГМДП на врожденный иммунитет и увеличением экспрессии опухолевых маркеров на трансформированных клетках. В обзоре также приведены доказательства потенцирующего действия ГМДП на эффекты цитостатических препаратов и его способности восстанавливать гемопоэз, нарушенный в результате химиотерапии.
таблица 4. Влияние ГМДП-А на показатели продолжительности жизни и генерализации опухолевого процесса у мышей с подкожно привитым РШМ-5, получавших лечение цисплатином, в зависимости от режима воздействия
Группа режим воздействия СПЖ, дни УПЖ, % А, % та, %
начало лечения на 1- е сутки роста опухоли
1 Цисплатин + ГМДП-А, 10-кратно 69 ± 6 50 100 51
2 Цисплатин + ГМДП-А, 5-кратно 61 ± 11 33 100 44
3 Цисплатин 51 ± 5 11 100 33
4 Вода для инъекций, 10-кратно 43 ± 4 -7 100 21
начало лечения на 10 -е сутки роста опухоли
5 Цисплатин + ГМДП-А, 10-кратно 49 ± 4 7 100 0
6 Цисплатин + ГМДП-А, 5-кратно 55 ± 5 20 100 13
7 Цисплатин 51 ± 3 11 100 36
8 Вода для инъекций, 10-кратно 43 ± 3 -7 100 0
9 Без воздействия 46 ± 2 - 100 -
Примечание. Цисплатин — 4мг/кг в/в однократно;ГМДП-А — п/к,разовая доза3,75мг/кг. СПЖ — средняя продолжительность жизни; УПЖ — увеличение продолжительности жизни; А — частота обнаружения вторичного поражения лимфатических узлов; ТА — торможение роста вторичных опухолевых очагов.
Заключение
В настоящем исследовании на моделях мышиных опухолей показано, что ГМДП-А при п/к введении проявляет модифицирующие свойства в отношении ряда цитостатических препаратов: цисплатина, гемци-табина и циклофосфамида, усиливая их противоопухолевое действие, что подтверждает потенциал ГМДП-А
как модификатора биологических реакций. Поскольку наиболее выраженный эффект ГМДП-А отмечен на модели лимфолейкоза Р-388, этот препарат может быть рекомендован для клинических испытаний при химиотерапии больных с онкогематологическими заболеваниями в качестве агента, потенцирующего противоопухолевое действие цитостатиков.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Состояние онкологической помощи населению России в 2014 году. Под ред. АД. Каприна, В.В. Старинского, ЕВ. Петровой. М.: МНИОИ им. ПА Герцена -филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2015. 236 с.
2. Sorbara M.T., Philpott D.J. Peptidogly-can: a critical activator of the mammalian immune system during infection
and homeostasis. Immunol Rev 2011;243 (1):40-60.
DOI: 10.1111/j.1600-065X.2011.01047.x. PMID: 21 884 166.
3. Girardin S.E., Boneca I.G., Viala J.
et al. NOD2 is a general sensor of pepti-doglycan through muramyl dipeptide (MDP) detection. J Biol Chem 2003; 278 (11):8869-72. DOI: 10.1074/jbc.C200651200. PMID: 12527755.
4. Laman A.G., Lathe R., Savinov G.V.
et al. Innate immunity: bacterial cell-wall
muramyl peptide targets the conserved transcription factor YB-1. FEBS Lett 2015;589(15):1819-24. DOI: 10.1016/j. febslet.2015.05.028. PMID: 26026270.
5. Lyabin D.N., Eliseeva I.A., Ovchin-nikov L. P. YB-1 protein: functions and regulation. Wiley Interdiscip Rev RNA 2014;5(1):95—110.
DOI: 10.1002/wrna. 1200. PMID: 24217978.
