CC BY
6
животных [4]. Через 4 недели у группы Фототромбоз (ФТ, n = 9) вызывали фотоиндуцированную ишемию головного мозга (бенгальский розовый 20 мг/кг, 6,7 мг/мл, в/в; лазер 532 нм, 10 мВт, 10 мин; 0 = 2 мм; AP = -1; ML = -2) [5]. Группе Контроль (КТРЛ, n = 9) бенгальский розовый не вводили. Активность мозга записывали методом ШОН за 2-4 д до ФТ, через 3 мин, 24 ч и 7 д после ФТ (кальций: возбуждение 470 нм, эмиссия 530 нм, 20 Гц; гемодинамика: светорассеяние 505 нм, 20 Гц).
У группы КТРЛ не обнаружено изменений активности мозга. В группе ФТ наблюдали волну деполяризации, сопровождающуюся вазоспазмом. В очаге ишемического повреждения резко усиливалась флуоресценция сенсора, что можно интерпретировать как резкое повышение внутриклеточной концентрации кальция ([Ca2+]l) и разрушение клеток с вытеканием сенсора во внеклеточную среду. Наблюдалось увеличение размера зоны с высокой [Ca2+]l в первые минуты после ишемии (ср. арифм. ± ст. ош. ср.: 1,14 ± 0,34 мм2 и 1,34 ± 0,32 мм2 через 3 и 10 мин соответственно) и значительное ее увеличение через 24 ч (6,03 ± 0,82 мм2, p<0,05). Через 7 д интенсивность флуоресценции GCaMP6f в зоне повреждения оставалась повышенной, однако яркость свечения и площадь области уменьшалась относительно 24 ч после ФТ (1,69 ± 0,19 мм2, p<0,05).
Таким образом, модель фотоиндуцированной ишемии позволила сформировать зону пенумбры площадью (4,70 ± 0,60 мм2) с заданной локализацией. Метод ШОН позволяет проследить динамические изменения размеров поврежденной области, что дальнейшем может быть использовано для изучения влияния терапевтических подходов.
Литература:
1. Roth G.A., Abate D., Abate K.H., et al. The Lancet. 2018. V. 392. № 10159. P. 1736-1788.
2. Yl Y, Llu Z, Wang M, Sun, M., et al. Cum Neurovasc Res. 2021. V. 18. № 5. P. 572-585.
3. Zhao H.T., Tuohy M.C., Chow D. et al. Cell Reports. 2021. V. 37. I. 1. Art. № 109794.
4. Sllasl G, Xlao D, Vannl MP., et al. J Neuroscl Methods. 2016. V. 267. P. 141-149.
5. Galkov M, Gulyaev M, Klseleva E, et al. J Neuroscl Methods. 2020. V. 329. № 1. Art. № 108457.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ЗАГРУЖЕННЫХ ОПУХОЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКИМИ АНТИГЕНАМИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК IN VITRO
К.В. Китаева, И.Ю. Филин, А.В. Городилова, Ю.П. Маясин, Ч.Б. Харисова, Д.С. Чулпанова, В.В. Соловьева, А.А. Ризванов
Казанский Федеральный (Приволжский) Университет, Казань, Россия
e-mail: kitaeva.kristina.v@gmail.com
Ключевые слова: иммунотерапия, онкология, дендритные клетки, мембранные везикулы, дендритная вакцина.
Терапевтические вакцины на основе дендритных клеток (ДК) являются многообещающим методом адъювант-ной иммунотерапии, благодаря минимальным побочным эффектам и долговременной модуляции противоопухолевого иммунного ответа. Целью исследования стала оценка противоопухолевого эффекта ДК, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК), загруженных опухоль-специфическими антигенами (ОСА).
МКПК выделяли в градиенте плотности фиколла, полученные клетки культивировали в питательной среде ПРМ1, содержащей 10% РВЭ, 2 мМ 1_-глутамина и смесь пенициллина-стрептомицина при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2. Направленную диффе-ренцировку МКПК проводили в течение 7 дней с использованием факторов 1_-4, ЭМ-СЭР, 1_-1 р, Т1\1Р-а, 1_-6, РЭЕ 2. Для оценки эффективности дифференцировки проведена оценка экспрессии поверхностных СО-маркеров (СР11с, С080, СО83, СО86, СО64, Н_А-О1=!, СО3, СО19, С020, СО56) при помощи проточной цитофлуориметрии. В качестве ОСА использовали лизат опухолевых клеток меланомы человека линии М14 (лизат-М14), а также индуцированные цитохалазином В мембранные везикулы (иМВ-М14), выделенные из нативных и генетически модифицированных клеток М1 4 со сверхэкспрессией ЭМ-СЭР (иМВ-ЭМ-СЭР-ММ). Загруженные ОСА ДК добавляли к нативным МКПК и совместно инкубировали в течение 48 часов для оценки активации Т-киллеров, после чего оценивали цитотоксическую активность Т-киллеров при помощи теста на апоптоз после инкубации с ДК на культуре опухолевых клеток М14.
