CC BY
11Вчеш записки Тавршського нацiонального унiверситету iM. В.1. Вернадського Серiя «Бюлопя, xiMia». Том 26 (65). 2013. № 4. С. 22-29.
УДК 616.33-022.44-085+615.331
ДОСЛ1ДЖЕННЯ АНТИСЕКРЕТОРНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ МУЛЬТИШТАМНОГО ПРОБ1ОТИКА ЗА УМОВ ДМ СТРЕСУ
BipueHKO О.В., Фалалеева Т.М., Берегова Т.В., Янковський Д.С.
Кшвський нащональний ушверситет ¡мет Тараса Шевченка, Кшв, Украгна
E-mail: ovirchenko@gmail. com
Отримаш результати свщчать, що за одразу июля дй 3-годинного водно-iммобiлiзацiйного стресу зростала базальна та стимульована пстамшом (3 мг/кг, внутрiшньоочеревино) кисла шлункова секрещя. В наступнi 3 доби секрещя пдрохлоридно! кислоти поступово вiдновлювалася до рiвня iнтактних щурiв. Встановлено, що введення мультиштамного пробiотика (1,4*1010 КУО/кг, перорально) зменшувало базальну та стимульовану секрещю пдрохлоридно! кислоти до показниюв iнтактних щурiв. Антисекреторнi властивостi пробютиюв, пiдтвердженi даними дослiдження, е одним з механiзмiв стрес-протективно! дп пробютичних штамiв та !х профiлактично-лiкувального впливу на стрес-шдуковаш ерозивно-виразковi ураження в шлунку.
Ключов1 слова: стрес, кисла шлункова секрещя, мультиштамний пробютик, ерозивно-виразковi ураження.
ВСТУП
Сьогодш в науковому свт питания пошуку нетоксичних гастропротекторних засоб1в природного походження е актуальним, враховуючи великий вщсоток рецидив1в виразки шлунка у хворих, для яких застосовували класичну схему лшування дано! патологи, а також нечутливосп окремих пащенпв до антисекреторних препарапв [1]. Незалежними лаборатор1ями отримаш даш щодо профшактичного та лшувального впливу пробютичних штам1в на виразкоутворення в шлунку на моделях щур1в [2-7]. Проте погляди на мехашзми тако! дп залишаються иеодиозиачиими. Окрем1 дослщження показали, що бактерп, особливо роду Lactobacillus, швидко колошзують слизову оболонку шлунка (СОШ) шсля утворення виразки [3, 8]. Було виявлено, що пробютичш штами зменшують апоптоз кттин по вщношенню до прол1ферацп i стимулюють ангюгенез в стшщ шлунка [3]. Dharmani та ствавт. (2013) засвщчили ефектившсть пробютично! сумш1 8 штам1в VSL#3 у лшуванш виразки СОШ та тдтвердили даш про стимулящю ангюгенезу в СОШ за умов виразкоутворення [5].
В наших попередшх дослщженнях був встановлений лшувальний ефект мультиштамного пробютика (МП) «Симб1тер® ацидофшьний концентрований» на виразкоутворення в СОШ, викликане стресом [9]. Вщомо, що за умов стресу зростае секрещя пдрохлоридно! кислоти в шлунку, яка е агресивним уражуючим фактором по вщношенню до СОШ [10]. В роботах, присвячених ефектам пробютиюв на ураження в шлунку, не було придшено уваги вивченню антисекреторних
властивостей пробiотичних штамiв. Тому метою дано! роботи було з'ясувати, вплив МП на кислотний фактор виразкоутворення у щурiв за умов ди стресу.
МАТЕР1АЛИ I МЕТОДИ
Схема експерименту
Дослщження проведет на 48 щурах-самцях з дотриманням нормативiв Конвенцп з бiоетики Ради Свропи 1997 року, Свропейсько! конвенци про захист хребетних тварин, яю використовуються для експериментальних та шших наукових цiлей, загальних етичних принцишв експериментiв на тваринах, ухвалених Першим нацюнальним конгресом Укра!ни з бюетики (вересень 2001 року), iнших мiжнародних угод та нацiонального законодавства у цш галузi. Тварин утримували в умовах акредитованого вiварiю згiдно зi «Стандартними правилами по упорядкуванню, устаткуванню та утриманню експериментальних бiологiчних ктшк ^варпв)». Прилади, що використовувалися для наукових дослщжень, пiдлягали метрологiчному контролю.
