CC BY
61
ДНК-идентификация животных
для выявления фальсификаций продуктов питания
Аннотация. Приводятся результаты аккредитованной деятельности Института генетики и цитологии НАН Беларуси по видовой идентификации мясных ингредиентов животных и птицы в пищевой продукции и сырье с целью выявления фальсификации и подтверждения соответствия их качества.
Ключевые слова: видоспецифичная ДНК, митохондриальная ДНК, породоспецифичные SNP-маркеры, полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), цифровая капельная ПЦР (цПЦР), секвенирование, Bison bonasus, Bison bison, Bos taurus.
Для цитирования: Михайлова М., Шейко Р., Лагун Е., Балашенко Н., Мозгова Г., Островская А. ДНК-идентификация животных для выявления фальсификаций продуктов питания //Наука и инновации. 2020. №10. С. 40-45. https://doi.org/10.29235/1818-9857-2020-10-40-45.
Мария Михайлова,
заведующая лабораторией генетики животных Института генетики и цитологии НАН Беларуси, кандидат биологических наук, доцент; M. Mikhailova@igc.by
Руслан Шейко,
директор Института генетики и цитологии НАН Беларуси, член-корреспондент
Екатерина Лагун,
младший научный сотрудник
Института генетики и цитологии НАН Беларуси;
375296308364@yandex.by
Нина Балашенко,
младший научный сотрудник
Института генетики и цитологии НАН Беларуси;
ninabalashenko@tut.by
Галина Мозгова,
руководитель Национального координационного центра биобезопасности, кандидат биологических наук; g.mozgova@igc.by
Анастасия Островская,
младший научный сотрудник
Института генетики и цитологии НАН Беларуси;
ldgmo@igc.by
Возможность использования современных достижений молекулярной биологии для решения задач криминалистики, контроля безопасности и качества пищевой продукции имеет большое практическое значение. Идентификация видовой принадлежности биологического материала - гарант качества и безопасности импортируемого сырья и продуктов питания, инструмент борьбы с экономическим мошенничеством. Важность испытаний определяется тем, что такая продукция, как правило, состоит из ряда ингредиентов, что делает возможным их непреднамеренное или умышленное загрязнение неразрешенными составляющими. Товары этой группы подвергаются всем видам подделок, что объясняется высокими ценами на них и ограниченностью ресурсов. Появляются не разрешенные для реализации в Союзном государстве фальсификаты малоценного мясного сырья, когда дорогостоящие виды мяса заменяются более дешевыми (например, баранина - говядиной или свининой, говядина - кониной, индейка - курицей) [1]. Из-за этого не только изменяются потребительские свойства готовых изделий, но и возникает опасность для здоровья потребителей. Наибольшее бес-
покойство у ветеринарных врачей вызывают возможные подмены мясом животных, пораженных прионами или вирусами, создающими большой риск в эпизоотическом и эпидемическом отношениях (губкообразные энцефалопатии, африканская чума свиней, ящур и др.), а также сырьем, импорт которого по каким-либо причинам запрещен [2].
Установление достоверности пищевых продуктов в криминалистике обычно связано с возможностью фальсификации при их изготовлении, включая несанкционированное использование мяса диких животных, а также подмену или добавление более дешевых мясных продуктов. Традиционно в основном говядина на прилавках наших магазинов представлена разделочными тушами молочного черно-пестрого и голштинского скота. Небольшую долю составляет говядина, полученная от специализированных мясных пород. Их стоимость очень разнится в зависимости от породы. Так, цены высших деликатесных сортов мяса бычков мясных пород (за 1 кг): филе - 24 руб., шея - 30, котлетное мясо -18 руб. Стоимость же говядины черно-пестрого скота в Беларуси приблизительно в 2 раза ниже: за 1 кг филе - 12,99 руб., шеи и длиннейшей мышцы - 14,5, котлетного мяса - 7,9 руб.
