CC BY
77
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 6
Методики контроля качества продукции
УДК 637:637.068:57.088.3
МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ ДНК-ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИДОВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ЖИВОТНОВОДЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ
Е.Н. КОНОВАЛОВА, Е.А. ГЛАДЫРЬ, Н.А. ЗИНОВЬЕВА
На основе мультиплексной ПЦР разработана тест-система, позволяющая одновременно идентифицировать ДНК свиньи (Sus scrofa), коровы (Bos taurus) и курицы (Gallus gallus) в объединенных пробах измельченной мышечной ткани. Показана высокая чувствительность и специфичность определения видового происхождения компонентов, входящих в состав таких смешанных проб, с использованием предложенного метода (эффективность обнаружения видоспецифи-ческой ДНК в образцах материала от животных соответствующего вида и в объединенных пробах практически не различалась). Продемонстрирована возможность использования разработанной тест-системы для оценки происхождения различных пищевых продуктов, в том числе прошедших термическую обработку (коровье молоко, творог, отварная говядина, паштет из говяжьей печени, говяжий и куриный бульон, сырая свинина, смесь говяжьего и свиного фарша, запеченная и копченая курица, сыр, колбаса).
Ключевые слова: идентификация видовой принадлежности, митохондриальная ДНК, мультиплексная ПЦР, продукты животного происхождения.
Keywords: species origin identification, mitochondrial DNA, multiplex PCR, meat products.
Ветеринарно-санитарная оценка необходима для обеспечения качества животноводческой продукции и охраны здоровья населения (1, 2). К критериям качества относится, в частности, наличие фальсифицирующих примесей. Наиболее распространенный способ фальсификации продуктов переработки мяса — замена одного вида другим, менее ценным в пищевом отношении. При оценке происхождения животноводческой продукции применяют различные аналитические методы, включая масс-спектрометрию актина, гемоглобина, миоглобина и альбумина для выявления видоспеци-фических различий, фракционное разделение экстрактов мышечной ткани посредством газовой хроматографии, иммунодиффузию (3, 4) и др. Однако перечисленные приемы имеют ограничения при идентификации продуктов переработки, когда происходит разрушение структуры тканей и/или деградация белков. В отличие от белков ДНК более устойчива, и ее информативность как критерия видоспецифичности не изменяется под воздействием температурных или механических факторов. Вследствие этого для определения видового происхождения и сырьевого состава продукции был предложен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) как наиболее чувствительный и специфичный (5-8). В то же время актуальными остаются задачи оптимизации методов и тест-систем применительно к различным образцам сырья и продуктов.
В филогенетических и арбитражных исследованиях широкое применение находит использование консервативных участков гена цитохрома b (cyt b) в качестве матрицы при ПЦР, однако существующие тест-системы основаны главным образом на симплексном анализе материала, полученного от особей одного вида (9). Относительно недавно появились данные зарубежных исследователей, описывающих возможность использования мультиплексной ПЦР для идентификации материала от нескольких видов лабораторных животных одновременно (10). В перспективе применение подобного подхода может существенно снизить затраты реактивов и времени анализа, что уменьшит его себестоимость.
Наша цель заключалась в разработке мультиплексной тест-системы
для одновременной идентификации ДНК крупного рогатого скота, свиньи и курицы в животноводческой продукции и продуктах ее переработки.
Описание методики. Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы определяли с использованием образцов измельченной мышечной ткани разного состава (говядина, свинина, курятина, говядина + свинина, говядина + курятина, говядина + свинина + курятина). Для оценки универсальности предложенной тест-системы анализировали набор продуктов, приобретенных в городской торговой сети: коровье молоко, творог из коровьего молока, отварную говядину, паштет из говяжьей печени, говяжий и куриный бульон, сырую свинину, смесь говяжьего и свиного фарша, мясо курицы (запеченной, копченой), сыр, колбасу. Выделение ДНК из проб проводили с помощью набора реагентов Diatom™ DNA Prep100 (ООО «Лаборатория Изоген», Россия) согласно принятому протоколу производителя. Подбор олигонуклеотидных праймеров для амплификации ДНК трех видов животных (крупный рогатый скот, свиньи и куры) подбирали с использованием Интернет-ресурса www.ncbi.nih.gov. Постановку ПЦР проводили в соответствии с методическими рекомендациями (11). Разделение продуктов амплификации осуществляли в 2 % ага-розном геле в буфере TBE с добавлением бромистого димидия (3,8-диами-но-5-метил-6-фенилфенантридиний) в конечной концентрации 1 мкг/мл.
Последовательности праймеров, выбранных для амплификации фрагмента гена cyt b видов Bos taurus (крупный рогатый скот), Sus scrofa (свинья) и Gallus gallus (курица) в составе разработанных тест-систем, приведены в таблице 1.
1. Краткая характеристика праймеров, использованных для ПЦР-амплифика-ции фрагмента гена цитохрома b коровы, свиньи и курицы
Вид животного I Праймер | Нуклеотидная последовательность 5'^3' Длина фрагмента, п.н.
