CC BY
34
УДК 636.4.082:612
ГЕНОДИАГНОСТИКА НАСЛЕДСТВЕННОГО СИНДРОМА ИММУНОДЕФИЦИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА БЕЛОРУССКОЙ ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ ПОРОДЫ
О.П. КУРАК, Ж.А. ГРИБАНОВА РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству» г. Жодино, Минская обл., Республика Беларусь, 222160
(Поступила в редакцию 14.01.2013)
Введение. Использование зарубежного племенного материала для совершенствования отечественного поголовья крупного рогатого скота может сопровождаться передачей наследственных заболеваний, в том числе синдрома иммунодефицита (BLAD - Bovine Leucocyte Adhesion Deficiency - дефицит адгезивности лейкоцитов), вызываемого точко-вой мутацией в кодирующей части аутсомного гена CD 18. Это генетически детерминированное заболевание с характером наследования по рецессивному типу, приводящее к разрушению иммунной системы животных. В гомозиготном рецессивном состоянии оно является летальным: у телят резко снижаются защитные свойства организма, их иммунная система не способна противостоять вирусным и бактериальным инфекциям, что приводит к гибели животных в раннем возрасте (обычно до года). Наиболее часто наблюдаются нарушения респираторной функции и функции желудочно-кишечного тракта. Носители мутантного гена в гомозиготе отличаются замедленным ростом, имеют тусклую взъерошенную шерсть, язвы в ротовой полости, шаткость зубов, диарею и не поддаются лечению. У них наблюдается повышенное содержание зрелых нейтрофилов - больше 47000 на 1 млн. (при норме -около 4000 на 1 млн.). Болезнь проявляется только у гомозиготных животных. У гетерозиготных фенотипических отклонений не выявлено.
Распространение мутации определяется рецессивным характером ее наследования и участием в регуляции тканеспецифичных функций, при этом неблагоприятные эффекты мутантного аллельного варианта компенсируются в гетерозиготе нормальной функцией аллеля дикого типа. Негативная селекция на уровне фенотипа является неэффективной в связи с низкой частотой гомозигот по отношению к гетерозиготам.
Негативное действие рецессивных аллелей состоит не в том, что несколько животных заболеет и погибнет. Оно связано с использованием современной технологии размножения животных. От одного быка могут быть получены десятки тысяч потомков, поэтому частота нежелательных аллелей может резко увеличиться в течение малого числа поколений. Кроме того, анализ данных показывает, что если на первом этапе поток мутантных генов в стадо шел в основном через быков-производителей, замороженное семя и трансплантацию эмбрионов, то дальнейшее его распространение связано с использованием гетерозиготных быкопроизводящих коров.
Единственным существующим к настоящему времени методом, позволяющим безошибочно выявить носительство BLAD в гетерози-готе, является анализ продуктов амплификации участка гена CD 18 по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов.
Цель работы - провести генодиагностику наследственного иммунодефицита крупного рогатого скота белорусской черно-пестрой породы.
Материал и методика исследований. Исследования проводились на базе госплемпредприятй и племенных хозяйств республики. Объектом исследований являлись быки-производители, высокопродуктивные коровы и ремонтные бычки белорусской черно-пестрой породы. Предмет исследований - биопробы ткани и спермы.
В ходе исследований был осуществлен подбор и синтез специфичных праймеров на точковую мутацию: BLAD1: 5' -TGA GAC CAG GTC AGG CAT TGC GTT CA- 3' и BLAD2: 5'- CCC CCA GCT TCT TGA CGT TGA CGA GGT C -3', а также эндонуклеазы TaqI.
Были выполнены: тестирование различных вариантов компонентов реакционной смеси, подбор оптимальных температурно-кинетических параметров проведения ПЦР-ПДРФ и режимов гель-электрофореза.
ПЦР - программа: «горячий старт» - 5 мин - 93 оС; 35 циклов: денатурация - 1 мин - 93 оС, отжиг - 1 мин - 60 оС, синтез - 1 мин -72 о С; элонгация - 5 мин - 72 оС.
Предлагаемый режим позволил получить амплификат (132 п.о.) достаточной концентрации и высокой специфичности.
Эффективность тестирования составила 98 %.