Тварини були подшеш на 8 груп по 6 щурiв у кожнш (табл.1).
Таблиця1
Роздшення щурiв на дослiднi групи
№ груп и Кшьнасть лжувальних введень Речовина, яку вводили Тривалкть (год) мiж нанесенням стресу i вимiрюванням кислот шлунковот секрецп
1 — — iнтактнi щури (не шддавалися стресу)
2 — — стрес-контроль (дослiджували кислу шлункову секрецiю одразу пiсля стресу)
3 2 вода 24
4 2 мультиштамний пробютик 24
5 4 вода 48
6 4 мультиштамний пробютик 48
7 6 вода 72
8 6 мультиштамний пробютик 72
Щури були пiдданi ди 3-годинного водно^ммобшзацшного стресу (В1С) за Takagi та ствавт., 1964 [11] i 1976 [12]. За добу до початку дослщу щурiв не годували, але вони мали вiльний доступ до води. Для iммобiлiзащl щурiв помщали в металевi перфорованi камери, яю опускали вертикально у воду на 3 години так, щоб рiвень води досягав яремно! ямки щура. Температура води становила 22-23°С.
Пюля стресу тваринам 3-8 груп вводили воду або водний розчин МП перорально (per os) двiчi на добу в об'eмi 0,5 мл/200г. Введення починали через 1 годину тсля закiнчення 3-годинного В1С. МП вводили у дозi 140 мг/кг (1,4*1010
КУО/кг). В якостД мультикомпонентного пробютика був використаний «СимбДтер® ацидофшьний концентрований», у складi якого 14 пробютичних штамiв родiв
Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium, Propionibacterium, як знаходяться в мутуалютичнш взаемодп.
Дослiдження кислоТ шлунковот секрецп.
У тварин всДх груп вимiрювали кислу шлункову секрещю методом перфузи iзольованого шлунку за Гхошем та Шiльдом [13, 14]. Щурiв наркотизували уретаном [15] дозою 1,15 г/кг маси внутрДшньоочеревино (в/о). Виконували трахеотомДю, пiсля чого робили лапаротомДю по серединнiй тип очеревини. З черевно! порожнини дiставали шлунок, знаходили дванадцятипалу кишку та нижче пшоричного сфiнктера пiдводили лiгатуру. ПотДм через стравохiд вводили в шлунок ввДдний катетер, по якому подаеться перфузшний розчин ( NaCl, 0,9%, t=37C ), фiксували його на рiвнi розрiзу трахе!. Робили розрiз на дванадцятипалiй кишцi, через який в шлунок вводився ще один катетер - вивДдний. Його фДксували трохи нижче пiлоричного сфiнктера i вище розрiзу дванадцятипало! кишки. ВвДдний катетер приеднували до перистальтичного насосу НП-1, за допомогою якого перфузшний розчин подавався в шлунок з постшною швидюстю (17 мл за 10 хвилин). ВивДдний катетер приеднувався до колектора фракцш, за допомогою якого автоматично збиралися 10-хвилиннi проби перфузату впродовж всього дослiду. Впродовж 120 хв збирали проби для визначення базально! секреци, пiсля чого вводили пстамш у дозД 3 мг/кг (в/о) та продовжували вДдбирати 10-ти хвилинш фракцп перфузату, ще впродовж 120 хв.
Визначали рДвень базально! i стимульовано! секреци кислоти методом титрування пдроксидом натрДю за допомогою рН-метра. Прилад вмикали в електромережу за 30 хвилин до початку вимДрювань. МДкробюретку заповнювали титрувальним розчином. Для визначення кислотносп шлункового соку був використаний 0,01н NaOH. Титрування проводили наступним чином. В титрувальний стакан наливали отриманий в 10-хвилиннш пробД перфузат. Стакан шсля внесення в нього магшту ставили на електромагштну мДшалку, включали мДшалку, i в стакан обережно опускали електроди для рН-метри, повшстю занурюючи !х активну частину у воду. Реестрували рН дослДджуваного розчину. ПДсля чого його титрували лугом до рН 7,0. Визначали об'ем лугу, що витратився на титрування об'ему шлункового соку, внесеного в стакан, шсля чого розраховували дебгг кислоти в мДкромолях в шлунковому сощ, видшеному за 10 хвилин. Просумувавши дебДти кислоти в кожнш 10-хвилиннш пробД, вимДрювали кшьюсть кислоти, що видшилася шлунком впродовж дослДду.