Bos taurus Bos 1 ATTCCTCCACGAAACAGGCTCC 218
Bos 2 TATCACTCGGGTTTGATGTGAGG
Sus scrofa Sus 1 ATTATCAACAACGCATTCATTGACC 377
Sus 2 TATTTGTCCTCAGGGCAGGACG
Gallus gallus Gal 1 ATAGCCACCGCCTTTGTGGGC 151
Gal 2 TTGGGTTGTCGACTGAAAATCCC
Проведенные нами исследования позволили определить оптимальный состав реакционной смеси: конечный объем — 10 мкл в ПЦР-буфере, содержащем 16,6 мМ (NH4)2SO4, 67,0 мМ Трис-HCl (pH = 8,8), 1,5 мМ MgCl2 и 0,01 % Твин 20, с добавлением 200 мкМ каждого из четырех дНТФ, по 2 пкмоль праймеров Bos_1, Bos_2, по 9 пкмоль праймеров Sus_1, Sus_2, по 1,5 пкмоль праймеров Gal_1, Gal_2, 1 Ед. Taq-полимеразы («Диа-лат Лтд.», г. Москва). После начальной данатурации при 94 °С в течение 3 мин выполняли 35 циклов амплификации в следующем температурно-временном режиме: 94 °С — 45 с, 70 °С — 30 с, 72 °С — 40 с. По завершении осуществляли дополнительную элонгацию при 72 °С в течение 4 мин.
Результаты гель-электрофореза продуктов мультиплексной ПЦР-амплификации ДНК, выделенной из образцов измельченной мышечной ткани исследуемых видов животных и птицы, с использованием разработанной тест-системы: 1 — отрицательный контроль, 2-4 — соответственно говядина, свинина, курятина, 5-8 — объединенные пробы говядина + свинина, говядина + курятина, свинина + курятина, говядина + свинина + курятина. Фрагменты длиной 377, 218 и 151 п.н. специфичны соответственно для Sus scrofa, Bos taurus и Gallus gallus.
При анализе образцов мышечной ткани исследуемых видов животных и птицы были идентифицированы специфические фрагменты, соот-
ветствующие видовому составу продукта (рис.).
Предложенная тест-система оказалась пригодна для анализа продуктов, лишенных морфологических и анатомических видовых особенностей (измельченное сырье), а также прошедших термическую обработку (табл. 2).
2. Выявление видоспецифических фрагментов ДНК с помощью мультиплексной ПЦР-амплификации в пробах различных пищевых продуктов
Вид продукта | 377 п.н. (Sus scrofa) | 218 п.н. (Bos taurus) | 151 п.н. (Gallus gallus)
Молоко - + -
Творог - + -
Говядина отварная - + -
Паштет печеночный говяжий - + -
Запеканка - + -
Суп на говяжьем бульоне - + -
Свинина натуральная + - -
Фарш (свинина + говядина) + + -
Курица запеченная - - +
Курица копченая - - +
П р и м е ч а н и е. «+» и «-» — соответственно наличие и отсутствие фрагмента.
Таким образом, предложенная нами тест-система позволяет одновременно детектировать ДНК трех видов животных — Sus scrofa, Bos taurus и Gallus gallus. С помощью этого метода можно определять видовое происхождение как натуральных, так и переработанных продуктов с существенным сокращением затрат времени и реактивов. Все это делает описанную тест-систему полезным инструментом для идентификации животного сырья, а также выявления фальсификации пищевых продуктов и, возможно, кормов.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Б у р к и н A.A., К о н о н е н к о Г.П., Б у р к и н М.А. Методы санитарного контроля животноводческой продукции. Сообщение I. Иммуноферментный анализ тетра-циклинов. С.-х. биол., 2010, 4: 110-117.
2. К о н о н е н к о Г.П., Б у р к и н A.A. Методы санитарного контроля животноводческой продукции. Сообщение II. Иммуноферментный анализ бацитрацина. С.-х. биол., 2010, 6: 88-93.
3. P o n c e - A l c u i c i r a E., T a y l o r A. Extraction and ESI-CID-Ms/Ms analysis of myoglobins from different meat species. Food Sci. Techn. Tod., 2000, 69, 1: 81-86.
4. Ч е р н я е в а М.Н. Анализ видовой принадлежности мяса и мясопродуктов. Ветеринария, 2001, 6: 47-50.
5. R o g e r s N.L., C o l e S.A., L a n H.C., C r o s s a A., D e m e r a t h E.W. New saliva DNA collection method compared to buccal cell collection techniques for epidemiological studies. Am. J. Hum. Biol., 2007, 19: 319-326.
6. S m i t h L.M., B u r g o y n e L.A. Collecting, archiving and processing DNA from wildlife samples using FTA(R) databasing paper. BMC Ecol., 2004, 4: 4-14.
7. W o l f C., R e n t s c h J., H u b n e r P. PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: a reliable method for species identification. J. Agric. Food Chem., 1999, 47: 1350-1355.
8. N s u b u g a A.M., R o b b i n s M.M., R o e d e r A.D. e.a. Factors affecting the amount of genomic DNA extracted from ape faeces and the identification of an improved sample storage method. Mol. Ecol., 2004, 13: 2089-2094.
