CC BY
13УДК 636.082.003+639.371.134
М. Е. Михайлова1, Р. И. Шейко1, А. И. Киреева1, Е. Л. Романишко1, Н. А. Камыш1, Н. И. Тиханович1, О. А. Беляк1, А. Н. Баяхов2
ДНК-СКРИНИНГ РЕЦЕССИВНЫХ МУТАЦИЙ, ОБУСЛАВЛИВАЮЩИХ РАЗВИТИЕ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ДЕФЕКТОВ (BLAD- И CVM-СИНДРОМОВ) В ПОПУЛЯЦИИ КРС В БЕЛАРУСИ
1Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: M.Mikhailova@igc.by ^Казахстанский университет инновационных и телекоммуникационных систем Казахстан, L02E6P1, г. Уральск, ул. М. Маметовой, 81
Проведен анализ генетической структуры популяций голштинской и черно-пестрой (голштинизированной) пород крупного рогатого скота в Беларуси по локусам генов CD18 и SLC35A3. Частоты встречаемости мутант-ных аллелей BL гена CD18, обуславливающего развитие BLAD-синдрома и CV-аллеля гена SLC35A3 (CVM-синдром) в белорусской популяции КРС, составляет 0,004 и 0,015 соответственно. Проведение ДНК-скрининга наследственных дефектов в популяции КРС и выведение из селекционного процесса скрытых носителей мутаций позволило снизить встречаемость гетерозиготных генотипов по генам CD18 и SLC35A3 с 1,73% (2015 г.) до 0,53% (2018 г.) и с 4,45% (2015 г.) до 1,56% (2017 г.) соответственно.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, наследственные дефекты, мутации, BLAD-синдром, CVM-синдром.
Введение
В ХХ столетии интенсивное использование в мире генофонда голштинской породы крупного рогатого скота (КРС) и биотехнологий репродукции (искусственное осеменение, трансплантация эмбрионов) позволило значительно повысить генетический потенциал молочной продуктивности за счет получения потомства производителей — лидеров породы. Вместе с тем в поголовье все чаще проявляются признаки генетической «эрозии» — накопления груза вредных рецессивных мутаций. При этом снижаются воспроизводительная способность и плодовитость, жизнеспособность новорожденных и молодняка, резистентность к инфекциям и продолжительность хозяйственного использования животных, что отрицательно сказывается на рентабельности производства. У крупного рогатого скота выявлено свыше 400 генетически обусловленных морфологических и функциональных нарушений жизнедеятельности организма [1]. Одним из таких генетических дефектов, наследуемых по ауто-сомно-рецессивному типу, т.е. проявляющихся только у животных, гомозиготных по соответствующему гену и не имеющих клинических
проявлений у гетерозигот, является дефицит адгезии лейкоцитов (BLAD-синдром), введенный в генофонд черно-пестрого скота в виде рецессивной мутации в гене CD18. Мутация впервые была обнаружена у быков голштинской породы, которых широко использовали для улучшения генетического потенциала других популяций КРС.
Первые случаи дисфункции лейкоцитов были зарегистрированы еще в 1983 г. у коров голштинской породы. В 1987 г. в Японии сообщили о нескольких аналогичных случаях проявления у телят подобных клинических симптомов, которые сопровождались постоянными или рецидивирующими инфекциями, связанными с устойчивой нейтрофилией. В 1990 г. у телят с гранулоцитопатическим синдромом обнаружили недостаточную экспрессию молекулы ß 2-интегрина на поверхности лейкоцитов и назвали данное заболевание дефицитом адгезии лейкоцитов (BLAD) у крупного рогатого скота, по аналогии с лейкоцитарной адгезией человека (LAD) [2].
Семейство интегринов включает следующие факторы, известные в международной классификации как CD11/CD18: LFA-1, Mac-
1 и р150,95. Все три семейства белков являются гетеродимерами, каждый состоит из а-субъединиц [СО11а, CD11b и CD11c] и общей В-субъединицы [CD18]. У КРС синдром связан с дефицитом Мас-1 гликопротеина [CD11b/CD18] лейкоцитов крови [3].