Статистична обробка результа^в
Статистична обробка даних здшснювалася у пакет програм "Statistica 8.0". Для аналДзу виду розподшу даних був використаний W критерш Шашро-Ушка. Оскшьки отримаш даш були розподшеш за нормальним законом, то були використаш параметричш методи порДвняння вибДрок. Застосований критерш Левана, для оцшки рДвност дисперсш, i t-критерш Стьюдента для незалежних
вибiрок. Розраховували середне значення (М) i стандартну похибку середнього (т) Значущими вважали вщмшносп при р<0,05 [16].
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Встановлено, що у штактних щурiв дебiт кислоти становив 27,8±5,5 мкмоль/120 хв. Отриманi результати узгоджуються з даними iнших дослiдникiв [17]. У групах щурiв, яких було тддано ди 3-годинного холодового В1С було виявлено зростання базально! шлунково! секрещ! кислоти. Найбiльш значуще збшьшення дебiту пдрохлоридно! кислоти спостерiгалося одразу шсля нанесення стресу. В груш тварин секрещю, у яких дослщжували одразу пiсля ди стресу (стрес-контроль), дебiт становив 82,5±11,9 мкмоль/120 хв, тобто спостер^алося зростання кисло! секрещ! в шлунку на 197% (р<0,001) за умов ди стресу (рис. 1). Стимулюючий вплив стресу на секрещю пдрохлоридно! кислоти показаний i в iнших дослiдженнях [10]. Мехашзмом даного ефекту е посилення тошчно! активностi блукаючого нерва за умов нервово-м'язового напруження, викликаного стресовим чинником [18].
120
1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 1. Базальна секрещя пдрохлоридно! кислоти в шлунку щурiв шсля нанесення водночммобшзацшного стресу та за умов лшувального введення мультиштамного пробiотика (п=6 в кожнiй групi): 1 - штактний контроль; 2 - стрес-контроль; 3, 5, 7 - через 24, 48, 72 години шсля стресу у щурiв, яким вводили воду; 4, 6, 8 -через 24, 48, 72 години шсля стресу у щурiв, яким вводили мультиштамний пробютик. *, *** - р<0,05, р<0,001, порiвняно з штактним контролем, # - р<0,05, порiвняно з вiдповiдною групою щурiв, яким вводили воду.
Вже через 24 години шсля В1С секрещя пдрохлоридно! кислоти зменшувалася на 46,1% (р<0,001) порiвняно зi стрес-контролем. Через 48 та 72 години шсля стресу - на 47% (р<0,001) i 52,3% (р<0,001) вiдповiдно. При цьому дебгг гiдрохлоридно!
кислоти у групах щурiв, яким вводили воду шсля стресу, через 24 та 48 годин залишався вищим на 60% (р<0,05) та 57,3% (р<0,05) порiвняно з групою iнтактних тварин. Через 72 години шсля В1С секрещя пдрохлоридно! кислоти у щурiв, що отримували воду, значущо не вiдрiзнялася вiд рiвня iнтактного контролю, хоча тест Левена показав вщмшшсть дисперсш у даних груп тварин, що свщчить про пiдвищену секрецiю кислоти у окремих тварин порiвняно з контролем.
У тварин, яким вводили МП, секрещя кислоти була значущо меншою через 24, 48 та 72 години шсля В1С порiвняно з групою стрес-контролю на 57,5% (р<0,001), 61,1% (р<0,001) i 62,1% (р<0,001) вiдповiдно. Встановлено, що якщо при введеннi води у першi 2 доби пiсля нанесення стресу, кисла шлункова секрецiя була бшьшою порiвняно з iнтактним контролем, то введения МП вщновлювало секрецiю кислоти до рiвня iнтактного контролю. Значущi вiдмiнностi мiж групами, яким вводили воду i МП, були виявлеш на 2 добу пiсля нанесення стресу. Рiвень базально! секреци кислоти у груш щурiв, яким вводили МП, був нижчим на 26,8% (р<0,05), нiж у тварин, яким вводили воду (рис. 1).