Проведенные нами исследования выявили наличие данной мутации среди племенного поголовья белорусской черно-пестрой породы крупного рогатого скота. В ходе исследований были идентифицированы генотипы: CD18TL/TL (здоровые животные) и CD18bl/tl (животные - носители мутации).
Для оценки динамики ее распространения тестирование животных проводилось в течение 2007-2012 гг.
Рассчитаны частоты встречаемости аллелей и генотипов в различных половозрастных группах, в том числе у быков-производителей различных линий. С использованием критерия х2 проведена оценка генного равновесия в изученных стадах.
Проведена оценка воспроизводительной способности и качества спермопродукции быков-производителей различных генотипов по ло-кусу гена CD 18. Изучены показатели их относительной племенной ценности по удою, жирно- и белковомолочности дочерей, молочной продуктивности племенных коров (с учетом возраста животных).
Проанализирована взаимосвязь мутации BLAD с показателями роста, развития и естественной резистентности организма племенного молодняка.
Полученные данные обработаны статистически.
На основании результатов работы определено дальнейшее назначение животных - носителей мутации в селекционном процессе.
Результаты исследований и их обсуждение. В ходе научно-производственных исследований был проведен анализ распространения мутации BLAD в популяции крупного рогатого скота белорусской черно-пестрой породы в разрезе лет (табл.1) .
Таблица 1. Распространение мутации БЬАЭ в популяции белорусской черно-пестрой породы
Животные Год Количество голов Частота встречаемости носительства мутации, %
CD18TL/TL CD18ВL'1L
Быки-производители 2007 708 98,4 1,6
2011 300 97,0 3,0
Племенные коровы 2008 1344 98,0 2,0
2012 350 97,0 2,0
Ремонтные бычки 2008 497 98,7 1,3
2011-2012 75 93,3 6,7
Выявлено, что частота встречаемости мутантного аллеля среди племенных коров осталась на прежнем уровне - 2,0 %, у быков-производителей повысилась на 1,4 % (в течение трех лет), у ремонтного молодняка достигла уровня 6,7 %.
Наличие небольшого количества прогенотипированных бычков связано с тем, что основной объем работ по их тестированию запланирован на 2013 год. Возможно также, что такой высокий процент носи-тельства мутации в этой группе животных обусловлен тем, что в ходе предварительных исследований проводилась обязательная генодиагностика потомков, полученных от быкопроизводящих коров-носителей мутации.
В ходе исследований была подтверждена вероятность передачи мутации племенному молодняку не только через отцов, но и через матерей, имеющих мутантный аллель в своем генотипе. Так, в семи случаях был установлен путь передачи мутации - два бычка получили му-тантный аллель от отцов-носителей синдрома иммунодефицита, и пять - от гетерозиготных по данному локусу матерей (при этом генотип отца был свободен от носительства мутации). Использование таких коров в качестве быкопроизводящих может привести к дальнейшему распространению BLAD-синдрома. В ряде случаев пути передачи мутантного гена выявлены не были в связи с отсутствием результатов ДНК-тестирования отцов и матерей бычков.
Гетерозиготные животные - носители синдрома фенотипически не отличаются от здоровых, поэтому селекция по фенотипу не приводит к их выбраковке. Использование критерия хи-квадрат для двухаллель-ной системы показывает, что в этом случае исследуемая популяция не имеет нарушений генного равновесия.
Полученные результаты указывают на целесообразность тестирования ремонтного молодняка на носительство БЬЛЭ, особенно при наличии гетерозиготных матерей, в раннем возрасте одновременно с оценкой достоверности происхождения до постановки на элевер.
В ряде зарубежных работ были установлены выраженные отличия по частоте встречаемости мутации между быками (в два-три раза выше) и коровами, которые позволяют предполагать вовлечение неизвестных факторов отбора, поддерживающих распространение БЬЛЭ, поскольку племенные быки подвергаются более жесткому искусственному отбору. В наших исследованиях таких различий не выявлено.
Проведен анализ распространенности мутации БЬЛЭ среди десяти линий быков-производителей и ремонтных бычков голландского и голштинского корней, используемых в республике (табл. 2).
