Научная статья на тему 'КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ ИНДУЦИРОВАННЫХ МИКРОВЕЗИКУЛ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ХРАНЕНИЯ'

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ ИНДУЦИРОВАННЫХ МИКРОВЕЗИКУЛ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ХРАНЕНИЯ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
51
6
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
МИКРОВЕЗИКУЛЫ / МЕЗЕНХИМНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ / ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ АГЕНТ / РЕГЕНЕРАТИВНАЯ МЕДИЦИНА
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Клетухина С. К., Гомзикова М. О.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ ИНДУЦИРОВАННЫХ МИКРОВЕЗИКУЛ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ХРАНЕНИЯ»

животных [4]. Через 4 недели у группы Фототромбоз (ФТ, n = 9) вызывали фотоиндуцированную ишемию головного мозга (бенгальский розовый 20 мг/кг, 6,7 мг/мл, в/в; лазер 532 нм, 10 мВт, 10 мин; 0 = 2 мм; AP = -1; ML = -2) [5]. Группе Контроль (КТРЛ, n = 9) бенгальский розовый не вводили. Активность мозга записывали методом ШОН за 2-4 д до ФТ, через 3 мин, 24 ч и 7 д после ФТ (кальций: возбуждение 470 нм, эмиссия 530 нм, 20 Гц; гемодинамика: светорассеяние 505 нм, 20 Гц).

У группы КТРЛ не обнаружено изменений активности мозга. В группе ФТ наблюдали волну деполяризации, сопровождающуюся вазоспазмом. В очаге ишемического повреждения резко усиливалась флуоресценция сенсора, что можно интерпретировать как резкое повышение внутриклеточной концентрации кальция ([Ca2+]l) и разрушение клеток с вытеканием сенсора во внеклеточную среду. Наблюдалось увеличение размера зоны с высокой [Ca2+]l в первые минуты после ишемии (ср. арифм. ± ст. ош. ср.: 1,14 ± 0,34 мм2 и 1,34 ± 0,32 мм2 через 3 и 10 мин соответственно) и значительное ее увеличение через 24 ч (6,03 ± 0,82 мм2, p<0,05). Через 7 д интенсивность флуоресценции GCaMP6f в зоне повреждения оставалась повышенной, однако яркость свечения и площадь области уменьшалась относительно 24 ч после ФТ (1,69 ± 0,19 мм2, p<0,05).

Таким образом, модель фотоиндуцированной ишемии позволила сформировать зону пенумбры площадью (4,70 ± 0,60 мм2) с заданной локализацией. Метод ШОН позволяет проследить динамические изменения размеров поврежденной области, что дальнейшем может быть использовано для изучения влияния терапевтических подходов.

Литература:

1. Roth G.A., Abate D., Abate K.H., et al. The Lancet. 2018. V. 392. № 10159. P. 1736-1788.

2. Yl Y, Llu Z, Wang M, Sun, M., et al. Cum Neurovasc Res. 2021. V. 18. № 5. P. 572-585.

3. Zhao H.T., Tuohy M.C., Chow D. et al. Cell Reports. 2021. V. 37. I. 1. Art. № 109794.

4. Sllasl G, Xlao D, Vannl MP., et al. J Neuroscl Methods. 2016. V. 267. P. 141-149.

5. Galkov M, Gulyaev M, Klseleva E, et al. J Neuroscl Methods. 2020. V. 329. № 1. Art. № 108457.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ЗАГРУЖЕННЫХ ОПУХОЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКИМИ АНТИГЕНАМИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК IN VITRO

К.В. Китаева, И.Ю. Филин, А.В. Городилова, Ю.П. Маясин, Ч.Б. Харисова, Д.С. Чулпанова, В.В. Соловьева, А.А. Ризванов

Казанский Федеральный (Приволжский) Университет, Казань, Россия

e-mail: [email protected]

Ключевые слова: иммунотерапия, онкология, дендритные клетки, мембранные везикулы, дендритная вакцина.

Терапевтические вакцины на основе дендритных клеток (ДК) являются многообещающим методом адъювант-ной иммунотерапии, благодаря минимальным побочным эффектам и долговременной модуляции противоопухолевого иммунного ответа. Целью исследования стала оценка противоопухолевого эффекта ДК, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК), загруженных опухоль-специфическими антигенами (ОСА).