Важно подчеркнуть, что общемировой тенденцией является потребление продуктов питания органического происхождения. Получить их можно от мясного скота, в структуре кормов которого большую долю составляют естественные пастбищные угодья и не применяются различные стимулирующие препараты и антибиотики. В ряде стран вопрос производства говядины успешно решается за счет развития специализированного мясного скотоводства. В ЕС его удельный вес в скотоводстве составляет 25-40%, а в США и Канаде - 75-80% [3]. Чтобы говядина была вкусной и полезной, животных выращивают в естественных условиях на природных пастбищах, где они получают полноценный и сбалансированный корм, обладающий всеми необходимыми питательными веществами и микроэлементами. За поголовьем ведется ветеринарный контроль в соответствии с нормами органического животноводства. Органическое мясо превосходит по вкусовым качествам промышленное, сохраняя высокую питательную ценность, витамины и минералы. Калорийность говядины при высоком содержании белка очень высокая, она подходит и для детского питания. Важно отметить и экономическую составляющую предприятий, занимающихся разведением специализированных мясных пород, которые могут получать большую прибыль за счет
таких качеств мяса, как нежный вкус, сочность, сбалансированная калорийность, обусловленная оптимальным присутствием жира в виде незначительной жировой прослойки, так называемой «мра-морности». К мясным породам крупного рогатого скота относятся герефордская, шортгорнская, гал-ловуйская, абердин-ангусская, калмыцкая, казахская белоголовая и др. В Беларуси около 50 тыс. голов крупного рогатого скота специализированных мясных пород (чистопородных и помесей): абердин-ангусской - 37%, герефордской - 31%, лимузинской -30% и шаролезской - 2% (на 01.01.2020 г.). По данным Белстата, в 2019 г. страна недополучила около 2 млн долл. экспортной выгоды по производству говядины (мясо на кости). За январь - май 2020 г. за рубежом закуплено 948 голов чистопородных племенных животных домашнего крупного рогатого скота на сумму 1247,4 тыс. долл. (средняя цена животного - свыше 2 тыс. долл.). За этот же период было ввезено 14 тыс. т говядины (мясо и пищевые мясные продукты) на сумму 43 951,6 тыс. долл. Стоимость разных категорий мяса колеблется от 2898 до 6298 долл. за т. [4]. Фальсификаторы мясной и рыбной продукции прибегают к подмешиванию более дешевого сырья, подлогу маркировки, незаконному использованию товарных знаков. Для борьбы с недобросовестными производителями создан ряд национальных, региональных организаций и международных сетей и платформ, в том числе Агентство Европейского союза по сотрудничеству в обеспечении законности (ЕВРОПОЛ).
Методы органолептического, физико-химического и микробиологического контроля дают возможность определить свежесть и безопасность в инфекционном отношении мясного сырья и готовых мясных изделий. Но с их помощью нельзя установить видовой состав мяса в продуктах, особенно если количество измененной мышечной ткани незначительно по отношению к основному сырью [5]. Наиболее перспективны методы ДНК-диагностики.
В лаборатории генетики животных Института генетики и цитологии НАН Беларуси проводятся научные исследования по подтверждению происхождения по 19 полиморфным микросателлитным локусам популяций крупного рогатого скота молочного направления. Показано, что информативность маркеров для определения популяционной принадлежности особи зависит от генетико-популяцион-ных критериев и требует выявления частот аллелей, индивидуализирующих и дифференцирующих параметров систем ДНК-маркеров для основных пород крупного рогатого скота, разводимого
в Беларуси и России, что согласуется с международными нормами. Данные разработки базируются на исследовании высокополиморфных STR-локу-сов на основе автоматизированного капиллярного электрофореза. Недостаток данных технологий - их неэффективность для решения задач подтверждения гибридного происхождения животных, изучения смешанных образцов, высокодеградированных и сильнозагрязненных объектов. Для этих целей необходимо использовать SNP-маркеры, так как они более многочисленны в геноме и стабильно передаются поколениям. Кроме того, эти маркеры расширяют возможности генотипирования особей с целью мониторинга природных популяций, так как способны обеспечить не только идентификацию, но также оценить степень инбридинга, выявить родственные связи с близкими видами.
Также решение вопроса о происхождении того или иного исследуемого образца возникает и при расследовании преступлений экологического и природоохранного характера, таких как незаконная охота. В этой связи важно с помощью молекулярных методов установить принадлежность предмета браконьерства к определенному виду или семейству, для того чтобы рассчитать компенсационные выплаты за нанесенный природе ущерб при вынесении обвинительного приговора суда. В Беларуси для обеспечения экономических интересов государства в области ведения охотничьего хозяйства, совершенствования государственного управления им, а также воспроизводства, охраны и рационального использования диких животных, относящихся к объектам охоты, применяются Правила ведения охотничьего хозяйства и охоты согласно Указу Президента Республики Беларусь от 21.03.2018 г. №112.