Установлено, что свободными от мутации оказались животные двух линий голландского корня (Аннас Адема 30587 и Хильтес Адема 37910) и одной - голштинского (Силинг Трайджун Рокита 252803). В то же время носительство БЬЛЭ-синдрома выявлено в линиях Монтвик Чифтейна 95679, Нико 31652, П. Говернера 882933, Рутьес Эдуарда 31646, Рефлекшн Соверинга 198998, Вис Айдиала 933122 и П.Ф.А. Чифа 1427381. Наиболее высокие частоты встречаемости БЬЛЭ-синдрома отмечены в линиях Монтвик Чифтейна 95679 (4,2 %), Нико 31652 (4,2 %), П. Говернера 882933 (4,4 %) и Пони Фарм Ар-линда Чифа 1427381 (11,1 %).
Проанализирована линейная принадлежность ремонтных бычков -носителей мутации. Установлено, что гетерозиготные бычки принадлежали к трем линиям голштинского корня: Монтвик Чифтейна 95679, Рефлекшн Соверинга 198998 и Вис Айдиала 933122.
Таблица 2. Генетическая структура различных линий быков-производителей и ремонтных бычков по локусу гена CD18
Линия Количество голов Частота встречаемости генотипов, %
CD18lb/lb CD18Hb'lb
Аннас Адема 30587* 23 100,0 -
Вис Айдиала 933122 139 98,6 1,4
Монтвик Чифтейна 95679 168 95,8 4,2
Нико 31652* 24 95,8 4,2
П. Говернера 882933 68 95,6 4,4
Пони Фарм Арлинда Чифа 1427381 9 88,9 11,1
Рефлекшн Соверинга 198998 160 99,4 0,6
Рутьес Эдуарда 31646* 28 96,4 3,6
Силинг Трайджун Рокита 252803 65 100,0 -
Хильтес Адема 37910* 66 100,0 -
В среднем по линиям 750 97,9 2,1
* Быки-производители голландского корня.
Оценка встречаемости мутации в различных возрастных группах коров позволила выявить, что большинство животных - носителей генотипа CD18BL/TL относилось к группе полновозрастных. Очевидно, это связано с наличием в настоящее время контроля наличия мутации BLAD в их генотипе закупаемых и выращиваемых телок, а также используемых при закреплении быков-производителей.
Для оценки влияния мутации на воспроизводительную способность быков-производителей был проведен анализ показателей воспроизводительной способности, качества спермопродукции и показателей относительной племенной ценности животных генотипов CD18TL/TL и CD18BL/TL Установлено, что значения таких показателей, как количество и объем эякулята (мл), концентрация спермы (млр/мл), активность спермиев (%), осеменено маток (гол.), процент оплодотворения (%), отелилось маток (гол.) определяются, в первую очередь, линейной принадлежностью и не зависят от генотипа животных по локусу гена CD18.
Среднее значение показателя «получено приплода» от быков с генотипом CD18BL/TL было на 7,3 % ниже, чем у животных генотипа
TL/TL ^ ^ **
CD18 , что согласуется с данными, полученными другими исследователями и, возможно, связано с гибелью телят гомозиготного рецессивного генотипа в раннем возрасте.
В связи с имеющимися зарубежными данными о том, что быки -носители синдрома иммунодефицита зачастую являются улучшателя-ми по признакам молочной продуктивности, и наличием в республике большой доли импортных быков-производителей и их потомков, принадлежащих к линиям, в которых встречаются носители мутации, проведена оценка влияния носительства мутации по гену CD 18 на показатели молочной продуктивности дочерей, а также анализ относительной племенной ценности (ОПЦ) быков-производителей различных генотипов по локусу гена CD18. Взаимосвязи между наличием му-тантного аллеля CD18BL и изученными показателями не выявлено. Так, если гетерозиготные быки Музыкант 31128 и Лотос 128 являлись улучшателями по всем изученным признакам, то Репейник 5237 проявил себя как ухудшатель (все значения ОПЦ менее 100), а такие производители, как Метан 4169 и Признак 4954 имели значения ОПЦ по отдельным признакам как выше, так и ниже 100.
Таким образом, установленная разнонаправленная и, в большинстве случаев, недостоверная связь между данными показателями и генотипом быков по локусу гена CD18 дает возможность вести селекцию на элиминацию животных - носителей мутации без снижения племенной ценности производителей.