При введенш гiстамiну секрецiя пдрохлоридно! кислоти у штактних щурiв значущо зростала в 1,92 рази (р<0,001) порiвияно з базальним рiвнем i складала 51,4±9 мкмоль/120 хв (рис. 2).
Рис. 2. Стимульована пстамшом (3 мг/кг, в.о.) секрещя пдрохлоридно! кислоти в шлунку щурiв пiсля нанесення водночммобшзацшного стресу та за умов лшувального введення мультиштамного пробiотика (п=6 в кожнш групi): 1 -штактний контроль; 2 - стрес-контроль; 3, 5, 7 - через 24, 48, 72 години шсля стресу у щурiв, яким вводили воду; 4, 6, 8 -через 24, 48, 72 години шсля стресу у щурiв, яким вводили мультиштамний пробютик. *, *** - р<0,05, р<0,001, порiвняно з штактним контролем, # - р<0,05, порiвияно з вщповщною групою щурiв, яким вводили воду.
Стимульована секрецiя гiдрохлоридноï кислоти одразу пiсля нанесення стресу складала 146,2±25,9 мкмоль/120 хв, що перевищувало показники iнтактного контролю в 2,86 рази (p<0,001) (рис. 2).
Через 24, 48 та 72 години шсля В1С в групах щурiв, яким вводили воду, стимульована секрещя гiдрохлоридноï кислоти була меншою, шж у групi стрес-контролю на 38,5% (p<0,05), 42,7% (p<0,001), 49,6% (p<0,001) (рис. 2).
При введенш МП стимульована секрецiя гiдрохлоридноï кислоти через 1, 2 та 3 доби шсля стресу не вiдрiзнялася вщ рiвня iнтактного контролю, хоча тест Левена показав вщмшшсть дисперсш в iнтактному контролi та у тварин через 24 години шсля В1С, що свщчить про шдвищену секрецiю кислоти у окремих тварин порiвняно з контролем. Значущi вiдмiнностi мiж групами, яким вводили воду i МП, були виявлеш на 2 добу пiсля нанесення стресу. Рiвень стимульованоï секрецiï кислоти у груш щурiв, яким вводили МП, був нижчим на 34,1% (p<0,05), нiж у тварин, яким вводили воду (рис. 2).
Таким чином, отримаш результати свщчать про вщновлення секреци кислоти до показниюв контролю при введеннi МП, що шдтверджуе антисекреторний вплив пробiотичних штамiв за умов стресу. Подiбнi результати були отримаш Бобровою та сшвавт. (2012), якi встановили нормалiзуючий вплив пробютика «Бюгайя» на кислотоутворюючу функщю у дiтей з хронiчним гастродуодештом [19]. Одним з механiзмiв впливу МП може бути утворення коротколанцюгових жирних кислот, якi е фiзiологiчно активними речовинами. Данi лiтератури свщчать, що вони пiсля всмоктування в кров знижують тонiчну активнiсть блукаючих нервiв, внаслiдок чого знижуеться секрещя кислоти у шлунку. Це створюе сприятливi умови для гоення ерозивно-виразкових уражень слизово1' оболонки шлунка [20].
ВИСНОВКИ
1. МП знижував базальну та стимульовану гiстамiном секрещю пдрохлоридно!' кислоти шсля стресу до рiвня штактних щурiв.
2. Антисекреторш властивостi МП е одним з механiзмiв його лiкувального ефекту на виразкоутворення в слизовiй оболонцi шлунка, викликане стресом.
Список лггератури
1. Arakawa T.. Quality of ulcer healing in gastrointestinal tract: its pathophysiology and clinical relevance / T. Arakawa, T. Watanabe, T. Tanigawa [et al.] // World J Gastroenterol. - 2012- Vol.18, № 35. -P.4811-4822.