Нами было показано, что полученные в результате направленной дифференцировки МКПК обладали фенотипом ДК (СО11 с+СО80+СО83+СО86+СО64+Н_А-ОП+СО3-СО19-СО20-СО56-). Загруженные опухолевыми антигенами ДК приводили к увеличению активированных Т-киллеров в культуре МКПК: после инкубации с ДК+лизат-М14 на 32,6%, после ДК+иМВ-М14 на 27,6%, после ДК+иМВ-ЭМ-С8Р-М14 на 32,5%. При этом было показано, что после добавления МКПК+ДК+лизат-М14 в культуру клеток М14 число жизнеспособных клеток снижалось на 18,6%, а при добавлении МКПК+ДК+иМВ-М14 или МКПК+ДК+иМВ-ЭМ-С8Р-М14 на 26,1% и 24,6%, соответственно, относительно нативных клеток М14.
Таким образом, нами показано, что ДК, полученные из МКПК путем направленной дифференцировки цито-кинами и загруженные различными видами ОСА, обладают иммуномодулирующей активностью, которая увеличивает цитотоксический потенциал Т-киллеров в культуре МКПК против клеток меланомы. Данное исследование выполнено в рамках Программы стратегического академического лидерства Казанского федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030) и финансируется за счет гранта Российского научного фонда 22-24-20018.
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ ИНДУЦИРОВАННЫХ МИКРОВЕЗИКУЛ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ХРАНЕНИЯ
С.К. Клетухина, М.О. Гомзикова
НИЛ «Межклеточная коммуникация», Казанский Федеральный университет, Казань, Россия
e-mail: sevindzh.rasulova.1993@mail.ru
Ключевые слова: микровезикулы, мезенхимные стволовые клетки, терапевтический агент, регенеративная медицина.
В настоящее время микровезикулы клеток человека привлекают к себе повышенное внимание исследователей и медиков во всем мире. Микровезикулы (МВ) — это окруженные цитоплазматической мембраной округлые структуры, которые содержат цитоплазматическое содержимое родительской клетки и обладают размером 50-2000 нм. Использование МВ мезенхимных стволовых клеток в регенеративной медицине в качестве терапевтических агентов и векторов доставки лекарственных
средств вызывает большой интерес. Однако применение естественных МВ ограничивает сложная процедура выделения и небольшой выход. Был предложен способ получения МВ в повышенном количестве с использованием вещества цитохалазина В. При этом количественная оценка стабильности индуцированных МВ в растворе изучена недостаточно. Поэтому целью нашей работы стала оценка стабильности иМВ МСК при различных условиях хранения в течение 112 дней.
Микровезикулы получали обработкой МСК 10 мкг/ мл цитохалазина В, как описано ранее. Цитохалазин В является агентом дезорганизации клеточного цитоскелета и большого выхода МВ. Полученные МВ ресуспендирова-ли в физиологическом растворе и хранили в различных условиях: при 37°С, 4°С, -20°С, 25°С, лиофилизировали и хранили при -20°С. Количество МВ анализировали с помощью проточной цитометрии с усиленным детектором светорассеяния (BD FACS Aria III BD Bioscience, США).
Впервые нами было обнаружено, что хранение при 37°С в течение 7 дней позволяет сохранить лишь 30% целых МВ от первоначального числа. Хранение при 25°С в течение 28 дней позволило сохранить только 47% исходного количества, тогда как хранение при 4°С позволило продлить срок годности МВ до 112 дней с сохранением 59% МВ. Лиофилизация привела к получению 49% интактных МВ. В то время как при замораживании МВ, ресуспендированных в физиологическом растворе при -20°С, сохранялось 79,5% МВ.
Таким образом, хранение иМВ МСК в физиологическом растворе при -20°С является наиболее подходящим условием хранения МВ в течение не менее 112 дней. Работа выполнена в рамках Программы стратегического академического лидерства Казанского федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030) и за счет гранта Российского научного фонда № 21-75-10035.
