CC BY
197
УДК 636.4.082:612.8:577.113.1
АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПОГОЛОВЬЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО
МОНОГЕННЫМ НАСЛЕДСТВЕННЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ
О. П. КУРАК, А. И. ГАНДЖА, Н. В. ЖУРИНА, М. А. КОВАЛЬЧУК, Л. Л. ЛЕТКЕВИЧ, В. П. СИМОНЕНКО, И. В. КИРИЛЛОВА РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству», г. Жодино, Минская обл., Республика Беларусь, 222163
(Поступила в редакцию 04.01.2015)
Введение. Изучение проблемы скрытого генетического груза у крупного рогатого скота рассматривается в качестве перспективного приема оздоровления генофонда племенного поголовья и повышения сохранности молодняка. При распространении наследственных мутаций наблюдается снижение воспроизводительной способности и плодовитости, жизнеспособности молодняка, продолжительности хозяйственного использования животных, что в конечном итоге оказывает отрицательное влияние на рентабельность отрасли. Все острее становится проблема повышения резистентности животных. В этих условиях возросло значение проблемы контроля скрытых наследственных аномалий, особенно среди быков-производителей на племпредприятиях.
Специфической особенностью наследственных болезней являются изменения в молекуле ДНК. Вполне понятно, что ДНК-диагностика как технология, направленная на обнаружение причины заболевания, является наиболее адекватным, объективным и информативным подходом к диагностике наследственных болезней. Одним из наиболее распространенных классов генетических молекулярных маркеров на уровне ДНК является ПЦР-ПДРФ.
Среди конкретных локусов наиболее интенсивно изучаются локусы количественных признаков и резистентности к заболеваниям. Этому направлению также посвящены долгосрочные проекты многих институтов и лабораторий. В связи с этим широко исследуются гены CD18, UMPS, SLC35A3, точковые мутации в которых ассоциированы с такими заболеваниями, как BLAD, DUMPS и CVM.
Анализ генетической структуры поголовья крупного рогатого скота по моногенным наследственным заболеваниям является актуальной
192
проблемой, решение которой позволит вести целенаправленный контроль за распространением мутаций. Это позволит повысить резистентность племенного поголовья республики и сохранность ремонтного молодняка, исключить завоз быков-носителей генетического груза, обеспечить ввод в племенные стада здоровых животных, корректировать программы племенной работы с голштинской породой. Введение принципа тестирования молодых бычков предотвратит последствия проявления мутаций в возрасте 6-7 лет, необходимых для оценки и квалификации производителей.
Анализ источников. Синдром врожденного иммунодефицита (BLAD) обусловлен точковой мутацией в кодирующей части аутосом-ного гена CD 18 и контролирующего синтез гликопротеина р-интегрина. Повреждение структуры этого белка приводит к множественным дефектам функции лейкоцитов. В гомозиготном рецессивном состоянии является летальным: иммунная система животных не способна противостоять вирусным и бактериальным инфекциям, что приводит к их гибели в раннем возрасте [1-3].
DUMPS (Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase) - моногенное аутосомное рецессивное заболевание, обусловленное нарушением обмена веществ вследствие дефицита фермента уридинмонофосфатси-нтетазы, связанного с воспроизводительной функцией животных и влияет на выживаемость потомства. Вызывает гибель эмбрионов, как правило, после первых 40 дней развития, то есть на стадии имплантации зародыша в матку [4-6].
Синдром сложной деформации позвоночника (CVM) обусловлен действием рецессивной мутации, связанной с геном SLC35A3 (бычьего растворимого переносчика семейства 35). Характерными признаками носителей CVM являются общая недоразвитость, укороченная шея, слившиеся и деформированные позвонки, сколиоз, пороки ребер, деформация суставов передних и задних конечностей [7-9].
Цель работы - анализ генетической структуры голштинской популяции отечественной селекции крупного рогатого скота на наличие моногенных наследственных заболеваний.
