CC BY
32
УДК 575.17:599.735.51
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ВИДОВ СЕМЕЙСТВА БЫЧЬИХ НА ПРИМЕРЕ BOS TAURUS, BISON BONASUS
И BISON BISON
В.И. ГЛАЗКО, Г.М. ЖЕЛОНКИНА, Т.П. СИПКО, А.В. КУШНИР, Т.Т. ГЛАЗКО
(Центр нанотехнологий РГАУ - МСХА имени К.А. Тимиря зева)
С использованием разных типов молекуля рно-генетических маркеров полиморфизма участков ДНК (белки, анонимные последовательности ДНК) выполнен сравнительный анализ генетических структур групп зубров, бизонов и крупного рогатого скота. Обнаружены выраженные отличия оценок сходства между видами в зависимости от используемых маркеров. Наблюдается достаточно высокий средний уровень полиморфизма по исследованным маркерам у рассмотренных групп животных.
Ключевые слова: генетическая структура; электрофоретические варианты белков; ДНК-маркеры; фрагменты ДНК, фланкированные короткими инвертированными повторами.
Мы живем в период начала осознания человечеством глобального экологического кризиса. Уже получены первые экспериментальные свидетельства глобальных изменений растительного и животного видового состава биосферы, связанных с изменением климата. Скорость исчезновени видов под антропогенным вли нием приобрела размеры глобальной экологической катастрофы. Это затронуло и современное сельское хозяйство, которое переживает влия ние двух
качественно новых факторов — очевидное увеличение техногенного за-гря знения, а также изменение традиций использования генофондов с.-х. видов растений и животных. Для того чтобы приблизиться к пониманию генетического своеобразия с.-х. видов животных, необходимо сравнить их с близкородственными дикими видами.
С этой целью в настоя щей работе выполнен сравнительный анализ генетических структур трех видов, имеющих общего предка и принадлежащих к семейству бычьих (Bovinae), — серого украинского скота (Bos taurus),
зубра (Bison bonasus) и американского бизона (Bison bison). В качестве молекул рно генетических маркеров полиморфизма различных участков генома использовали оценки полиморфизма р да структурных генов и фрагментов анонимной ДНК, фланкированных инвертированными повторами р да микросателлитных локусов (ISSR-PCR). Сравнительный анализ полиморфизма повторов ДНК широко используетс дл оценки генетической дифференциации между различными таксонами [2, 5-8]. Предполагает-с , что полиморфизм повторов ДНК преимущественно «нейтрален» по отношению к событи м эволюционного ранга. Как правило, современные генетико-филогенетические иссле-довани выполн ютс с использованием маркеров повторенной ДНК (мини-, микросателлитные локусы; RAPD-PCR, ISSR). В этой свя зи был проведен сравнительный анализ участи в генетической дифференциации полиморфизма различных типов молекуля рно-генетических маркеров (белки, RAPD-PCR, ISSR-PCR)
Материалы и методы
Материалом исследований служили образцы крови (эритроциты, плазма) животных двух групп серого украинского скота: экспериментального хозяйства «Черга» Алтайского края (п=30) и хозя йства «Маркеево» Херсонской обл. (п=34); американского бизона (п=10)*, воспроизводя щегося в биосферном заповеднике «Аскания-Нова», а также зубров (п=40) Беловежской Пущи.
С использованием методов электрофоретического разделени белков в крахмальном и полиакриламидном гелях с последующим гистохимическим окрашиванием был проанализирован полиморфизм 30 генетикобиохимических систем [2]. Электрофоретический анализ белков плазмы крови проводили в 11%-м разделя ю-щем полиакриламидном геле. Белковые фракции окрашивали 1%-м раствором красител Кумасси прочный голубой G-250. Подсчитывали долю полиморфных локусов и ожидаемую среднюю гетерозиготность по стандартным формулам.