В лаборатории генетики животных Института генетики и цитологии НАН Беларуси в рамках совместного российско-белорусского проекта (2018-2020 гг.) проведено сравнительное исследова-
ние аллелофонда выборок из белорусской популяции зубра Bison bonasus и проведен сравнительный анализ генетической структуры и связей различных видов родов трибы Bovini, а именно видов европейского зубра (Bison bonasus), американского бизона (Bison bison) и крупного рогатого скота (Bos taurus). Проанализирован полиморфизм гена D-loop мтДНК на предмет наличия гаплотипов бизона и крупного рогатого скота в геноме европейского зубра. Показано наличие единого для всех зубров гаплотипа по мтДНК, отличного от последовательностей бизона и крупного рогатого скота. Анализ популяционно-ге-нетических параметров, рассчитанных по микроса-теллитным (STR) маркерам, показал сниженное разнообразие в группах зубра по сравнению с бизоном и крупным рогатым скотом [6].
Из базы данных, предоставленной The Barcode of Life Data Systems, взята информация о полученных другими исследователями аналогичных нукле-отидных последовательностях гена COI европейского зубра (Bison bonasus) (28 последовательностей), американского бизона (Bison bison) (40), крупного рогатого скота (Bos taurus taurus) (71). Выявлены 30 последовательностей этого гена, они отправлены для публикации в международной базе данных The Barcode of Life Data Systems.
Результаты секвенирования полиморфизма гена COI митохондриальной ДНК анализировались с помощью программы MEGA-X и SnapGene (рис. 1). Для визуализации и более детального анализа полученных результатов их сопоставили с данными, взятыми из базы последовательностей гена COI (всего 174 последовательности мтДНК) с целью выявления межвидовых гибридов в популяции зубра в Беларуси.
Для унификации сравнивались участки размером 585 п.о. В результате показано наличие единого для всех исследуемых зубров гаплотипа мтДНК (рис. 2.).
Полученные последовательности совпадают с таковыми у GBMTG1676-16, GBMA24368-19,
Рис. 1. Анализ последовательности участка митохондриальной ДНК В. Ьопазиз с помощью программы Mega-X
Рис.2. Единый для зубров белорусской популяции гаплотип последовательности гена COI
GBMA24364-19 Bison bonasus из The Barcode of Life Data Systems. Исследуемый участок более чем на 10% отличается от последовательностей аналогичного у мтДНК бизона и коровы, однако в связи с наличием единого для зубров гаплотипа KX553933.1 определить принадлежность особей к кавказской либо кавказско-беловежской линии не представляется возможным. Нуклеотидные последовательности зубра из Беларуси кластеризуются только с аналогичными у европейского зубра и расположены на значительном генетическом расстоянии от последовательностей американского бизона и коровы, что позволяет с уверенностью говорить об отсутствии гибридов среди исследованных животных. Таким образом, проведено ДНК-типирование 62 особей белорусского зубра и выявлен один гаплотип гена COI мито-хондриальной ДНК.
Для визуализации и более детального анализа полученных данных с использованием программы MEGA-X была построена филограмма, упрощенная форма которой представлена на рис. 3.
В рамках реализации новой программы Союзного государства «ДНК-идентификация-2» запланировано создание на основе метода секвенирования нового поколения технологии ДНК-идентификации подвидов подсемейства полорогих парнокопытных млекопитающих (Bovinae) - подвиды домашний бык (корова) (Bos taurus) и зубр европейский (Bison bonasus), подвергающихся неза-
конной охоте и внесенных в Красную книгу Республики Беларусь и России и имеющих II категорию охраны для определения видовой принадлежности биологических образцов. Одно из заданий программы - разработка технологии ДНК-идентификации породной принадлежности подвида бычьи (Bos taurus) с помощью породоспецифичных SNP-марке-ров, дифференцирующих генофонд крупного рогатого скота мясного или молочного направления, что позволит установить их подвид или породу для получения информации, которая может быть использована в криминалистике.