Локус гена CD 18 расположен на первой хромосоме. На этой же хромосоме находится ряд генов, оказывающих влияние на молочную продуктивность. Таким образом, нельзя исключить, что возникающая мутация распространяется в популяции голштинского скота в связи с отбором на повышенную молочную продуктивность точно так же, как
и гены, непосредственно связанные с характеристиками молочной продуктивности. Отдельные зарубежные ученые считают, что присутствие аллеля CD18BL положительно влияет на рост молочной продуктивности и содержание белка в молоке. Проведенный нами анализ молочной продуктивности не выявил существенных различий между показателями животных - носителей синдрома иммунодефицита и свободных от мутации. Установлено, что наличие в генотипе коров му-тантного аллеля BLAD-синдрома не приводит к достоверному повышению показателей молочной продуктивности и, следовательно, выбраковка животных - носителей синдрома иммунодефицита не будет оказывать отрицательного влияния на показатели продуктивности в среднем по стаду.
Оценено влияние мутации на показатели роста, развития и естественной резистентности племенного молодняка. Хотя изучение возрастной динамики показателей роста и развития не выявило существенных различий между ними в зависимости от наличия или отсутствия в генотипе животных BLAD-синдрома, во все возрастные периоды наблюдалась тенденция некоторого снижения живой массы и среднесуточного прироста у гетерозиготных животных по сравнению с гомозиготными.
Во всех возрастных периодах (при рождении, 6, 12 и 18 месяцев) в группе гетерозиготных бычков было отмечено возрастание числа лейкоцитов на 13,5 - 24,6 %, (Р<0,001), а также снижение активности АСТ в сыворотке крови на 2,6 - 19,5 % (в 6 месяцев разница достоверна при Р<0,05). Наличие достоверной связи между носительством мутации и показателями содержания белков сыворотки крови, а также показателями БАСК, ЛАСК и бета-лизинной активности сыворотки крови не установлено.
Таким образом, не удалось выявить приоритетные факторы отбора, способствующие распространению мутации среди черно-пестрой породы. Основная опасность данного заболевания заключается в получении и гибели в раннем возрасте гомозиготного рецессивного молодняка. Введение принципа тестирования молодых бычков предотвратит последствия проявления мутации в возрасте 6-7 лет.
Контроль за распространением BLAD-синдрома в популяции отечественного поголовья крупного рогатого скота требует не только проведения генодиагностики племенных животных по данному локу-су, но и четкой организации племенного учета с оценкой происхождения. Закупаемый за рубежом племенной материал (сперма, эмбрионы или нетели) должны иметь наличие в генетическом паспорте отметки об отсутствии в их генотипе наследственных аномалий.
Заключение. На основании проведенного анализа генетической структуры популяции белорусской черно-пестрой породы по локусу гена CD18 установлено носительство BLAD-синдрома в среднем у
1,6-2,0 % протестированных быков-производителей, 2,0 % высокопродуктивных коров и 1,3-6,7 % ремонтных бычков.
Выявлены пути распространения мутации в республике не только через быков - носителей синдрома, но и через быкопроизводящих коров.
Не установлено достоверного влияния мутации BLAD на показатели воспроизводительной способности, качества спермопродукции и относительной племенной ценности быков-производителей и молочной продуктивности высокопродуктивных коров. Следовательно, выбраковка животных - носителей синдрома иммунодефицита не будет приводить к снижению данных показателей в среднем по породе.
Предлагаемый метод является быстрым, надежным и эффективным для установления полного контроля над мутацией, позволяет при рецессивном наследовании данной генетической аномалии проводить весьма эффективную селекцию на генном уровне, ведущую к элиминации нежелательных аллелей.
Экономический эффект может быть получен за счет исключения из процесса воспроизводства быков - носителей BLAD-синдрома (отсутствие затрат на их содержание, ветеринарное обслуживание и получение спермопродукции, не пригодной для дальнейшего использования в племенных целях), выбраковки ремонтных бычков - носителей мутации перед продажей на элевер (отсутствие затрат на покупку, содержание, ветеринарное обслуживание и кормление таких животных), использования в качестве быкопроизводящих племенных коров, свободных от мутации (повышение сохранности телят и получение здорового молодняка).