Материал и методика исследований. Исследования были выполнены в лаборатории молекулярной биотехнологии и ДНК-тестирования РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству».
Базовые хозяйства - госплемпредприятия (РСУП «Брестплемпред-приятие», РСУП «Гомельплемпредприятие», РУСП «Минское племп-
193
редприятие», РУСП «Гродненское племпредприятие») и племенные хозяйства республики (РДУП по племенному делу «ЖодиноАгроПле-мЭлита», РУСП «Племенной завод «Красная Звезда»» Минской, КСУП племзавод «Кореличи» Гродненской, КСУП «Брилево» Гомельской, ГУСП «Племзавод «Муховец»» Брестской областей, РУСХП «Оршанское племпредприятие».
Объект исследований - быки-производители, высокопродуктивные коровы и ремонтные бычки голштинской популяции. Предмет исследований -биопробы ткани, спермы, крови.
С целью изучение генетической структуры отечественного племенного поголовья крупного рогатого скота по генам, детерминирующим развитие наследственных заболеваний, было проведено ДНК-тестирование животных методом ПЦР-ПДРФ с использованием специфических прай-меров и рестриктаз. Выделение ДНК осуществлялось адаптированными ранее методами с собственными модификациями.
Полученные препараты геномной ДНК подвергались спектрофото-метрическому анализу с использованием аппарата GenQuant.
Праймеры для амплификации фрагмента гена CD18: BLAD1 и BLAD2'. Длина амплифицированного фрагмента - 132 п.о.
Полученный ПЦР-продукт подвергается рестрикции с использованием рестриктазы TagI.
Праймеры для амплификации фрагмента гена UMPS: AVA1 и AVA2. Длина амплифицированного фрагмента - 108 п.о.
Полученный ПЦР-продукт подвергается рестрикции с использованием рестриктазы Aval.
Праймеры для амплификации фрагмента гена SLC35A3: F(wild), F(cvm) и обратный праймер: R (SLC). Длина амплифицированного фрагмента - 233 п. о.
Полученный ПЦР-продукт подвергается рестрикции с использованием рестриктаз: Pst I и EcoT22I.
Детекция результатов трех этапов работы - выделения ДНК, амплификации фрагмента гена и рестрикции продуктов амплификации осуществлялось методом гель-электрофореза с последующей визуализацией на трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете при помощи компьютерной видеосистемы INFINITY или на генетическом анализаторе (Agilent Tecnologies 2200 Tape). В качестве маркера использовалась ДНК плазми-ды pBR322, расщепленной рестриктазой AluI, либо рестриктазой BsuRI.
Результаты исследований и их обсуждение. В ходе научно-производственных исследований была изучена генетическая структура
поголовья крупного рогатого скота по моногенным наследственным заболеваниям. Наличие синдрома врожденного иммунодефицита крупного рогатого скота, обусловленного точковой мутацией в кодирующей части аутосомного гена CD18, было выявлено у 3,7 % быков-производителей, 2,2 % высокопродуктивных коров и 3,4 % протестированных ремонтных бычков (табл. 1).
Т а б л и ц а 1 .Частота встречаемости мутации БЬАЭ в голштинской популяции отечественной селекции
Половозрастная группа Кол-во животных Частота встречаемости мутации, %
Быки-производители 856 3,7
Ремонтные бычки 509 3,4
Племенные коровы 1184 2,2
В среднем 2549 3,0
Установлены различия в частотах встречаемости мутации среди коров различных хозяйств. Вероятно, это можно объяснить с позиции эффекта родоначальника, то есть ведения интенсивной репродукции генотипов гетерозиготных производителей, являющихся не только носителями мутации, но и улучшателями продуктивности.
Проведено изучение родословных племенных коров, имеющих в своем генотипе аллель CD18BL. Установлено, что носителями мутации являлись животные, отцы которых принадлежат к линиям Рефлекшн Соверинга 198998, Монтвик Чифтейна 95679, П. Говернера 882933 и Вис Айдиала 933122.