При анализе полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированным повтором случайной последовательности в 10 нуклеотидов (метод КАРБ-РСК), использовали два праймера, первичная последовательность которых была представлена в работе [3]: ивс-85: 5’-атастсатас-з! и иВС-126: 5’СТТТСатаСТ-3’. Ам-плифицировались участки ДНК, заключенные между последовательно-стя ми, комплементарными пря мому и инвертированному варианту каждого праймера.
При анализе полиморфизма фрагментов ДНК по методу ТББК-рСК в качестве праймеров использовали фрагменты разных микросателлитных локусов [8]. В результате амплифици-ровались участки ДНК, заключенные между инвертированными повторами
микросателлитных локусов. Рассмотрены спектры продуктов амплификации, полученных при использовании в качестве праймеров участков ДНК со следующими нуклеотидными последовательностями: (AGC)6G, (CTC)6C, GA)9C и (AG)9C. Продукты амплификации идентифицировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия в ультрафиолетовом свете. Рассматривались только те продукты амплификации, которые воспроизводились в 3-5 независимо повторенных PCR-процедурах с ДНК одних и тех же животных. Для определени размеров продуктов амплификации на каждом блоке с двух сторон использовали маркер моле-куля рных весов 100 п.о. DNA Ladder Gibco BRL.
Результаты и их обсуждение
Анализ полиморфизма биохимических маркеров
Серая украинская порода крупного рогатого скота вместе с другими родственными и сходными с ней породами, разводимыми в Южной Европе, Юго-Западной Азии и Северной Африке, как уже отмечалось выше, представляет древнейш ую группу крупного рогатого скота, именуемую серым степным скотом. Это одна из наиболее древних пород, предположительно свя зывающих европейские породы крупного рогатого скота с дикими предковыми формами. Животным серой украинской породы свойственны такие качества, как исключительная приспособленность к местным условия м, крепость конституции, выносливость, высокая жизнеспособность, устойчивость к различным заболева-ни м.
Скрининг биохимических систем плазмы и эритроцитов крови вы вил у серой украинской породы генетический полиморфизм по 6 локусам:
* Образцы крови и органов были предоставлены к.б.н. Н.И. Ясинецкой.
амилаза-I (AM-I), церулоплазмин (CP), рецептор к витамину D (GC), пурин-нуклеозидфосфорилаза (NP), транс-феррин (TF) и посттрансферрин-2 (pTF-2). Наиболее полиморфным белком плазмы крови серого украинского скота я вля ется TF, в системе которого выя влено 5 аллелей: A, D1, D2, E и F. Если первые четыре аллеля типичны для европейских пород, то TF F характерен дл пород зебу и отсутствует у большинства европейских пород [4]. Преобладающим вл етс TF D2, наиболее редко встречается TF F. Ранее было высказано предположение, что эта породна группа сохранила в себе некоторые уникальные блоки генов, присущие предковой форме, и TF F может служить вероятным маркером таких генных комплексов. По локусу CP у серой украинской породы наблюдали три генотипа: AA, AB BB, наиболее часто встречаетс аллель A. При электрофоретическом анализе выя влено также три генотипа AM-I: BB, BC, CC, наиболее распространен AM-I B. Частота встречаемости медленного варианта В в системе GC значительно превышает частоту более быстрого варианта. Противоположна тенденци наблюдалась по локусу pTF — аллельный вариант А был преобладающим. По локусу NP более высока частота встречаемости характерна дл варианта с низкой активностью — NP L. По эритроцитарным ферментам у серой украинской породы выявлен полиморфизм по фосфоглюкомутазе, маннозофосфатизомеразе, карбоанги-дразе и щелочной фосфатазе.
Беловежская линия зубров происходит от пяти зубров беловежского подвида (Bison bonasus bonasus). После второй мировой войны лини вторично прошла через «бутылочное горлышко», в результате чего только 21 особь далее участвовала в восстановлении популяции зубров. Для беловежских зубров расчетна степень инбридинга в среднем составляет 0,324. Для этой группы зубров описано по вление
признаков вырождения (измельчание) и распространение различных заболеваний (бельмо, крипторхизм и пр.). По морфологическим признакам они укло-ня ются как от кавказско-беловежских, так и от зубров XIX века. [1]. Помимо этого, электрофоретические исследования зубров Беловежской пущи (Польша) по 69 локусам, по данным 1994 г., показали низкую степень гете-розиготности животных, равную 1,2%, что почти в 3 раза ниже аналогичных показателей для этого стада, полученных в 1987 г.