МКПК выделяли в градиенте плотности фиколла, полученные клетки культивировали в питательной среде ПРМ1, содержащей 10% РВЭ, 2 мМ 1_-глутамина и смесь пенициллина-стрептомицина при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2. Направленную диффе-ренцировку МКПК проводили в течение 7 дней с использованием факторов 1_-4, ЭМ-СЭР, 1_-1 р, Т1\1Р-а, 1_-6, РЭЕ 2. Для оценки эффективности дифференцировки проведена оценка экспрессии поверхностных СО-маркеров (СР11с, С080, СО83, СО86, СО64, Н_А-О1=!, СО3, СО19, С020, СО56) при помощи проточной цитофлуориметрии. В качестве ОСА использовали лизат опухолевых клеток меланомы человека линии М14 (лизат-М14), а также индуцированные цитохалазином В мембранные везикулы (иМВ-М14), выделенные из нативных и генетически модифицированных клеток М1 4 со сверхэкспрессией ЭМ-СЭР (иМВ-ЭМ-СЭР-ММ). Загруженные ОСА ДК добавляли к нативным МКПК и совместно инкубировали в течение 48 часов для оценки активации Т-киллеров, после чего оценивали цитотоксическую активность Т-киллеров при помощи теста на апоптоз после инкубации с ДК на культуре опухолевых клеток М14.

Нами было показано, что полученные в результате направленной дифференцировки МКПК обладали фенотипом ДК (СО11 с+СО80+СО83+СО86+СО64+Н_А-ОП+СО3-СО19-СО20-СО56-). Загруженные опухолевыми антигенами ДК приводили к увеличению активированных Т-киллеров в культуре МКПК: после инкубации с ДК+лизат-М14 на 32,6%, после ДК+иМВ-М14 на 27,6%, после ДК+иМВ-ЭМ-С8Р-М14 на 32,5%. При этом было показано, что после добавления МКПК+ДК+лизат-М14 в культуру клеток М14 число жизнеспособных клеток снижалось на 18,6%, а при добавлении МКПК+ДК+иМВ-М14 или МКПК+ДК+иМВ-ЭМ-С8Р-М14 на 26,1% и 24,6%, соответственно, относительно нативных клеток М14.

Таким образом, нами показано, что ДК, полученные из МКПК путем направленной дифференцировки цито-кинами и загруженные различными видами ОСА, обладают иммуномодулирующей активностью, которая увеличивает цитотоксический потенциал Т-киллеров в культуре МКПК против клеток меланомы. Данное исследование выполнено в рамках Программы стратегического академического лидерства Казанского федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030) и финансируется за счет гранта Российского научного фонда 22-24-20018.

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ ИНДУЦИРОВАННЫХ МИКРОВЕЗИКУЛ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ХРАНЕНИЯ

С.К. Клетухина, М.О. Гомзикова

НИЛ «Межклеточная коммуникация», Казанский Федеральный университет, Казань, Россия

e-mail: [email protected]

Ключевые слова: микровезикулы, мезенхимные стволовые клетки, терапевтический агент, регенеративная медицина.

В настоящее время микровезикулы клеток человека привлекают к себе повышенное внимание исследователей и медиков во всем мире. Микровезикулы (МВ) — это окруженные цитоплазматической мембраной округлые структуры, которые содержат цитоплазматическое содержимое родительской клетки и обладают размером 50-2000 нм. Использование МВ мезенхимных стволовых клеток в регенеративной медицине в качестве терапевтических агентов и векторов доставки лекарственных

средств вызывает большой интерес. Однако применение естественных МВ ограничивает сложная процедура выделения и небольшой выход. Был предложен способ получения МВ в повышенном количестве с использованием вещества цитохалазина В. При этом количественная оценка стабильности индуцированных МВ в растворе изучена недостаточно. Поэтому целью нашей работы стала оценка стабильности иМВ МСК при различных условиях хранения в течение 112 дней.

Микровезикулы получали обработкой МСК 10 мкг/ мл цитохалазина В, как описано ранее. Цитохалазин В является агентом дезорганизации клеточного цитоскелета и большого выхода МВ. Полученные МВ ресуспендирова-ли в физиологическом растворе и хранили в различных условиях: при 37°С, 4°С, -20°С, 25°С, лиофилизировали и хранили при -20°С. Количество МВ анализировали с помощью проточной цитометрии с усиленным детектором светорассеяния (BD FACS Aria III BD Bioscience, США).

Впервые нами было обнаружено, что хранение при 37°С в течение 7 дней позволяет сохранить лишь 30% целых МВ от первоначального числа. Хранение при 25°С в течение 28 дней позволило сохранить только 47% исходного количества, тогда как хранение при 4°С позволило продлить срок годности МВ до 112 дней с сохранением 59% МВ. Лиофилизация привела к получению 49% интактных МВ. В то время как при замораживании МВ, ресуспендированных в физиологическом растворе при -20°С, сохранялось 79,5% МВ.