Проведенный анализ распространенности мутации BLAD среди десяти основных линий быков-производителей голландского и голштин-ского корней, используемых в республике при совершенствовании белорусской черно-пестрой породы. Свободными от мутации оказались животные двух линий голландского (Аннес Адема 30587 и Хиль-тес Адема 37910) и одной - голштинского (Силинг Трайджун Рокита 252803) корня. В то же время носительство BLAD-синдрома выявлено в линиях Монтвик Чифтейна 95679, Нико 31652, П. Говернера 882933, Рутьес Эдуарда 31646, Рефлекшн Соверинга 198998, Вис Айдиала 933122 и П.Ф.А. Чифа 1427381. Наиболее высокие частоты встречаемости BLAD-синдрома отмечены в линиях Монтвик Чифтейна 95679 (4,2 %), Нико 31652 (4,2 %), П. Говернера 882933 (4,4 %) и Пони Фарм Арлинда Чифа 1427381 (11,1 %).
В ряде случаев было установлено, что передача мутантного гена ремонтному бычку была осуществлена через мать - быкопроизводящую коров, являющуюся носителем мутации в гетерозиготной форме. Генотип отца таких бычков был свободен от мутации. Полученные результаты свидетельствуют о путях передачи синдрома врожденного иммунодефицита племенному молодняку не только через отцов, но и через бы-копроизводящих коров, имеющих мутантный аллель в своем генотипе.
Продолжающееся распространение заболевания связано с тем, что гетерозиготные животные фенотипически не отличаются от здоровых, поэтому селекция по фенотипу не приводит к желаемым результатам: выбраковке носителей мутации. К тому же отсутствие до последнего времени генетического контроля за данной мутацией создало предпосылки для ее наследования среди животных племенных стад.
Для оценки динамики распространения мутации БЬЛЭ среди крупного рогатого скота голштинской популяции в разрезе лет были использованы данные предыдущих исследований (табл. 2).
Т а б л и ц а 2. Распространение мутации БЬАЭ в голштинской популяции отечественного скота
Животные Год Кол-во голов Частота встречаемости носительства мутации, %
СЭ18ТШЪ С018В1ЛЪ
Быки-производители 2007 708 98,4 1,6
2011 300 97,0 3,0
2014 150 96,0 4,0
В среднем 1158 97,7 2,3
Племенные коровы 2008 1344 98,0 2,0
2012 350 97,0 2,0
2014 200 98,0 5,5
В среднем 1894 97,6 2,4
Ремонтные бычки 2008 497 98,7 1,3
2011-2012 75 93,3 6,7
2014 200 99,5 0,5
В среднем 772 98,4 1,6
Как следует из данных таблицы, частота встречаемости мутации БЬЛЭ среди быков-производителей, быкопроизводящих коров и ремонтных бычков находится в относительно низких пределах и составляет 1,6-2,4 %. При этом очевидно, что частота встречаемости синдрома иммунодефицита среди быков-производителей за семь лет увеличилась с 1,6 % до 4,0 %.
При наличии в последнее время в паспорте зарубежных быков отметки об отсутствии данной мутации рост частоты встречаемости мутации, возможно, связан с введением в селекционный процесс непроверенных ранее ремонтных бычков. Подобная тенденция наблюдается и среди поголовья племенных коров. Носительство мутации, составлявшее в 2008 году 2,0 %, достигло к 2014 году 5,5 %. В то же время такой рост в процентах может зависеть от относительности выборки для тестирования по локусу гена CD 18 в первую очередь тех коров, от которых были получены гетерозиготные телята, мутация в генотипе которых могла определяться не только матерью, но также и гетерозиготным быком. Частота встречаемости мутации BLAD среди ремонтных бычков к 2014 году снизилась и составила лишь 0,5 %. Вероятно, это связано с генотипированием на наличие мутации в последнее время значительной части всего ремонтного молодняка.