В исследованной нами группе зубров полиморфизм вы влен по системам C P, AM-I, ME (малик энзим), ICD (изоцитратдегидрогеназа), Pep B (пептидаза В) и PGM (фосфоглюкомутаза). Локус TF был мономорфен и имел сходство с TF А крупного рогатого скота, отличаясь несколько большей подвижностью мажорного компонента. По локусу PGM у зубра вы влены два аллельных варианта, обозначены как F (быстро мигрирующий) и S (медленно мигрирующий), других аллелей не обнаружено. У исследованных нами животных быстрый вариант встреча-етс с частотой 0,650.
В системе ICD у зубров преобладал более быстрый вариант по электрофоретической подвижности с частотой встречаемости 0,900. Дол гетерозигот по данному локусу составл ла 2%. При анализе полиморфизма PEP В у исследованных животных на электро-фореграмме наблюдали три фенотипа — Ff, FS и SS, которые кодируются двумя кодоминантными аутосомны-ми аллел ми F и S. Быстрый вариант был преобладающим (0,850). Быстро мигрирующий вариант более часто встречался и в системе МЕ (0,650). По данному локусу гетерозиготным был 1% животных. Полиморфизм у зубров по локусу МЕ, как и по локусу РЕР В, вы влен польскими исследовател ми у 35 беловежских зубров.
Таким образом, доля полиморфных локусов в выборке исследованных
зубров составила 17,13%, а средний уровень гетерозиготности (локус на особь) — 0,065, что несколько больше полученных ранее польскими исследователя ми оценок зубров беловежской линии, составивших 0,035. От пород крупного рогатого скота исследован-на группа зубров отличалась полиморфизмом по локусам малик энзима, изоцитратдегидрогеназы и мономорфизмом — локусов трансферрина, посттрансферрина 2, рецептора к витамину Б, пуриннуклеозидфосфори-лазы, маннозофосфатизомеразы, кар-боангидразы и щелочной фосфатазы.
Асканийское стадо бизонов существует с 1897 г. и за период до 1967 г., согласно данным В.Д. Треус (цит. по [1]), в зоопарк завезли 17 бизонов и получили 64 особи приплода. С 1967 по 1972 г. дополнительно завезено еще 12 особей, в т.ч. 4 самца и 8 самок. Сейчас в зоопарке Аскании-Нова содержится 36 особей бизона (8 самцов и 28 самок).
У американского бизона полиморфизм выя влен по локусам АМ-І, СР, РСМ, йРІ, РерВ и БР-1 (диа-фораза-1). Трансферрин у бизонов, как и у зубров, был инвариантен и по электрофоретической подвижности сходен с ТТ А крупного рогатого скота. Фермент диафораза в гомогенатах сердца бизонов на фореграммах был представлен тремя зонами. В зоне, расположенной ближе к аноду (БР-1), идентифицировали три типа диафоразы с различной электрофоретической подвижностью (быстро мигрирующий -----
ЕЕ, медленно мигрирующий — ББ, и тип ТБ, для которого характерно наличие двух зон). По данному локусу у бизонов преобладал медленный вариант с частотой встречаемости 0,600. Гетерозиготами были 40% животных.
