CC BY
8
от пациентов с КБАК. Выделенные ИКК из операционного материала с КБАК были стимулированы в сторону остеогенной дифференцировки с добавлением выбранных ингибиторов Notch: CB-103 или кренигацестата, и без них. Степень дифференцировки исследовали с помощью ПЦР в реальном времени, анализировали уровень экспрессии маркеров остеодифференцировки. А также измеряя уровень кальцификации с помощью окрашивания Ализариновым красным. Цитотоксичность изучали с помощью МТТ-теста. Для понимания молекулярных механизмов при использовании ингибиторов остеогенной дифференцировки проводили протеомный анализ с помощью скорострельной протеомики с ионной подвижностью на платформе TimsToF Pro.
Кренигацестат в концентрациях 50-100 нМ полностью подавляет остеогенную дифференцировку и не оказывает очевидного цитотоксического действия. Ингибитор CB-103 не оказывает значимого ингибирую-щего воздействия на остеодифференцировку.
При помощи протеомного анализа были найдены потенциальные мишени кренигацестата. Нами было выявлено изменение экспрессии белков, ассоциированных с развитием скелета, например, фибриллина 1, и белков, ассоциированных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, например, LMOD1. Однако функция большинства из обнаруженных белков не была описана в контексте КБАК ранее, что свидетельствует о недостаточном понимании механизма действия кренигацестата и фундаментальных механизмов остеогенной дифференцировки ИКК.
Другими исследователями кренигацестат был изучен в контексте лечения опухолевых клеток in vitro, в концентрациях схожих с нашими от 100нМ до 10мкМ [1]. И был проверен в клинических испытаниях в перораль-ной форме с дозировками 25, 50 и 75 мг с оптимальной пероральной дозировкой 50 мг и максимальной дозой 100 мг [2]. Он обладает контролируемым токсическим действием без опасных побочных эффектов.
Таким образом, кренигацестат эффективно подавляет остеогенную дифференцировку ИКК, мы знаем эффективную дозировку кренигацестата для ингибиро-вания остеогенной дифференциации ИКК in vitro и интервал дозирования, который безопасен для людей при пероральной или внутривенном введении. Мы предполагаем, что кренигацестат будет эффективен в клинических испытаниях против кальцификации сосудов, но все же считаем, что необходимы дополнительные эксперименты с тканями (кальцинированный аортальный клапан) и моделями животных. Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего Образования Российской Федерации (номер соглашения 075-15-2020-901).
Литература:
1. Mancarella S., Serino G., Dituri F. et al. Cell Death Differ. 2020.
27(8):2330-2343
2. Yuen E., Posada M., Smith C. et al. Cancer Chemotherapy and
Pharmacology. 2019. 83 (3): 483-92.
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ЛИОФИЛИЗАТА КОНДИЦИОНИРОВАННОЙ СРЕДЫ И АМНИОТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ ПРИ МЕСТНЫХ ЛУЧЕВЫХ ПОРАЖЕНИЯХ
В.А. Брунчуков, Т.А. Астрелина, А.А. Расторгуева, И.В. Кобзева, Ю.Б. Сучкова, В.А. Никитина, В.А. Брумберг, Д.Ю. Усупжанова, Е.Е. Ломоносова, Н.В. Соколова, С.В. Лищук, Е.А. Дубова, К.А. Павлов, А.С. Самойлов
ФГБУ ГНЦ РФ Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна, Москва, Россия
e-mail: brunya2008@yandex.ru
Ключевые слова: местные лучевые поражения, амниоти-ческая мембрана, децеллюляризация, кондиционированная среда
Актуальность: при местных лучевых поражениях (МЛП) большой площади не всегда удается получить трансплантаты кожи для укрытия в нужном объеме. Одним из перспективных методов лечения МЛП является применение децеллюляризованной амниотической мембраны человека (АМ), служащей альтернативным источником укрывного материала для лечения различных повреждений организма [1-2].
Цель: изучить эффективность комбинированной терапии МЛП с применением АМ и лиофилизата кондиционированной среды мезенхимальных стромальных клеток плаценты человека (КС).