Таким образом, хранение иМВ МСК в физиологическом растворе при -20°С является наиболее подходящим условием хранения МВ в течение не менее 112 дней. Работа выполнена в рамках Программы стратегического академического лидерства Казанского федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030) и за счет гранта Российского научного фонда № 21-75-10035.

УРОКИНАЗНЫЙ РЕЦЕПТОР И ТКАНЕВОЙ АКТИВАТОР ПЛАЗМИНОГЕНА КАК ГЕНЫ РАННЕГО ОТВЕТА ПРИ ФОРМИРОВАНИИ КОГНИТИВНЫХ ФУНКЦИЙ

П.С. Климович1, 2, В.С. Бойченко1,

К.А. Рубина1, О.И. Ивашкина3, К.А. Торопова3,

К.В. Анохин3, 4, Е.В. Семина1

1 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия

2 Институт экспериментальной кардиологии, НМИЦ Кардиологии им. Чазова Минздрава России, Москва, Россия

3 Институт перспективных исследований мозга, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия

4 НИИ Нормальной Физиологии им. ПК. Анохина, Москва, Россия

e-mail: [email protected]

Ключевые слова: когнитивная нагрузка, память, урокиназ-ная система, урокиназный рецептор, гены раннего ответа, система активаторов плазминогена.

Память представляет собой одну из основных функций головного мозга, необходимую для хранения и извлечения информации, и которая составляет основу всего постна-тального когнитивного развития человека. На клеточном уровне формирование памяти обусловлено возникновением de novo синаптических связей за счет активации генов раннего ответа и реконфигурации ГАМКинтернейронов в гиппокампе и ассоциативной области коры [1].

Одной из основных систем, участвующих в когнитивном развитии организма, является система активаторов плазминогена, состоящая из протеазы урокиназы uPA (ген PLAU), ее рецептора uPAR (ген PLAUR), ингибитора урокиназы PAI-1 (ген SERPINE1) и тканевого активатора плазминогена tPA (PLAT). В нервной ткани урокиназная система опосредует миграцию нейронов в эмбриогенезе и онтогенезе, рост и регенерацию аксонов нейронов, регуляцию генов, связанных с апоптозом. Полиморфизмы генов PLAU и PLAUR ассоциированы с рядом неврологических патологий, нейродегенеративных и психических расстройств (н-р, с болезнью Альцгеймера), что предполагает их участие в процессах, связанных с когнитивными функциями в головном мозге [2].

В исследовании анализировали экспрессию генов белков активаторов плазминогена в головном мозге мыши в условиях когнитивной нагрузки. Мышей помещали в серое открытое поле на 10 минут, после чего измеряли мРНК uPAR, tPA, uPA и PAI-1 в передней, задней коре и гип-покампе через определенные сроки после воздействия (1,3,6, 24 и 72 часа). Было обнаружено достоверное повышение экспресиии мРНК uPAR, tPA уже через час после когнитивной нагрузки во всех структурах головного мозга, что позволяет отнести их к генам раннего ответа. Более того наблюдался второй пик экспрессии через 24 часа (p<0,05). Ранняя индукция генов PLAUR и PLAT (1 час) свидетельствует об их вовлеченности в процессы, связанные с приобретением памяти (новизной), а вот более поздняя (24 часа) может объясняться формированием памяти — отставленным процессом, когда происходит перестройка нейрональной сети, консолидация памяти и перестройка.

Впервые в ответ на когнитивную нагрузку идентифицированы два новых гена раннего ответа: ген рецептора урокиназы и ген тканевого активатора плаз-миногена, что позволяет предположить их участие в формировании памяти и регуляции нейрональной пластичности. Исследование выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (грант No 075 15 2020 801).

Литература:

1. Schomaker J., Meeter M. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. — 2015. — № 55.- P. 268-279.

2. Riemenschneider M., Konta L., Hum Mol Genet. — 2006. — Vol.

15. — № 16. — P. 2446-2456.

РОЛЬ Т-КАДГЕРИНА В АДИПОГЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

П.С. Климович1, 2, С.Э. Мирзаева1, В.Ю. Сысоева1, Е.В. Семина1, К.А. Рубина1

1 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия

2 Институт экспериментальной кардиологии, НМИЦ Кардиологии им. Чазова Минздрава России, Москва, Россия

e-mail: [email protected]

Ключевые слова: адипоцитарная дифференцировка, ади-понектин, Т-кадгерин, мезенхимальные стромальные клетки, преадипоциты, дипептидилпептидаза-4, адипоциты.

Жировая ткань играет важнейшую эндокринную роль в организме помимо непосредственной функции запасания липидов. Важнейшим гормоном, продуцируемым зрелыми адипоцитами, является адипонектин, системно

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.