2. Konturek P. C. Probiotic bacteria Escherichia coli strain Nissle 1917 attenuates acute gastric lesions induced by stress / P. C. Konturek, Z. Sliwowski, J. Koziel [et al.] // J Physiol Pharmacol. - 2009. -Vol.60 Suppl 6, № - P.41-48.
3. Lam E. K. Probiotic Lactobacillus rhamnosus GG enhances gastric ulcer healing in rats / E. K. Lam, L. Yu, H. P. Wong [et al.] // Eur J Pharmacol. - 2007. - Vol.565, № 1-3. - P.171-179.
4. Senol A. Effect of probiotics on aspirin-induced gastric mucosal lesions / A. Senol, M. Isler, A. G. Karahan [et al.] // Turk J Gastroenterol. - 2011. - Vol.22, № 1. - P.18-26.
5. Dharmani P. The probiotic mixture VSL#3 accelerates gastric ulcer healing by stimulating vascular endothelial growth factor / P. Dharmani, C. De Simone, K. Chadee // PLoS One. - 2013. - Vol.8, № 3. -P.e58671.
6. Singh P. K. Entrapment of Lactobacillus acidophilus into alginate beads for the effective treatment of cold restraint stress induced gastric ulcer / P. K. Singh, P. K. Deol, I. P. Kaur // Food Funct. - 2011. -Vol.3, № 1. - P.83-90.
7. Singh P. K. Synbiotic (probiotic and ginger extract) loaded floating beads: a novel therapeutic option in an experimental paradigm of gastric ulcer / P. K. Singh, I. P. Kaur // J Pharm Pharmacol. - 2012. -Vol.64, № 2. - P.207-217.
8. Elliott S. N. Bacteria rapidly colonize and modulate healing of gastric ulcers in rats / S. N. Elliott, A. Buret, W. McKnight [et al.] // Am J Physiol. - 1998. - Vol.275, № 3 Pt 1. - P.G425-432.
9. Bip4eHKO О.В. Дослщження лжувально-профшактичного впливу мультипробютика «Симбтер» при розвитку гострих уражень в слизовш оболонщ шлунка щурiв / О. В. Bip4eHKO, Т. В. Берегова, О. I. Цирюк // Вюник проблем бюлогп i медицини. - 2010. - № 1. - С.41-46
10. Li Y.M. Dynamic functional and ultrastructural changes of gastric parietal cells induced by water immersion-restraint stress in rats / Y. M. Li, G. M. Lu, X. P. Zou [et al.] // World J Gastroenterol. - 2006.
- Vol.12, № 21. - P.3368-3372.
11. Takagi K. Studies on the Drugs for Peptic Ulcer. A Reliable Method for Producing Stress Ulcer in Rats / K. Takagi, Y. Kasuya, K. Watanabe // Chem Pharm Bull (Tokyo). - 1964. - Vol. 12, № - P.465-472.
12. Takeuchi K. A new model of stress ulcer in the rat with pylorus ligation and its pathogenesis / K. Takeuchi, S. Okabe, K. Takagi // Am J Dig Dis. - 1976. - Vol.21, № 9. - P.782-788.
13. Ghosh M.N. Continuous recording of acid gastric secretion in the rat / M. N. Ghosh, H. O. Schild // Br J Pharmacol Chemother. - 1958. - Vol.13, № 1. - P.54-61.
14. Goel R.K. Effect of graded doses of methysergide on basal and pentagastrin stimulated gastric secretion in anaesthetised rats / R. K. Goel, R. N. Maiti, S. K. Bhattacharya // Indian J Exp Biol. - 1996. - Vol.34, № 2. - P.115-117.
15. Maggi C.A. Suitability of urethane anesthesia for physiopharmacological investigations in various systems. Part 1: General considerations / C. A. Maggi, A. Meli // Experientia. - 1986. - Vol.42, № 2. -P.109-114.
16. Реброва Ю.О. Статистический анализ медицинских данных / Ю. О. Реброва // - МедиаСфера, 2012
- 312 с.