Рис.3. Филограмма, построенная на основе анализа частичной нуклеотидной последовательности гена COI европейского зубра (B. eonasus), бизона (B. eison) и крупного рогатого скота (B. taurus)
Общепринятая методика для видовой идентификации мясных ингредиентов животных и птицы в продуктах питания и сырье - недорогая, точная, качественная ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Она позволяет с высокой точностью выявить наличие искомого видоспецифичного фрагмента, присутствующего в образце в очень малом количестве [7]. Для регулирования требований к сырью и продукции в Республике Беларусь принят ГОСТ 31719-2012 «Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)», который распространяется на качественное определение видовой принадлежности мясных и растительных ингредиентов, содержащихся в кормах, пищевых продуктах, продовольственном сырье растительного, животного происхождения, в том числе подвергавшихся термической
"<rtfl
¡ЯШ Я
"ПОЛ
ъ
Iм®
jlOft,
■ ■ —-—т
у -у 1
/ ^ <4
/ //
X х y.jr
-
fü
'hiMniitc iJttjLih. Cq
1 - ДНК свиньи в исследуемом образце; 2 - ДНК свиньи в положительном контроле (К+); 3 - ДНК курицы в исследуемом образце; 4 - ДНК курицы в положительном контроле (К+); 5, 6 -отрицательный контроль (отсутствие ДНК курицы и свиньи)
Рис.4. Результаты испытаний по определению видовой принадлежности ДНК свиньи и курицы в образце мясной продукции
1, 2 - внутренний положительный контроль прохождения ПЦР-РВ;
3 - ДНК лошади в положительном контроле (К+);
4 - ДНК лошади в исследуемом образце;
5, 6 - отрицательный контроль (отсутствие ДНК лошади)
Рис.5. Результаты испытаний по определению видовой принадлежности ДНК лошади в образце мясной продукции
обработке. Данный стандарт применяется в аккредитованных лабораториях, занимающихся видовой идентификацией сырьевого состава методом ПЦР-РВ, в том числе и в Национальном координационном центре биобезопасности (НКЦБ) Института генетики и цитологии НАН Беларуси.
В НКЦБ за период 2018 г. - 1 квартал 2020 г. проведено 129 испытаний в отношении продуктов питания и сырья, состоящих из мяса или включающих мясные компоненты, в том числе мясных ингредиентов крупного (быки) и мелкого рогатого скота (бараны/овцы), домашней лошади, свиньи, курицы, индейки. В 2019 г. НКЦБ успешно подтвердил свою компетентность путем участия в межлабораторных сличениях по видовой идентификации мясных ингредиентов в образцах сложного многокомпонентного состава, организуемых подразделением группы LGC, которое уполномочено Национальным институтом измерений Великобритании для проведения химических и биоаналитических измерений.
На рис. 4 и 5 представлены результаты испытаний образцов мясной продукции на наличие видо-специфичной ДНК свиньи, курицы и лошади.
Метод качественной ПЦР-РВ обладает высокой точностью: его лимит определения на вышеперечисленные виды мясных ингредиентов составляет от 3 геном-эквивалентов для детекции крупного и мелкого рогатого скота до 50 - для свиньи, курицы и индейки. Вместе с тем все чаще на уровне стран ЕАЭС поднимается вопрос о необходимости принятия пороговой системы выявления различных видов мясных ингредиентов и внесения изменений в технический регламент Таможенного союза «О безопасности мяса и мясной продукции» (ТР ТС 034/2013) в части установления термина «технологически неустранимая примесь» и порогового значения, после которого данный ингредиент считается таковым. Обосновано это тем, что метод качественной ПЦР-РВ обладает высокой чувствительностью и может выявить следовые количества ДНК определенного вида, что говорит о загрязнении продукции мясным ингредиентом, который, например, не был указан поставщиком в сертификате качества.
В этом случае продукция не допускается к реализации в стране экспорта, и убытки компании-экспортера составят свыше 100% (закупочная стоимость, расходы на транспортировку, лабораторные исследования). В случае если она, основываясь на результатах лабораторного анализа, укажет в ветеринарном сертификате, помимо дорогостоящего вида мяса, малоценные разновидности сырья, закупочная стоимость будет снижена как минимум вдвое.
Для точного подтверждения количественного содержания мясных ингредиентов необходимо разработать методики высокоточного количественного определения видоспецифичной ДНК как в цельном мясе, так и для количественной оценки процентного соотношения фальсифицирующих примесей к основному сырью в готовой продукции сложного состава, в которой могут содержаться примеси различных видов мяса. Второй важный вопрос - мультиплексирование ПЦР-ре-акции, то есть разработка метода ПЦР для одновременного прохождения нескольких реакций детекции видоспецифичной ДНК в одной пробирке, что позволит снизить стоимость данного метода и одновременно увеличить скорость выполнения работ.