Полученные результаты указывают на целесообразность тестирования ремонтного молодняка на носительство BLAD, особенно при наличии гетерозиготных матерей, в раннем возрасте одновременно с оценкой достоверности происхождения, до постановки на элевер.
Установлено, что, хотя частота встречаемости BLAD-синдрома в различных половозрастных группах не превышает 5,5 %, она может быстро повыситься, если широко использовать в системе искусственного осеменения гетерозиготных производителей. Это приведет, с одной стороны, к снижению гетерозиготности стада, а с другой - к насыщению популяций летальными мутациями.
Было проведено генотипирование животных голштинской популяции отечественной селекции по локусу гена UMPS. В ходе исследований было установлено, что все протестированные животные обладали
TD/TD
гомозиготным генотипом DUMPS (свободные от мутации). Живот-
TD/DP
ных, имеющих гетерозиготный (DUMPS ) и рецессивный гомозиготный генотип (DUMPSdp/ dp), не выявлено (табл. 3).
Т а б л и ц а 3. Частота встречаемости мутации DUMPS в голштинской популяции отечественной селекции
Половозрастная группа Кол-во животных Частота встречаемости мутации , %
Быки-производители 326 -
Ремонтные бычки 184 -
Племенные коровы 202 -
В среднем 712 -
Полученные данные свидетельствуют об отсутствии распространения мутации DUMPS среди отечественного племенного поголовья во всех половозрастных группах и о благополучной ситуации по данному заболеванию в республике в целом.
Однако, несмотря на полученные положительные результаты, следует проводить строгий контроль при импорте племенных животных и спермы, так как данное заболевание выявляется как в США, так и в странах Европы и Азии, и может быть завезено в республику с генетическим материалом. Генетический мониторинг летальных мутаций крупного рогатого скота необходим не только среди быков-производителей, но и ведущих племенных хозяйствах, поставляющих ремонтных бычков на племпредприятия, до тех пор, пока мутантный аллель сохраняется в маточных стадах.
Мониторинг мутации DUMPS, как и других рецессивных заболеваний крупного рогатого скота, может оказаться актуальным и для исследований по картированию в геноме КРС локусов количественных признаков, так как выявлено, что локусы генов CD18 (синдрома врожденного иммунодефицита) и UMPS сцеплены и расположены на первой хромосоме, на которой располагаются и гены, ассоциированные с признаками молочной продуктивности. Таким образом, нельзя исключить, что распространение данных наследственных мутаций в популяции голштинского скота в какой-то мере связано с селекцией по молочности. В то же время наличие животных - носителей синдрома DUMPS в гетерозиготном состоянии может поддерживаться процессами популяционно-генетической адаптации к новым условиям воспроизводства.
Изучение генетического сцепления данных маркеров с хозяйственно-ценными признаками позволит проводить обоснованную и целенаправленную селекцию, учитывая вопросы как отбора животных желательных генотипов, так и сохранения генофондного материала.
Было проведено генотипирование животных голштинской популяции отечественной селекции по локусу гена SLC35A3.
Установлено, что в среднем по всем протестированным госплем-предприятиям 4,4 % быков-производителей являлись носителями му-тантного аллеля CVMCV (табл. 4).
Среди ремонтных бычков животных - носителей мутации выявлено не было, что свидетельствует о благополучном состоянии в данной возрастной группе.
Т а б л и ц а 4. Частота встречаемости мутации СУМ в голштинской популяции отечественной селекции
Половозрастная группа Кол-во животных Частота встречаемости мутации, %
Быки-производители 106 4,4
Ремонтные бычки 13 -
Племенные коровы 133 5,0
В среднем 252 4,5
Проведен анализ наличия мутации СУМ среди быков-производителей и ремонтных бычков на линейном уровне. Носи-тельство мутации СУМ выявлено только в линиях быков голштинско-го корня: Рефлекшн Соверинга 198998 и Вис Айдиала 933122.
Частота встречаемости мутантного аллеля среди племенных коров находится в среднем на уровне 5,0 %.