Клинически BLAD проявляется также в подавлении клеточного иммунитета, при котором нарушается процесс диапедеза, т. е. блокируется способность лейкоцитов проникать через кровеносные капилляры и двигаться с кровотоком к очагу инфекции. Эти нарушения способствуют развитию иммунодефицитного состояния животного. Животные с гетерозиготным генотипом (П/В1) не имеют фенотипических проявлений заболевания, но являются скрытыми носителями мутации. У особей, гомозиготных по рецессивному аллелю, резко снижается устойчивость к бактериальным и вирусным инфекциям, замедляется рост. У пораженных животных отмечаются тяжелые язвы на слизистых оболочках ротовой полости, гингивит, потеря зубов, рецидивирующая диарея, хроническая пневмония. Биохимические показатели крови указывают на постоянную нейтрофилию. Большинство телят погибает в возрасте 3-7 месяцев, не достигнув половозрелого возраста [2].
Молекулярной основой BLAD является точковая мутация в кодирующей части гена CD18, имеющая аутосомно-рецессивный характер наследования. Замена (аденин-гуанин) в положении 383 кДНК приводит к аминокислотной замене в молекуле белка (Азр^^1у), в результате чего нарушается взаимодействие В-субъединицы с а-субъединицами. Лейкоциты больного животного на своей поверхности содержат очень низкое количество Р-интегрина, менее 2% от 160 кО белка здорового животного. Нарушается экспрессия Р-интегрина — поверхностного белка нейтро-филов, которая приводит к дефициту адгезии фагоцитов, что вызывает в свою очередь резкое снижение функциональной активности фагоцитоза, невозможность выхода лейкоцитов за пределы кровеносного сосуда [4]. Лейкоциты теряют свою активность и способность выполнять защитную фагоцитарную функцию. В итоге возникает иммунодефицитное состояние, что и приводит к гибели.
В октябре 2000 г. датские исследователи объявили международному сообществу голштин-
ского скота об открытии нового летального генетического дефекта, который они назвали Complex Vertebral Malformation (CVM) — комплексный порок позвоночника [5].
У гомозиготных по мутантному CV-аллелю телят проявляется общая недоразвитость. У них наблюдаются аномалии развития позвоночного столба: укороченная шея, сколиоз, кифоз, сросшиеся и деформированные позвонки, расщепление позвоночника надвое. В целом количество пораженных позвонков колеблется от 2 до 18. Причем к поражениям шейного и грудного отделов часто присоединяется ар-трогрипоз. Встречаются пороки ребер, которые зачастую слиты между собой проксимальными и иногда средними частями, при этом дисталь-ные части свободны. Трубчатые кости конечностей удлинены и истончены, встречается деформация суставов (контрактуры) [5]. Большинство (до 77 %) плодов-носителей резор-бируются или погибают до 260-х суток стельности, при этом абортируемость плода может происходить на любых сроках (менее, чем 1 на 100 тыс. отелов). В некоторых случаях, плод донашивается, однако стельность заканчивается мертворождением обычно на 1-2 недели раньше ожидаемого срока. Лишь небольшая доля гомозиготных по CV/CV телят рождаются живыми, однако и они вскоре погибают [6].
Молекулярной основой наследственного заболевания комплексного порока позвоночника CVM является точечная миссенс-мутация G^T в позиции 599 в локусе гена SLC35A3. Ген SLC35A3 (58582 п. н.) кодирует белок UDPN — acetyl glucosamine transporter (уридин-5>-дифосфат-Ы-ацетил-глюкозамина транспортный белок), который относится к семейству растворимых ферментов переносчиков (solute carrier family 35, member A3 (SLC35A3), транспортирующих нуклеотид связанные сахара из цитозоля в эндоплазма-тический ретикулум или полости комплекса Гольджи. Мутация приводит к аминокислотной замене VaWPhe в пептиде UDPN в позиции 180 (V180F), что нарушает его транспортную функцию. Белок UDPN играет важную роль в процессах, контролирующих образование позвонков из несегментированной параксиальной мезодермы. Следовательно, дефектная молекула белка-транспортера приводит к порокам развития позвоночника [6-8].