Продукты другого полиморфного локуса — РСМ на электрофореграмме также были представлены спектрами пол ос, предполагающими кодоми-нантную экспрессию. Преобладающим был быстрый вариант (0,650). Гетеро-
зиготы составляли 30% всей выборки. Внутривидовой полиморфизм по электрофоретической подвижности с преобладанием быстрых вариантов наблюдался также по локусам GPI (глюкозофосфатизомераза) и СР. По локусу AM-I у бизона описаны А и В аллельные варианты. Уровень гетеро-зиготности по этому локусу составл л 30%. Частоты встречаемости двух аллельных вариантов — F и S в системе РЕР В у бизона были одинаковыми, вы влен высокий уровень гетерозигот-ности (80%). Доля полиморфных локусов у бизонов составила 17,1, средня я гетерозиготность — 0,071.
От пород крупного рогатого скота исследованна группа бизонов отличалась полиморфизмом по локусу глюкозофосфатизомеразы, диафо-разы-1 и мономорфизмом — локусов трансферрина, посттрансферрина 2, рецептора к витамину D, пуринну-клеозидфосфорилазы, маннозофосфатизомеразы, карбоангидразы и щелочной фосфатазы.
Таким образом, в общем, у пород крупного рогатого скота, зубров и бизонов из 30 исследованных выя влено 15 полиморфных генетикобиохимических систем. Полиморфизм 10 из них вы влен у крупного рогатого скота, шести — у зубров и шести — у бизонов. В выборки полиморфных систем у зубров и бизонов входили 4 разные системы — малик энзим, изоцитратдегидрогеназа (зубры), глю-козофосфатизомераза и диафораза-1 (бизоны) и 4 общие — церулоплазмин, амилаза-I, пептидаза В и фосфоглю-комутаза. Полиморфизм последних четырех систем обнаруживался и у крупного рогатого скота. Шесть систем — трансферрин, посттрансфер-рин-2, рецептор к витамину D, пурин-нуклеозидфосфорилаза, маннозофос-фатизомераза, карбоангидраза и щелочной фосфатаза были полиморфны только у крупного рогатого скота.
Относительно высокий уровень полиморфизма у изученных видов
позволя ет предположить действие в исследуемых группах животных механизмов, поддерживающих изменчивость по биохимическим маркерам.
Нами также был проведен сравнительный анализ электрофоретической подвижности группы ферментов у зубров, бизонов и у серого украинского скота. Между этими видами было обнаружено сходство по подвижности зон активности ферментов пентозо-фосфатного шунта (глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа — G-6-PD, 6-фосфоглюконатдегидрогеназа — 6-pGD), гликолиза (PGM, GPI), а также ICD (изоцитратдегидрогеназа), GOT (глутаматоксалацетаттрансами-наза) и PEP A (пептидаза А).
Наибольшие отличи вы влены по продуктам локуса малатдегироге-назы (MDH) — у бизона на электро-фореграммах зоны активности этого фермента отличались наибольшей электрофоретической подвижностью среди изученных видов.
Анализ полиморфизма маркеров RAPD-PCR
Размер ампликонов, вошедших в анализ при использовании маркера UBC-85 [3], находился в пределах 2,4-0,4 т.п.о. (тысяч пар оснований или kb — килобаз). Фрагменты длиной 0,5 и 0,6 kb были характерны только для зубра, фрагменты длиной 0,8 и 1,1 kb — только для крупного рогатого скота, 0,7 и 1,3 — для бизона. В общем, при использовании этого праймера у трех исследованных видов выя влено 14 ампликонов. Только 4 из них (длины 1,7; 1,8; 1,9; 2,0 kb) были общими для всех трех видов, три — дл крупного рогатого скота и дл бизонов (0,4; 1,5; 1,6 kb) и один — для крупного рогатого скота и дл зубров (2,4 kb). Шесть ампликонов обнаружены в спектрах только у одного из исследованных видов (по 2 у каждого вида). Следует отметить определенное сходство дифференциации видов по полиморфизму белковых маркеров и
по присутствию ампликонов в спектре иВС-85.