Использование таких животных в качестве быкопроизводящих может привести к получению гетерозиготного потомства и, как следствие, к дальнейшему распространению синдрома сложной деформации позвоночника среди племенного поголовья республики.
Общая картина распространения моногенных наследственных заболеваний крупного рогатого скота голштинской популяции отечественной селекции представлена на рис. 1.
Р и с. 1. Встречаемость мутаций среди различных половозрастных групп отечественного поголовья крупного рогатого скота
По результатам ДНК-тестирования животные - носители мутации были исключены из дальнейшего процесса воспроизводства.
Заключение. Результаты исследований позволяют сделать вывод о распространенности среди племенного поголовья крупного рогатого
199
скота голштинской популяции отечественной селекции моногенных наследственных заболеваний: BLAD, DUMPS и CVM. Установлено носительство BLAD-синдрома в среднем у 3,7 % протестированных быков-производителей, 2,2 % высокопродуктивных коров и 3,7 % ремонтных бычков. Наличие мутации CVM выявлено в среднем у 4,5 % протестированных животных, в том числе 4,4 % быков-производителей, 5,0 % коров. Животных, имеющих мутацию DUMPS, не выявлено.
Установлены пути дальнейшего распространения мутации - не только через быков-носителей синдрома, но и через быкопроизводящих коров.
Генодиагностика наследственных мутаций крупного рогатого скота, основанная на использовании методов ДНК-технологий, дает возможность идентификации наследственных мутаций у животных на уровне генотипа в любых половозрастных группах; позволяет изучить генеалогическую структуру породы по локусу данных генов, оценить влияние мутаций на хозяйственно-значимые признаки, выявить пути их распространения, устранить из селекционного процесса животных-носителей мутаций, оздоровить племенной генофонд республики и решить проблему повышения резистентности племенного поголовья и сохранности ремонтного молодняка.
ЛИТЕРАТУРА
1. Скрининг гена дефицита лейкоцитарной адгезии у черно-пестрого голштинизиро-ванного скота / Н. С. Марзанов [и др.] // Сельскохозяйственная биология. - 2003. - № 6. -С. 23-29.
2. A k y u z, B. Detection of defiency of uridine monophosphate (DUMPS) in Holstein and native cattle in Turkey / B. Akyuz, O.Ertugrul // Ankara Univ. Vet Fak. Derg, 2008, 55:57-60.
3. A missense mutation in the bovine SLC35A3 gene, encoding a UDP- N-acety-lglucosamine transporter, causes complex vertebral malformation / B. Thomsen [et al.] // Genome Res. 2006, 16: 97-105.
4. Complex vertebral mal-formation in Holstein calves / J. S. Agerholm [et al.] // J. Vet. Diagn. Invest. 2001, V.13. P.283-289.
5. G r z y b o w s k i, G. Identyficacija "genu zamieralnosci zarodkow" DUMPS u budla / G. Grzybowski // Przegl. Hodowl., 1996. - R.64, № 8. - S. 42-44.
6. Immunohistochemical location of adhesion molecules (CD62 and Cd18) in the mammary gland of dairy cows / M. Simon [et al.] // Czech. Anim. Sci. - 2007. - Vol. 52(4). - P. 88-95.
7. M a l h e r, X. Effects of sire and dam genotype for complex vertebral malformation (CVM) on risk of return-to-service in Holstein dairy cows and heifers / X. Malher, F. Beaudeau, J. Philipot // Theriogenology 2006, 65:1215-1225.
8. R o b i n s o n, J. L. Consequences of UMP syntase deficiency in cattle / J. L. Robinson, M. P. Drablik, D. B. Dombrobwski // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1983. - V.80. - P. 312-323.
9. S h u s t e r, D. E. Identification and prevalence of a genetic defect that causes leucocyte adgesion deficiency in Holstein cattle / D. E. Shuster [ et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. - USA. -1992. - V. 892. - P. 9225-9229.