Материалы и методы: 28 лабораторных животных (крысы Wistar, самцы с массой 230,0± 20,0 граммов). Животные были рандомизированы случайным образом и разделены на 4 группы (n=7) в зависимости от вида проводимой на 21 сутки терапии после моделирования МЛП:
К — контроль без терапии;
А — фиксация АМ узловыми швами к краям язвенной поверхности;
ЛП — интрадермальное введение КС вокруг зоны поражения;
А+ЛП — интрадермальное введение КС и последующая фиксация АМ к краям язвенной поверхности МЛП.
Каждое животное наблюдали 1 раз в неделю до 112 суток, измеряли зону поражения МЛП кожи, рассчитывали площадь язвенной поверхности. На 112 день эксперимента от животных получали биоптат с МЛП для проведения гистологического исследования. В качестве статистического метода использовали U-критерий Манна-Уитни.
Результаты: на 112 день эксперимента регистрировали наименьшую площадь МЛП в группе А+ЛП — 0,08 ± 0,08 см2. В группах А, ЛП и К площадь МЛП составила 0,12 ±0,08, 0,58 ± 0,23 и 2,15 ± 0,57 см2, соответственно. Статистически значимые различия отмечали в группе К по сравнению с другими группами (p<0,05).
Полное заживление МЛП отмечали у 80% животных в группе А+ЛП, в группах А, ЛП и К у 67%, 25% и 0% животных.
Таким образом, по клинической картине заживления была выявлена лидирующая группа — А+ЛП. При патогистологической оценке в группе А+ЛП отмечали дефект кожи с грануляционной тканью и участками фиброза, либо заживший дефект с толщиной эпителиального пласта 5-10 клеток. Дерма фиброзирована с единичными волосяными фолликулами. Подкожная мышца
и подкожно-жировая клетчатка обычного гистологического строения без воспалений.
Заключение: Предложенная комбинированная терапия в группе А+ЛП показала свою эффективность при заживлении МЛП тяжелой степени. Изолированное использование АМ также показало свою эффективность — применение способствовало заживлению тканей и сокращению площади язвенной поверхности.
Литература:
1. Agraval U, Rundle P, Rennie IG et al. Eye (Lond). 2017 Jun;31(6):884-889.
2. Meiler D, Pauklin M, Thomasen H et al. Dtsch Arztebl Int. 2011 Apr;108(14):243-8.
ВЛИЯНИЕ СТЕРИЛИЗАЦИИ В СРЕДЕ СВЕРХКРИТИЧЕСКОГО ДИОКСИДА УГЛЕРОДА НА КАЧЕСТВО КОНСЕРВИРОВАННЫХ АЛЛОГЕННЫХ СУХОЖИЛИЙ
А.А. Будаев1, Н.В. Боровкова1, А.Ю. Николаев2, М.С. Макаров1, М.В. Сторожева1, Т.В. Черненькая1
1 ГБУЗ НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ДЗ г. Москвы, Москва, Россия
2 Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва, Россия
e-mail: BudaevAA@sklif.mos.ru
Ключевые слова: сверхкритический, диоксид углерода, трансплантат, сухожилия, аллогенный, стерилизация.
Цель исследования — оценить стерильность, токсичность и целостность ткани трансплантатов аллогенных сухожилий при использовании разных режимов обработки в среде сверхкритического диоксида углерода (СК СО2).
В работе исследовали 42 образца сухожилий m. tibialis anterior длинной 5 см, полученных от тканевых доноров. Образцы трансплантатов обрабатывали 10% диметил-сульфоксидом 30 минут, помещали в криопробирки объемом 5 мл с перфорированной винтовой крышкой и упаковывали в комбинированный плоский пакет для газовой стерилизации с индикатором. В зависимости от режима стерилизации, образцы разделили на несколько групп: 1 и 4 группы — 6 часов, 100 атм., 2 и 5 группы — 10 часов, 100 атм., 3 и 6 группы — 72 часа, 75 атм. В группах 1-3 проводился медленный сброс давления СО2 (декомпрессия), в 4-6 группах — быстрый. В качестве контроля использовали 6 образцов нативных сухожилий. После стерилизации трансплантаты 1-6 групп хранили при температуре -80оС в течение 14 суток, затем размораживали при +4оС. Стерильность сухожилий оценивали по стандартной методике с использованием тиогликоле-вой среды и бульона Сабуро. Гистологические препараты сухожилий окрашивали гематоксилин-эозином, также оценивали интенсивность автофлуоресценции коллаге-новых волокон. Исследование токсичности проводили в культуре мультипотентных мезенхимальных стромаль-ных клеток костного мозга человека.