17. John T.A. Effect of the aqueous extract of entandrophragma utile bark on gastric acid secretion in ghosh and schild rat preparations / T. A. John, A. O. Onabanjo // Niger Postgrad Med J. - 2011 - Vol.18, № 2. -P.111-117.
18. Xie Y. F. Role of parasympathetic overactivity in water immersion stress-induced gastric mucosal lesion in rat / Y. F. Xie, Q. Jiao, S. Guo [et al.] // J Appl Physiol (1985). - 2005. - Vol.99, № 6. - P.2416-2422.
19. Боброва B.I. Антисекреторш та пробютичш паралелi при лжуванш дтей з хрошчним гастродуодештом / В. I. Боброва, С. С. Воронша, Т. В. Рубан [та ш.] // Перинатолопя та педiатрiя -2010. - Vol.41, № 1. - P.148-151.
20. Берегова Т.В. Значення коротколанцюгових жирних кислот i лактату в регуляцп шлунково! секрецп / Т.В. Берегова, Т.М. Фалалеева // Фiзiологiчний журнал. - 2006. - Т.52, № 3. - С.41-50.
Вирченко А. В. Исследование антисекреторных свойств мультиштамного пробиотика / А.В. Вирченко, Т.М. Фалалеева, Т.В. Береговая, Д. С. Янковский // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». - 2013. - Т. 26 (65), № 4. - С.22-29.
Полученные результаты свидетельствуют, что за сразу после действия 3-часового водно-иммобилизационного стресса увеличивалась базальная и стимулированная гистамином (3 мг/кг, внутрибрюшинно) кислая желудочная секреция . В последующие 3 суток секреция гидрохлоридной кислоты постепенно восстанавливалась до уровня интактных крыс. Установлено, что введение мультиштамного пробиотика (1,4*1010 КОЕ/кг, перорально) уменьшало базальную и стимулированную секрецию гидрохлоридной кислоты к показателям интактных крыс. Антисекреторные свойства пробиотиков, подтвержденные данными исследования, являются одним из механизмов стресс-протективного действия пробиотических штаммов и их профилактического и лечебного воздействия на стресс-индуцированные эрозивно-язвенные поражения в желудке.
Ключевые слова: стресс, кислая желудочная секреция, мультиштамный пробиотик, эрозивно-язвенные поражения.
STUDY OF ANTISECRETORY PROPERTIES OF MULTISTRAIN PROBIOTIC
UNDER INFLUENCE OF STRESS
Virchenko O. V., Falalyeyeva T.M., Beregova T. V., Yankovsky D.S.
Taras Shevchenko' Kyiv National University, Kiev, Ukraine E-mail: ovirchenko@gmail com
The search of natural non-toxic medicines with gastoprotective action is of a great importance. There are a few studies that confirm preventive and therapeutic action of probiotics on gastric lesions induced by various factors. However, the probiotics effects on gastric acid secretion (GAS) in ulcerative state were not examined. In our previous work we established therapeutic influence of multistrain probiotic, which consists of 14 strains of genera Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium, Propionibacterium, on gastric lesions induced by waterimmersion restraint stress (WIRS). So the aim of this study was to investigate antisecretory properties of multistrain probiotic under codition of stress action.
Rats were divided into 8 groups 6 animals in each. 1st group - intact rats, others were subjected to WIRS. GAS was studied immediately and in 3 consecutive days after stress. The treatment with probiotic or water was performed during 1, 2 or 3 days after WIRS. Probiotic was administered at a dose 1.4 * 1010 CFU / kg, orally, dissolved in water in a volume 0,5 ml/200g. GAS was studied by the method of Ghosh and Shild.
Results of the research indicated that basal and stimulated by histamine (3 mg / kg, intraperitoneally) GAS increased immediately after the 3-hour WIRS. For the next 3 days the GAS is gradually restored. The introduction of multistrain probiotic reduced basal and stimulated GIS to the level of intact rats. Antisecretory properties of probiotics proved by this study are one of the mechanisms of stress-protective action of probiotic strains and their preventive and therapeutic effects on stress-induced erosive and ulcerative lesions of the stomach.
Keywords: stress , gastric acid secretion, multistrain probiotic, erosive and ulcerative lesions.
nocmynuna epedaKU,uw 27.11.2013 г.