Материалы и методы
ДНК выделяли из цельной крови, ушных выщипов и криоконсервированной спермы в пайетах. Выделение и очистку ДНК из образцов биологического материала животных проводили с помощью набора реагентов «Нукле-осорб» («Праймтех», Республика Беларусь). Для выявления в мультиплексе мутаций в ло-кусах генов CD18 и SLC35A3 методом ПЦР-РВ использовали набор реагентов для определения комплексной аномалии позвоночника (CVM) и дефицита лейкоцитарной адгезии (BLAD) у крупного рогатого скота («Синтол», Россия), состоящий из реакционной смеси, разбавителя, Taq ДНК-полимеразы, положительных контрольных образцов (ПКО 1, ПКО 2, ПКО 3) и отрицательного контрольного образца (ОКО). При тестировании образцов ДНК использовались флуорофоры FAM, HEX (для выявления нормальных и мутантных аллелей CVM) и ROX, Cy 5 (для выявления нормальных и мутантных аллелей BLAD). Методика проведения ПЦР-РВ представлена в методических рекомендациях [9].
Результаты и обсуждение
Анализ частоты гетерозиготных генотипов - скрытых носителей генетических дефектов, приводящих к развитию BLAD- и CVM-синдромов, проводиться во многих странах мира, занимающихся разведением голштин-ского скота. Мутантный аллель BL локуса гена CD18 выявлен в 27 стран мира. В США в 1992 г. носителями мутации BLAD являлись 15,6% быков и 6% маточного поголовья, а экономический ущерб был оценен в 5 млн долларов [3]. Эта мутация диагностирована в шести республиках бывшего СССР, в трех республиках СНГ (Россия, Беларусь и Украина), а также в странах Балтии (Эстония, Латвия, Литва), однако не установлен в Казахстане и Молдове [10].
Частота встречаемости мутантного аллеля BL до 2000 г. составляла от 0,31% (Япония) до 6,4% (Германия) (табл. 1).
На современном этапе в мировом поголовье частота мутантного BL-аллеля диагностируется в пределах 0,22-4% [12].
Генетический тест для выявления скрытых носителей CVM разработан датскими учеными в 2002 году. Систематизация данных по
голштинскому скоту позволила определить процент гетерозиготных скрытых носителей мутации локуса гена SLC35A3 среди быков-производителей в разных странах. По данным Шайдуллина Р. (2015), среди исследованных быков, семенной материал которых применялся в искусственном осеменении поголовья КРС, разводимого в Чехии, Венгрии, Австралии и Великобритании, носителей этой мутации найдено не было. Однако скрытые носители данной мутации выявлены в следующих странах: США — 20,07%, Канада — 6,42%, Голландия — 8,8%, Франция — 42,85%, Германия — 7,15%, Италия — 15,4%. Таким образом, в среднем 19,5% быков голштинской породы оказались скрытыми носителями мутаций, обуславливающих CVM-синдром крупного рогатого скота [10, 11].
Нами проведен мониторинг частоты мутантных аллелей и генотипов генов SLC35A3 и СD18 в популяции голштинского и черно-пестрого (голштинизированного) КРС, разводимого в Беларуси, за период 2015-2019 гг. Установлено, что самое большое количество выявленных мутантных генотипов гена SLC35A3 зафиксировано в 2015 г. — 4,45%, а в 2017 г. выявлен только 1,56% гетерозигот (табл. 2).