6. Grimes C.L., Ariyananda L.Z., Mel-nyk J.E., O'Shea E.K. The innate immune protein NOD2 binds directly
to MDP, a bacterial cell wall fragment. J Am Chem Soc 2012;134(33):13535-7. DOI: 10.1021/ja303883c. PMID: 22857257.
7. Meshcheryakova E., Makarov E., Philpott D. Evidence for correlation between the intensities of adjuvant effects and NOD2 activation by monomeric,
dimeric and lipophylic derivatives of N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl peptides. Vaccine 2007;25(23):4515-20. DOI: 10.1016/j.vaccine.2007.04.006. PMID: 17481783.
8. Pan Q., Mathison J., Fearns C. et al. MDP-induced interleukin-1 beta processing requires NOD2 and CIAS1/NALP3. J Leukoc Biol 2007;82(1):177-83.
DOI: 10.1189/jlb.1006627. PMID: 17403772.
9. Windheim M., Lang Ch., Peggie M. et al. Molecular mechanisms involved in the regulation of cytokine production by muramyl dipeptide. Biochem J 2007;404(2):179-90.
DOI: 10.1042/BJ20061704. PMID: 17348859. 10. Yang S., Tamai R., Akashi S. et al. Synergistic effect of muramyldipeptide with lipopolysaccharide or lipoteichoic acid
to induce inflammatory cytokines in human monocytic cells in culture. Infect. Immun. 2001;69(4):2045-53. DOI: 0.1128/IAI. 69.4.2045-2053.2001. PMID: 11254557.
11. Valyakina T.I., Malakhov A., Malakho-va N. et al. Glucosaminylmuramyldipep-tide induced changes in phenotype
of melanoma cells result in their increased lysis by peripheral blood cells. Int J Oncol 1996;9(5):885-91. PMID: 21541591.
12. Hoos A. Development of immune-oncology drugs — from CTLA4 to PDI to the next generations. Nat Rev Drug Discov 2016;15(4):235-47.
DOI: 10.1038/nrd.2015.35. PMID: 26965203.
13. Trescec A., Iskric S., Ljevakovic D. et al. The effects of immunomodulating pepti-doglycan monomer and muramyl dipep-tide on hepatic microsomal UDP-glucu-ronyltransferase and beta-glucuronidase. Int J Immunopharmacol 1987;9(3):371-8.
DOI: 10.1016/0192-0561(87)90063-4. PMID: 3112033.
14. Козлов И.Г., Воронина Е.В., Валяки-на Т.И. и др. Ликопид в иммунотерапии опухолей: обзор экспериментальных исследований. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии 2011;10(2):2—7.
15. Dong Y., Wang S., Wang C. et al. Antagonizing NOD2 signaling with conjugates of Paclitaxel and muramyl dipeptide derivatives sensitizers Paclitaxel therapy and significantly prevents tumor metastasis. J Med Chem 2017;60(3)1219-24. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.6b01704. PMID: 28075581.
16. Yoon H.E., Ahn M.Y., Kwon S.M. et al. Nucleotide-binding oligomerization domain 2 (NOD2) activation induces apoptosis of human oral squamous cell carcinoma cells. J Oral Pathol Med 2016;45(4):262-7.
DOI: 10.1111/jop.12354. PMID: 26332444.
17. Петрова Е.Е., Валякина Т.И., Кома-лева Р.Л. и др. Глюкозаминилмура-милдипептид потенцирует действие ФНО-а и цисплатина на трансформированные клеточные линии in vitro.
Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2007;143(2);251—4.
18. Андронова Т.М., Добрушина Е.П., Нижник Е.В. и др. Патент RU
№ 2 573 991 «Способ получения ^ацетилглюкозаминил-^ацетил-мурамил^-аланил^-глутаминовой кислоты». Опубл. 27.01.2016.
19. Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К. и др. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012. С. 642-656.
20. Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К. и др. Методические указания по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ. В кн.: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общ. ред. Р.У. Хабриева. 2-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 2005. С. 637-651.