9. P a r s o n W., P e g o r a r o K., N i e d e r s t ä t t e r H., F ö g e r M., S t e i n l ec h n e r M. Species identification by means of the cytochrome b gene. Int. J. Legal Med., 114(1-2): 23-28.
10. O n o K., S a t o h M., Y o s h i d a T., O z a w a Y., K o h a r a A., T a k e u c h i M., M i z u s a w a H., S a w a d a H. Species identification of animal cells by nested PCR targeted to mitochondrial DNA. In Vitro Cell. Dev. Biol.—Animal, 2007, 43: 168-175.
11. 3 и н о в ь е в а H.A., П о п о в А.Н., Э р н с т Л.К., М а р з а н о в Н.С., Б о ч к ар е в В.В., С т р е к о з о в Н.И., Б р е м Г. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. Дубровицы, 1998.
ГНУ Всероссийский НИИ животноводства Поступила в редакцию
Россельхозакадемии, 3 октября 2011 года
142132 Московская обл., Подольский р-н, пос. Дубровицы, e-mail: konoval-elena@yandex.ru
MULTIPLEX DNA IDENTIFICATION OF SPECIES ORIGIN OF MEAT PRODUCTS
E.N. Konovalova, E.A Gladyr', N.A Zinovieva S u m m a r y
The test-system based on multiplex PCR applied for simultaneous identification of pig (Sus scrofa), cow (Bos taurus) and chicken (Gallus gallus) DNA in milled muscle tissue samples was developed. The high sensitivity and specificity of species origin determination of components in structure of mixed samples using developed method was shown (the detection efficiency of species specific DNA in animal samples of the relevant species and in mixed samples was similar). The application of developed test-system for origin identification of different food products including heat treated products (cow milk, cottage cheese, boiled beef, beef liver paste, beef and chicken bouillon, raw pork, beef and pork minced meat mixture, baked and bloated chicken, cheese and sausage) was shown.
Вниманию читателей! Вышла в свет книга:
Состояние всемирных генетических ресурсов животных в сфере продовольствия и сельского хозяйства. Пер. с англ. ФАО, 2010; М.: ВИЖ РАСХН, 2010, 512 с. [FAO, 2007. The state of the world's animal genetic resources for food and agriculture /Barbara Rischkow-sky & Dafydd Pilling (eds.), Rome].
Издано Продовольственной и сельскохозяйственной организацией Объединенных Наций (ФАО) и Всероссийским НИИ животноводства Россельхозакадемии. Настоящее издание представляет собой первую попытгку глобальной оценки состояния и тенденций, происходящих с генетическими ресурсами животныгх, а также организации структурной и технологической базы управления этими ресурсами. Это обеспечивает основу для возобновления действий, гарантирующих реализацию намеченный шагов по улучшению управления генетическими ресурсами, объявленных на Мировом форуме по выработке планов действий в области продовольствия (World Food Summit Plan of Action). Оно также является определенным достижением в работе Комиссии по генетическим ресурсам для продовольствия и сельского хозяйства. Книга включает разделы «Состояние сельскохозяйственного биоразнообразия в секторе животноводства» (происхождение и формирование разнообразия домашних животных, статус генетических ресурсов животныгх, потоки генетических ресурсов животных, значение и использование генетических ресурсов животных, генетические ресурсы животных и их резистентность к заболеваниям, угрозы существующему генетическому разнообразию животных), «Направления в секторе животноводства» (движущие силы1 изменений в животноводстве, реакции животноводческого сектора, значение изменений в секторе животноводства для генетического разнообразия), «Возможности управления генетическими ресурсами животныгх» (организации и заинтересованные стороны, структурированные селекционные программы, программы сохранения, репродуктивные и молекулярные биотехнологии, законодательство и нормативно-правовое регулирование), «Современное состояние управления генетическими ресурсами животныгх» (основные понятия, методы описания, молекулярные маркеры — инструмент исследования генетического разнообразия, методы генетического улучшения для поддержания устойчивого использования генетических ресурсов животныгх, методы экономической оценки, методы сохранения, приоритеты исследований), «Необходимость и задачи управления генетическими ресурсами животныгх» (сведения о генетическом разнообразии животныгх: концепции, методы и технологии, возможности управления генетическими ресурсами животныгх, основные проблемы развития животноводства и управления генетическими ресурсами животныгх, принятие всеобщей ответственности).
Новые книги
К л и м о в А.Ф., А к а е в с к и й А.И. Анатомия домашних животных. 8-е изд. М.: изд-во «Ланы», 2011, 1040 с.
Учебник выщержал несколыко переизданий и длителыное время оставался единственным руководством для ветеринарныгх высших учебный заведений. Посмертные издания учебника быгли подготовлены соавтором А.Ф. Климова профессором А. И. Ака-
евским. Разделы «Система органов крово- и лимфообращения», главы «Нервная система» и «Система органов чувств» написаны профессором А.И. Акаевским. Настоящее репринтное издание этого учебного пособия свидетелыст-вует о том, что книга до сих пор не утратила своей актуалыности и является фундамен-талыной работой в области анатомии домашних животныгх.