При использовании праймера ИВС-126 фрагменты длиной 0,5 и 1,8 кЬ встречались только у крупного рогатого скота, 0,7 кЬ — только у зубра. Из девяти ампликонов, выя вленных у трех видов, только один (1,9 кЬ) был общим; дл зубров и крупного рогатого скота — четыре (0,9; 1,0; 1,3; 1,4 кЬ), для бизонов и зубров — только один (2,3 кЬ). То есть, если суммарно по белковым маркерам зубры и бизоны оказывались более сходными друг с другом, то при использовании в качестве праймера одного декануклеотида (иВС-85) все три вида по спектру ампликонов дифференцировались примерно одинаково, при использовании другого праймера (ИВС-126) крупный рогатый скот и зубры имели более сходный спектр ампликонов, чем зубры и бизоны.
Анализ полиморфизма маркеров ¡ББЕ-РСЯ
Анализ спектров продуктов амплификации участков между инвертированными повторами микросател-литных локусов [8] позволил вы вить межвидовые различия и по этому типу молекул рно-генетических маркеров. На электрофореграммах продуктов амплификации идентифицировались 21 и 24 полосы для праймеров ^А)9С и (AG)9C соответственно. В общем, размер ампликонов, вошедших в анализ, находился в пределах 2-0,4 кЬ. Каждый продукт амплификации рассматривали как отдельный локус. У всех трех видов исследованных животных подсемейства Bovinae наблюдали общие продукты амплификации размером 1,0 и 1,6 кЬ при использовании праймера (AG)9C. При использовании в качестве праймера последовательности (AG)9C специфичными для крупного рогатого скота были фрагменты длиной 1,9 и 1,3 кЬ, для бизона — 2 кЬ, дл зубра видоспецифичных маркеров не вы влено (обедненный спектр
ампликонов). При применении этого праймера — (АО)9С — наиболее широкий спектр ампликонов среди исследованных видов подсемейства бычьих принадлежал бизону (14 фрагментов длиной от 1,9 до 0,4 кЬ). Количество продуктов амплификации крупного рогатого скота и зубра было 9 и 4 соответственно. Все ампликоны, выя вленные у зубра, были представлены в спектрах двух других видов.
Дл другого динуклеотидного праймера с последовательностью (ОА)9С наблюдалась несколько друга картина. Наиболее широкий спектр ампли-конов был представлен у крупного рогатого скота (8 фрагментов с длинами от 1,9 до 0,5 кЬ). В спектре амплико-нов (ОА)9С продукт амплификации размером 1,2 кЬ вы влен только у крупного рогатого скота, а у остальных видов отсутствует. Фрагмент длиной около 2 кЬ вы влен только у бизона. У зубра и бизона оказалось равное количество амплифи-цированных, но различающихс по длине фрагментов. Дл крупного рогатого скота и зубра наблюдались два общих ампликона — 1,6 и 0,5 кЬ. У крупного рогатого скота и бизона вы-влен один общий ампликон длиной 1,5 кЬ. Дл всех трех видов подсемейства бычьих общими вл лись два ампликона с длинами в 1,0 и 0,6 кЬ.
По тринуклеотидным праймерам ((А0С)60 и (СТС)6С) у представителей серой украинской получены спектры продуктов амплификации, которые включали по 16 фрагментов ДНК с длинами в 2600-550 п.о. и 3200-500 п.о. соответственно. Причем в спектре, полученном при использовании в качестве праймера (А0С)60, 4 фрагмента оказались полиморфными (отсутствовали у отдельных представителей породы), а в спектре продуктов второго праймера таких фрагментов было 15.
То есть, как и в случае анализа продуктов амплификации ИАРБ-РСИ, оценка внутрипородного, породного полиморфизма, так же как и межви-
довой дифференциации, существенно варьирует в зависимости от используемого праймера, от анализируемого ампликона определенной длины.