ЛИТЕРАТУРА
1. Внутрипородная генетическая дифференциация и наличие мутации BLAD у крупного рогатого скота голштинской породы / В.И. Глазко [и др.] // Сельскохозяйственная биология. - 2000. - № 4. - С. 45-48.
2. Глазко, В.И. Мутация BLAD (иммунодефицита) у крупного рогатого скота /
B.И. Глазко // Зоотехния. - 1998. - № 8. - С. 5-7.
3. Скрининг гена дефицита лейкоцитарной адгезии у черно-пестрого голштинизиро-ванного скота / Н.С. Марзанов [и др.] // Сельскохозяйственная биология. - 2003. - № 6. -
C. 23-29.
4. Czarnik, U. Hodowlane I genetyczno-populacyjne aspekty wystepowania BLAD (Bovine Leu kocyte Adhesion Deficiency) u bydla rasy czarno-bialej / U. Czarnik // Uniwer-sytet Warminsko-Mazurskiego. - Olsztyn, 2000. - 46 p.
5. Immunohistochemical location of adhesion molecules (CD62 and Cd18) in the mammary gland of dairy cows / M. Simon [et al.] // Czech. Anim. Sci. - 2007. - Vol. 52 (4). - P. 88-95.
6. Kuczka, A. Controlling bovine leycocyte adhesion deficiency (BLAD) / A. Kuczka, E. Kuhlmann, B. Sshwenger // Tierzucter. - 2000. - Vol. 45. - P. 32-35.
7. Natonek, M. Identifikacja mutacji blad u budla metoda PCR-RFLP / M. Natonek // Biul. Inform. Ins. zootecchn. - Krakow, 2000. - № 4 (227). - P. 29-33.
8. Shuster, D.E. Identification and prevalence of a genetic defect that causes leucocyte adgesion deficiency in Holstein cattle / D.E. Shuster [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. - USA. -1992. - V. 892. - P. 9225-9229.
9. Tammen, I. Weiterentwicklung des DNA-Tests auf BLAD fur den Einsatz in Rinderzucht und klinischer Diagnostic / I.Tammen // Hannover, 1994.
УДК 636.1.082 (476)
РЕЗУЛЬТАТЫ РАЗВЕДЕНИЯ ЛОШАДЕЙ ТРАКЕНЕНСКОЙ ПОРОДЫ И ЕЕ СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ В БЕЛАРУСИ
Ю.И. ГЕРМАН, М.А. ГОРБУКОВ, А.Н. РУДАК РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству» г. Жодино, Минская обл., Республика Беларусь, 222160
(Поступила в редакцию 19.01.2013)
Введение. Огромное значение в племенной работе с лошадьми имеет оценка их по селекционно-генетическим признакам. Республиканской программой по племенному делу в животноводстве на 20112015 гг. предусмотрено развитие в нашей стране не только племенного, но и спортивного, рабочепользовательного, продуктивного коневодства. Одним из наиболее перспективных среди них является спортивное. Формирование этого направления отрасли, интенсивно развиваемого во всех экономически преуспевающих странах мира, осуществляется в нашей республике поэтапно и по мере сокращения занятости лошадей в сельскохозяйственном производстве. Использование их в так называемой индустрии отдыха и спорта будет становиться превалирующим. Следует отметить, что тракененская порода наиболее многочисленная в республике и разводимый здесь популяционный массив - один из лучших в СНГ [1, 2].
Свое название порода получила от конного завода «Тракенен», основанного в Восточной Пруссии. На протяжении всего периода существования породы она предназначалась для производства кавалерийских, а позже - спортивных лошадей. В СССР тракены поступили из Германии в 1945 году. В Беларуси лошадей данной породы разводят в конном заводе им Л.М. Доватора, входящего сейчас в Республиканский центр олимпийской подготовки конного спорта и коневодства [3, 4]. Со временем небольшие селекционные группы породы были сформированы и в других хозяйствах республики. Ведется и единая для всех постсоветских стран Государственная племенная книга (ГПК). В ГПК лошадей записывают только после идентификации их происхождения по генетическим маркерам крови. До 2009 года издано семь томов ГПК. Таким образом, тракененское коннозаводство в России и Беларуси тесно взаимосвязано. Эта же ситуация характерна и для другой разводимой в Беларуси породы верховых лошадей зару-