УРОКИНАЗНЫЙ РЕЦЕПТОР И ТКАНЕВОЙ АКТИВАТОР ПЛАЗМИНОГЕНА КАК ГЕНЫ РАННЕГО ОТВЕТА ПРИ ФОРМИРОВАНИИ КОГНИТИВНЫХ ФУНКЦИЙ
П.С. Климович1, 2, В.С. Бойченко1,
К.А. Рубина1, О.И. Ивашкина3, К.А. Торопова3,
К.В. Анохин3, 4, Е.В. Семина1
1 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Институт экспериментальной кардиологии, НМИЦ Кардиологии им. Чазова Минздрава России, Москва, Россия
3 Институт перспективных исследований мозга, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
4 НИИ Нормальной Физиологии им. ПК. Анохина, Москва, Россия
e-mail: lex2050@mail.ru
Ключевые слова: когнитивная нагрузка, память, урокиназ-ная система, урокиназный рецептор, гены раннего ответа, система активаторов плазминогена.
Память представляет собой одну из основных функций головного мозга, необходимую для хранения и извлечения информации, и которая составляет основу всего постна-тального когнитивного развития человека. На клеточном уровне формирование памяти обусловлено возникновением de novo синаптических связей за счет активации генов раннего ответа и реконфигурации ГАМКинтернейронов в гиппокампе и ассоциативной области коры [1].
Одной из основных систем, участвующих в когнитивном развитии организма, является система активаторов плазминогена, состоящая из протеазы урокиназы uPA (ген PLAU), ее рецептора uPAR (ген PLAUR), ингибитора урокиназы PAI-1 (ген SERPINE1) и тканевого активатора плазминогена tPA (PLAT). В нервной ткани урокиназная система опосредует миграцию нейронов в эмбриогенезе и онтогенезе, рост и регенерацию аксонов нейронов, регуляцию генов, связанных с апоптозом. Полиморфизмы генов PLAU и PLAUR ассоциированы с рядом неврологических патологий, нейродегенеративных и психических расстройств (н-р, с болезнью Альцгеймера), что предполагает их участие в процессах, связанных с когнитивными функциями в головном мозге [2].
В исследовании анализировали экспрессию генов белков активаторов плазминогена в головном мозге мыши в условиях когнитивной нагрузки. Мышей помещали в серое открытое поле на 10 минут, после чего измеряли мРНК uPAR, tPA, uPA и PAI-1 в передней, задней коре и гип-покампе через определенные сроки после воздействия (1,3,6, 24 и 72 часа). Было обнаружено достоверное повышение экспресиии мРНК uPAR, tPA уже через час после когнитивной нагрузки во всех структурах головного мозга, что позволяет отнести их к генам раннего ответа. Более того наблюдался второй пик экспрессии через 24 часа (p<0,05). Ранняя индукция генов PLAUR и PLAT (1 час) свидетельствует об их вовлеченности в процессы, связанные с приобретением памяти (новизной), а вот более поздняя (24 часа) может объясняться формированием памяти — отставленным процессом, когда происходит перестройка нейрональной сети, консолидация памяти и перестройка.
Впервые в ответ на когнитивную нагрузку идентифицированы два новых гена раннего ответа: ген рецептора урокиназы и ген тканевого активатора плаз-миногена, что позволяет предположить их участие в формировании памяти и регуляции нейрональной пластичности. Исследование выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (грант No 075 15 2020 801).
Литература:
1. Schomaker J., Meeter M. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. — 2015. — № 55.- P. 268-279.
2. Riemenschneider M., Konta L., Hum Mol Genet. — 2006. — Vol.
15. — № 16. — P. 2446-2456.
РОЛЬ Т-КАДГЕРИНА В АДИПОГЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
П.С. Климович1, 2, С.Э. Мирзаева1, В.Ю. Сысоева1, Е.В. Семина1, К.А. Рубина1
1 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Институт экспериментальной кардиологии, НМИЦ Кардиологии им. Чазова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: lex2050@mail.ru
Ключевые слова: адипоцитарная дифференцировка, ади-понектин, Т-кадгерин, мезенхимальные стромальные клетки, преадипоциты, дипептидилпептидаза-4, адипоциты.
Жировая ткань играет важнейшую эндокринную роль в организме помимо непосредственной функции запасания липидов. Важнейшим гормоном, продуцируемым зрелыми адипоцитами, является адипонектин, системно