Таблица 1
Частота встречаемости мутантного аллеля BL локуса гена СD18 в поголовье КРС голштинской породы [11]
Страна Частота мутантного аллеля BL, %
Аргентина 2,88
Бразилия 2,80
Япония 0,31
Китай 0,49
Иран 3,30
Турция 4,00
Индия 1,59
Польша 5,00
Франция 6,00
Германия 6,40
Чехия 4,00
Россия 5,66
Украина 3,20
В Беларуси ДНК-диагностика носителей мутации BLAD проводиться с 2008 г. По нашим данным в 2008 г. частота мутантных генотипов гена CD18 составляла 3,76% [13]. В 2015 г. процент мутантных генотипов составил 1,73%, а в 2018 году — 0,53% (табл. 2).
В среднем, за годы мониторинга (20152019 гг.) в популяции КРС диагностируется 2,53% животных - скрытых носителей мутации гена SLC35A3 (CVC) и 0,56% мутантных генотипов гена СD18 (BLC) (табл. 2).
Анализ генетической структуры проанализированной выборки (3108 голов) из популяции голштинского (голштинизированного) КРС в Беларуси показал, что частота мутант-ного аллеля СV локуса гена SLC35A3 составляет 0,015. Частота мутантного аллеля BL локуса гена СD18 — 0,004 (табл. 3).
Известно, что бык американской селекции № USA000001667366 Carlin-M Ivanhoe BELL 1974 года рождения является родоначальником мутации гена CD18 [14]. Нами проведен анализ родословных животных - скрытых носителей мутаций генов CD18 и SLC35A3, выявленных в Беларуси.
Прослежена генеалогия животных, которые диагностированы как скрытые носители мутации Bl (BLC) гена CD18: $АЛЕСЯ № 678-880, $10940, 51429060, $1136, $9367, $9459, $1335, $11023, ^51429057, $11437, $11023, $19046, $11036 и др. Ветви генеалогического древа этих животных ведут к основателю мутации Bl в белорусском поголовье — быку O. Гуапхое 1189870 (ветвь Осборндэйл Иван-хое 1189870, линия Chieftain: 95679). Этот же бык показан как предок основателя второй
Таблица 2
Мониторинг частоты мутантных генотипов и аллелей локуса гена SLC35A3 и локуса гена
СD18 популяции КРС, разводимого в Беларуси
Год Количество проанализированных животных, n Носители мутации гена SLC35A3 (CVC), n Соотношение выявленных мутантных генотипов по гену SLC35A3 (CVM-синдром), % Носители мутации гена CD18 (BLC), n Соотношение выявленных мутантных генотипов по гену CD18 (BLAD-синдром), %
2015 1101 49 4,45 19 1,73
2016 620 21 3,39 2 0,32
2017 832 13 1,56 2 0,24
2018 376 8 2,13 2 0,53
I полугодие 2019 179 2 1,12 - -
Всего 3108 93 в среднем 2,53% 25 в среднем 0,56%
Таблица 3
Частота генотипов и аллелей генов SLC35A3 (С"УМ-синдром) и СD18 (^АО-синдром) в
выборке из популяции КРС в Беларуси
Ген/синдром Количество проанализированных животных, n Частота генотипов Частота аллелей Х2
n wt/mt mt/mt wt (pwt ± Sp) mt (pmt ± Sp)
SLC35A3/CVM 3108 0,97 0,03 - 0,985 ± 0,003 0,015 ± 0,003 0,72
CD18/BLAD 3108 0,992 0,008 - 0,996 ± 0,001 0,004 ± 0,003 0,05
Примечание. — аллель дикого типа; mt — мутантный аллель; — гомозиготный генотип с аллелями дикого типа, свободный от мутации; wt/mt — геторозиготный генотип, с аллелями дикого и мутантного типа; mt/mt — гомозиготный генотип с мутантными аллелями
; Белл 502528/1667363
(Карлин М. Иванхое Белл (ТЬ/ВЬ)
Рис. Генеологическая схема происхождения мутации в локусе гена CD18 у быка белорусской селекции № 58571 (Милан) от знаменитого американского предка Карлин М. Айвенго Белл
мутации CV в белорусской популяции, что хорошо прослеживается по родословной прародителей особи № 47322, у которой выявлено два наследственных дефекта: CV и BL.