После вскрытия реакторов для стерилизации в среде СК СО2 у групп образцов с режимом быстрой декомпрессии выявлены разрывы и намокание упаковочного пакета, у большинства криопробирок сорваны крышки, сухожилия находились на бумажной подложке пакета. В группах с медленной декомпрессией целостность пакетов, пробирок и ткани визуально была не нарушена.
На всех образцах сработал индикатор газовой стерилизации. При бактериологическом посеве трансплантаты из групп с медленной декомпрессией были стерильными, с быстрой декомпрессией — нестерильными. Коллагеновые волокна сухожилий 1-3 групп сохраняли свою целостность и топографию, были параллельно ориентированы и содержали незначительные локальные разрывы, интенсивность их автофлуоресценции соответствовала норме. В сухожилиях 4-6 групп отмечали выраженную отечность, наличие декондесированных волокон с распадом на отдельные фибриллы, обширные разрывы, интенсивность автофлуоресценции коллагена была снижена в 2,1-3,5 раза. Исследование in vitro показало, что все исследуемые типы трансплантатов не оказывали токсического действия на клетки.
Таким образом, режимы стерилизации сухожилий в среде СК СО2 с медленной декомпрессией обеспечивают стерильность трансплантатов и позволяют эффективно сохранить архитектонику ткани.
ИММУНОСУПРЕССИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ИНДУЦИРОВАННЫХ МИКРОВЕЗИКУЛ
А.А. Будюкова, С.В. Курбангалеева, М.О. Гомзикова
Казанский (Приволжский) Федеральный Университет, Казань, Россия
e-mail: budYukova.02@gmail.com
Ключевые слова: естественные везикулы, индуцированные микровезикулы, мезенхимные стволовые клетки, цитохала-зин В.
Клеточная терапия на основе мезенхимных стволовых клеток (МСК) сопряжена с определенными рисками. Однако, везикулы, высвобождаемые МСК, сохраняют терапевтический потенциал родительских клеток. При этом они не несут риска онкотрансформации и являются безопасным терапевтическим инструментом. Главное препятствие для внедрения везикул в клиническую практику — это их ограниченный выход. Метод, разработанный Pick et al., позволяет получить индуцированные микровезикулы (МВ) с помощью цитохалазина В (ЦВ) в большом количестве за счет блокировки полимеризации актиновых филаментов цитоскелета [1]. Было показано, что естественные везикулы, полученные из МСК, демонстрируют иммуносупрессивную активность на дендритных клетках, Т и В-лимфоцитах, макрофагах [2]. Однако, обладают ли подобной способностью индуцированные МВ (далее МВ-ЦВ) оставалось до настоящего времени неизученным. Поэтому мы оценили иммуномодулирую-щую активность МВ-ЦВ, выделенных из МСК, на моно-нуклеарных клетках периферической крови человека (МКПК) in vitro.
МКПК были изолированы из крови с использованием Фиколла путем центрифугирования в градиенте плотности. МВ-ЦВ были получены из МСК жировой ткани человека, обработанных 10 мкг/мл цитохалазина В. МКПК были окрашены CFDA SE, затем инкубированы с 10 мкг/ мл МВ-ЦВ в течение 24 ч и проанализированы с помощью проточного цитофлуориметра BD FACS Aria III.
Фитогемагглютинин (ФГА) способен индуцировать активацию и пролиферацию лимфоцитов in vitro. ФГА (10 мкг/мл) использовался в качестве контроля как активатор, так как было показано, что он повышает экспрессию CD25, являющегося маркером ранней активации лейкоцитов. Иммуноокрашивание с использованием