Необходимо отметить, что для количественного определения ДНК-мишени применяются два высокоточных метода: «золотой стандарт» - ПЦР-РВ и цифровой капельной ПЦР. Последний является новым и представляет собой усовершенствованную полиме-разную цепную реакцию, которая позволяет достоверно устанавливать абсолютное количество копий ДНК-мишени в образце с чувствительностью до 1 копии ДНК из 100 тыс. Метод имеет ряд преимуществ по сравнению с ПЦР-РВ. К ним относятся возможность абсолютного количественного обнаружения числа копий идентифицируемого фрагмента ДНК или РНК по конечной точке реакции амплификации, устойчивость к ингибиторам полимеризации, независимость результата анализа от эффективности ПЦР, отсутствие необходимости построения стандартных кривых, использования контролей [8].
Для подтверждения отсутствия фальсификации и соответствия качества мясной продукции в рамках реализации новой программы Союзного государства «ДНК-идентификация-2» запланирована разработка технологии количественного определения видового состава многокомпонентных мясных продуктов. Будут апробированы следующие методы количественной ПЦР: ПЦР в режиме реального времени и цифровая капельная ПЦР. Будет проведено их сравнение и валидация наиболее эффективного метода.
Таким образом, разработка отечественных технологий для генотипирования образцов диких и домашних животных имеет инновационный и импортозамещающий характер. Их использование для судебной экспертизы по делам о незаконной охоте и хищении домашнего скота, а также продуктов переработки животного происхождения экономически эффективно, поскольку любой доказанный в суде факт незаконной добычи дикого или одомашненного животного влечет компенсацию государству прямого и опосредованного (экологического)
ущерба. Применение метода количественной ПЦР позволит различать умышленно произведенный подлог от технически неизбежной контаминации пищевого сырья, возникающей в процессе технологической обработки мяса. Разработка тест-систем количественной оценки позволит предприятиям избежать необоснованных затрат на удаление партий продукции, содержание в которой технически неустранимой примеси не заявленных видов мяса не достигает порогового уровня.
■ Summary. The article describes state-of-the-art approaches to the species and breed identification of even-toed ungulates, including the determination of subspecies of the Bovinae subfamily and the belonging of breeds of bovine (Bos taurus) subspecies using breed-specific SNP markers that differentiate the gene pool of meat or dairy cattle; the accredited activity results of the Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus on the species identification of the meat ingredients of animals and poultry in food products and raw material are provided to detect adulterations and prove the quality conformance. The authors demonstrate their own results related to the studies on the COI gene polymorphism of mitochondrial DNA of the European bison (Bison bonasus), the American bison (Bison bison), cattle (Bos taurus taurus). A need for developing of species and breed identification technologies allowing to determine the belonging of an individual to a specific subspecies or breed to obtain information that may be used in forensic science is substantiated. The importance of developing of quantitative PCR techniques for the rigorous calculation of an adulteration content in meat products and differentiation between the deliberately produced fake and the technically inevitable contamination of food raw material arising from technological meat processing is justified.
■ Keywords: species-specific DNA, mitochondrial DNA, breed-specific SNP markers, polymerase chain reaction (PCR), real-time PCR, droplet digital PCR (dPCR), sequencing, Bison bonasus, Bison bison, Bos taurus.
■ https://doi.org/10.29235/1818-9857-2020-10-40-45
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Identification of meat origin in food products - a review / Rahmati Sh. [et al.] // Food Control. 2016. Vol. 68. P. 379-390.
2. Комарова И.Н., Серегин И.Г., Валихов А.Ф. Полимеразная цепная реакция - современный метод выявления фальсификации мясного сырья и продуктов // Мясная индустрия. 2004. №2. С. 37-41.
3. Сидунов С.В. Экстерьерно-конституциональные особенности молодняка абер-дин-ангусской породы венгерской селекции в условиях пойменного земледелия / С.В. Сидунов [и др.] // Проблеми виробництва i переробки продовольчоТ сировини та я^сть i безпечшсть харчових продуклв: збiрник наукових праць мiжнар.на-ук.-практ. конф. (16-17 травня 2019 р., м. Житомир). - Житомир, 2019. С. 196-198.
4. Импорт товаров. Раздел I. Живые животные и продукты животного происхождения // https://www.belstat.gov.by/ofitsialnaya-statistika/realny-sector-ekonomiki/vneshnyaya-torgovlya/operativnye-dannye/eksport-i-import-tovarov-g-6-znakov-tn-ved-eaes/import-tovarov/5 https://rg.ru/2018/11/05/kakie-produkty-v-raznyh-stranah-poddelyvaiut-chashche-vsego.html.
Полный список использованных источников http://innosfera.by/2020/10/species_specific_DNA
Статья поступила в редакцию 11.08.2020