На дендрограмме (рисунок) показана генеалогия ^Милана № 58571, который диагностирован как скрытый носитель мутации Bl (BLC) гена CD18, предком которого является бык Белл 502528/1667363, потомок № USA000001667366 Carlin-M Ivanhoe BELL (линия Карлин М. Айвенго). Распространение мутации CV выявлено в линии Монтвик Чифтейна 95679, ветвь Осбордэйл Иванхое 1189870 (быки № 1070013, № 47322, № 60289, 29106) и в линии Вис Айдиала 933122 ветвь Тайди Бек Элевейшн 1271810 (быки № 60289, Алакатас/100516, № 93506/48742, № 87916/879166, № 10700131).
В линии Рефлекшн Соверинга 198998 ветвь Пони Фарм Арлинда Чифа 1427381 выявлены животные - скрытые носители мутаций BL и CV (№ 34125 (BLC, CVC) и CV (№ 30549 (CVC)).
Заключение
Таким образом, анализ генетической структуры популяций голштинской и черно-пестрой (голштинизированной) пород крупного рогатого скота в Беларуси по локусам генов СD18 и SLC35A3 показал присутствие в поголовье мутаций, обуславливающих развитие наследственных заболеваний. Частоты встречаемости мутантных аллелей BL гена СD18, (BLAD-синдром) и СУ-аллеля гена SLC35A3 (CVM-синдром) в белорусской популяции КРС составляет 0,004 и 0,015 соответственно.
Показаны современные линии и ветви КРС, разводимого в Беларуси, у которых выявлены животные - скрытые носители мутантных аллелей BL гена СD18 и СУ-аллеля гена SLC35A3.
Проведение ДНК-скрининга наследственных дефектов в популяции КРС и выведение из селекционного процесса скрытых носителей мутаций позволило снизить встречаемость гетерозиготных генотипов гена СD18 с 3,76% (2008 г.) до 0,53% (2018 г.) и гена SLC35A3 с 4,45% (2015 г.) до 1,56% (2017 г.).
Мутации генов CD18 и SLC35A3 относятся к гаплотипам фертильности ННВ и ННС, так как помимо физиологических сбоев развития организма они оказывают влияние на степень стельности и/или ассоциированы с эмбриональной и ранней постэмбриональной смертностью на различных стадиях [14].
Таким образом, необходимо контролировать частоту генетических дефектов, проводить ДНК-диагностику мутаций, обуславливающих развитие CVM- и BLAD-синдромов. Элиминация из стада животных — скрытых носителей вредных рецессивных мутаций позволяет внести вклад в совершенствование генофонда белорусских популяций сельскохозяйственных животных, расширяет возможности проведения мониторинга племенных животных в Республике Беларусь с целью оздоровления поголовья.
Список использованных источников
1. Жигачев, А. И. О накоплении груза мутаций в породах крупного рогатого скота при интенсивных технологиях воспроизводства и улучшения по целевым признакам / А. И. Жи-гачев, Л. К. Эрнст, А. С. Богачев // Сельскохозяйственная биология. - 2008. - Т. 6. - C. 25-32.
2. Nagahata, H. Bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) //J. Vet. Med. Sci. -2004. -Vol. 66, № 12. - Р. 1475-1482
3. Kehrli, M. E. Molecular Definition of The Bovine Granulocytopathy Syndrome: Identification of Deficiency of the Mac-1 (CD11b/CD18) Glycoprotein, / M. E. Kehrli [et al.] // Am. J. Vet. Res. - 1990. - Vol. 51. - P. 1826.
4. Nagahata, H. Expression and role of adhesion molecule CD 18 on bovine neutrophils / H. Nagahata [et al.] // Can. J. Vet. Res. -1995. -Vol. 59. - P. 1-5.
5. Agerholm, J. S. Complex vertebral malformation in Holstein calves / J. S. Agerholm [et al] // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 13, 2001. - P. 283-289.