Очевидно, что высокий уровень полиморфизма маркеров ИАРБ-РСИ, ТББК-РСК удобен и, по-видимому, незаменим при решении проблем генетической паспортизации отдельных животных внутри вида, но может приводить к определенным ошибкам при межвидовых сравнениях. Так, нами были выполнены сравнени генетических структур крупного рогатого скота, зубра и бизона по распределению продуктов амплификации, суммарно полученных при использовании праймеров ^А)9С и (AG)9C. Каждая зона была обозначена как один локус (в пор дке увеличени их молекул рной массы). Ее присутствие обозначалось как аллельный вариант А этого ло-куса, отсутствие — как аллельный вариант В. При анализе генетических взаимоотношений между серой украинской породой, зубром и бизоном, более близким к крупному рогатому скоту, оказался зубр. Анализ же белкового полиморфизма однозначно свидетельствует о большей генетической близости между зубром и бизоном, чем между ними и крупным рогатым скотом, прежде всего в связи с присутствием у первых по отдельным ло-кусам (например, трансферрину, пу-риннуклеозидфосфорилазе) аллельных вариантов, отличающихся по электрофоретическим характеристикам от типичных дл крупного рогатого скота.
То есть «анонимность» продуктов амплификации, высокий уровень их полиморфизма, качественно разные оценки межвидовых взаимоотношений, получаемые при использовании разных праймеров, не позволя ют ожидать, что применение в генетико-таксономических исследовани х маркеров ДНК, основанных на повторенных нуклеотидных последовательност х, позволит решить традиционные вопросы о межвидовых взаимоотноше-
ни х, скорост х эволюции и т.д. более успешно, чем при анализе белкового полиморфизма. По-види мому, и в случае ДНК-маркеров, так же как и генетико-биохимических систем, необходима индивидуальна оценка информативности и эффективности использовани отдельных маркеров дл решени конкретных задач.
Заключение
Различия в оценках генетической дифференциации между тремя видами — зубрами, бизонами и крупным ро-
гатым скотом — качественно варьируют от маркера к маркеру вне зависимости от их типа — определяются ли эти маркеры полиморфизмом ДНК-повторов, либо электрофоретическими вариантами белков. Необходимо отметить, что, судя по результатам выполненных исследований, в изученных группах животных видов Bovin ae, по-видимому, действуют механизмы, способствующие поддержанию генетического внутривидового разнообразия, несмотря на ограниченное количество родителей (зубр, бизон) и факторы искусственного отбора (породы крупного рогатого скота).
Библиографический список
1. Руденко Ф.А., Семашко В.Ю., Сипко Т.П. Полорогие. М.: ООО «Издательство Астрель», 2003.
2. Харченко П.Н., Глазко В.И. ДНК-технологии в развитии агробиологии / под ред. член-корр. Б.Ф. Ванюшина. М.: Воскресенье, 2006.
3. Bailey E, Lear T.L. Comparison of thoroughbred and Arabian horses using RAPD markers // Anim Genet., 1994. Vol. 25 Suppl 1. P. 05-108.
4. Baker C.M.A.,Manwell C. «Fircely feral»: on the survival of domesticates without care from man // Z. Tierzucht. Zucht. biol., 1981. Bd. 98. S. 241-257.
5. Caetano-Anolles G. MAAP: a versatile and universal tool for genome analysis// Plant Molecular Biology, 1994. Vol. 25. P. 1011-1026.
6. Caetano-Anolles G. Scanning of nucleic acids by in vitro amplification: New developments and applications // Nature Biotechnology, 1996. Vol. 14. P. 1668-1674.
7. Toth G., Gaspari Z., Jurka J. Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis // Genome Research, 2000. Vol. 10. P. 417-432.
8. Zietkiewicz E. , Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by seguence repeat (SSR) — anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics, 1994. 20. P. 176-183.
Рецензент — д. с.-х. н. Ю.С. Юлдашбаев
SUMMARY
With the use of different types of molecular genetic markers of polymorphism of different DNA regions (proteins, anonymous sequences of DNA) the comparative analysis of genetic structures of groups of Bos taurus, Bison bonasus and Bison bison was carried out. The expressed differences of estimations of similarity between species, depending on used markers were found out. High average level of polymorphism on the investigated markers in the considered groups of animals was observed.
Key words: genetic structure; electrophoretic protein variants; DNA markers; DNA fragments, flanking by inverted short repeats.