6. Гуськова, С. В. Основные генетические причины эмбриональных потерь в молочном скотоводстве, связанные с интенсивной селекцией по продуктивности / С. В. Гуськова [и др.]. - 2014. - Т. 4. - С. 67-71.
7. Усенбеков, Е. С. Генетическая природа наследственных болезней крупного рогатого скота и молекулярно-генетические методы их диагностики / Е. С. Усенбеков, К. Ж. Жума-нов, В. П. Терлецкий // Генетика и разведение животных. - 2014. - Т. 3. - С. 9.
8. Генетическая природа наследственных болезней крупного рогатого скота и молеку-лярно-генетические методы их диагностики [электронный ресурс] / Ksu.edu.kz: Офиц. сайт Костанайского государственного университета им. А. Байтурсынова. - Режим доступа: http://ksu.edu.kz/files/nauka/bejshova_i. pdf. - Дата доступа: 22.04.2018.
9. Михайлова, М. Е. ДНК-технологии выявления комплексной аномалии позвоночника (CVM) и дефицита лейкоцитарной адгезии (BLAD) у крупного рогатого скота методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в реальном времени: метод. рекомендации / М. Е. Михайлова, А. И. Киреева, Е. В. Белая; Институт генетики и цитологии НАН Беларуси. - Минск: Право и экономика,
2014. - 10 с.
10. Шайдуллин, Р. Р. Характер распространения летальных генов у молочного скота / Р. Р. Шайдуллин, Т. Х. Фаизов, А. С. Ганиев // Ученые записки КГАВМ им. Н. Э. Баумана. -
2015. - Т. 2. - С. 13.
11. Зиновьева, Н. А. Моногенные наследственные дефекты и их роль в воспроизводстве / Зиновьева Н.А. [и др.]. // Животноводство России. - 2015. - № 6. - С. 30-31.
12. Генетические аномалии КРС [электронный ресурс] / Biofile.ru: Интернет портал публикаций статей. - Режим доступа: http://biofile.ru/bio/6963.html. - Дата доступа: 21.04.2018.
13. Михайлова, М. Е. Генетико-популя-ционные аспекты возникновения и распространения врожденных дефектов у крупного рогатого скота в Республике Беларусь // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. трудов. - 2008. - Т. 8. - С. 152-160.
14. Зиновьева, Н. А. Гаплотипы фертильнос-ти голштинского скота // Сельскохозяйственная биология. - 2016. - Т. 51. - C. 423-435.
M. E. Mikhaylova1, R. I. Sheiko1, A. I. Kireyeva1, E. L. Romanishko1, N. A. Kamysh1, N. I. Tikhanovich1,
O. A. Belyak1, A. N. Bayakhov2
DNA-SCREENING OF RECESSIVE MUTATIONS LEADING TO THE DEVELOPMENT OF HEREDITARY DEFECTS (BLAD- AND CVM-SYNDROMES) IN THE POPULATION OF CATTLE IN BELARUS
institute of Genetics and Cytology of NASB Minsk, 220072, the Republic of Belarus ^Kazakhstan University of Innovation and Telecommunication Systems Uralsk, L02E6P1, Kazakhstan
Analysis of the genetic structure of the populations of Holstein and black-motley (Holstein) cattle breeds in Belarus was carried out by the loci of CD18 and SLC35A3 genes. The frequency of occurrence of mutant BL alleles of the CD18 gene, causing the development of the BLAD syndrome and the CV allele of the SLC35A3 gene (CVM syndrome) in the Belarus's cattle population is 0.004 and 0.015, respectively. DNA screening of hereditary defects in the cattle population and elimination of hidden mutation carriers from the breeding process allowed reducing the occurrence of heterozygous genotypes for СD18 and SLC35A3 genes from 1.73% (2015) to 0.53% (2018) and from 4.45% (2015) to 1.56% (2017), respectively.
Key words: cattle, inherited defects, mutations, BLAD syndrome, CVM syndrome.
Дата поступления статьи: 7 августа 2019 г.
