CC BY
51
i в мире науки |
Генетическое разнообразие белорусской популяции европейского зубра
УДК: 577.21:575.17:599.735.5(476)
На пороге третьего тысячелетия человечество озабочено формированием новой стратегии и тактики устойчивого развития. Большое и обоснованное внимание в них уделяется сохранению живой природы. В этой связи несомненным приоритетом должны стать редкие и исчезающие виды растений и животных, занесенные в Красную книгу. В отношении некоторых из них необходимы дополнительные специальные меры по охране и восстановлению, сформулированные в государственных документах комплексного характера, к числу которых относятся и стратегии по сохранению видов [1].
мариямихайлова,
заведующая лабораторией генетики животных Института генетики и цитологии НАН Беларуси, кандидат биологических наук
юлия медведева,
аспирант лаборатории генетики животных Института генетики и цитологии НАН Беларуси
Алексей Буневич,
ведущий научный сотрудник НП «Беловежская пуща», кандидат биологических наук
Европейский (беловежский) зубр (Bison bonasus L.) - единственный дикий вид подсемейства бычьих (Bovinae) Европы, уцелевший до наших дней. Исчезновение зубра в дикой природе было вызвано причинами антропогенного характера: уничтожением местообитаний (вырубка и выжигание лесов, преобразование лесных массивов в сельскохозяйственные угодья) и неограниченной охотой. Последние дикие популяции вида (беловежская и западно-кавказская) были уничтожены в начале XX в. Потребовалось около 70 лет разведения - сначала в зоологических садах и специализированных питомниках, позже в природе - для того чтобы увеличить численность мирового стада с 48 (1927 г.) животных до 3810 (1993 г.) [2].
Восстановление численности зубра, несомненно, наиболее показательный пример эффективной международной деятельности по спасению вида, истребленного в дикой природе.
Одной из основных задач при сохранении и воспроизводстве редких видов является оценка генетического разнообразия разводимых в неволе групп животных. Это связано с тем, что в них, как правило, наблюдается снижение генетической изменчивости, которое вызвано не только малым числом животных-основателей, но и произвольным подбором пар и выбраковкой потомства. Подобная практика приводит к повышению уровня инбридинга, распространению в популяциях рецессивных аллелей и, как следствие, потере редких ценных комбинаций генов, вызывая снижение общей жизнеспособности и плодовитости зубров [3]. Генетическая природа инбридинга до конца еще не выяснена.
Родственное скрещивание не увеличивает числа рецессивных аллелей в популяции, но позволяет им проявиться путем повышения гомозиготности [4]. Обычно в скрытом состоянии находится много рецессивных генов. Инбридинг, сопровождаемый отбором, может способствовать
увеличению генотипического единообразия среди животных.
Большинство генетиков объясняют инбридинг ростом гомозиготности доминантных (положительный эффект) и рецессивных (отрицательный эффект) генов. В неродственных популяциях рецессивные аллели подавляются доминантными аллелями и не проявляются. Также по мере возрастания гомозиготности вредные последствия могут возникать за счет сверхдоминирования (превосходства гете-розигот над гомозиготами), так как число гетерозигот уменьшается [4]. Инбридинг может стать причиной большего проявления гомозиготности из-за воздействия как положительных, так и нейтральных генов.
Еще С.С. Четвериков показал, что генетический груз в популяции никуда не исчезает. Он лишь накапливается из поколения в поколение и тем разрушает чистую генетическую линию [5]. Таким образом, последствия инбридинга не всегда были явными и очевидными. Еще Дарвин писал: «Трудно обнаружить дурные результаты близкого родственного спаривания, так как они медленно накапливаются и значительно различаются у различных видов, между тем как хорошие результаты, большей частью сопровождающие скрещивание в неизменном виде, выясняются всего ранее...» Н. Кулешов, резюмируя основные выводы по вопросу о кровном спаривании животных, приводит интересный пример успешного существования на некоторых островах видов животных, где кровное смешивание существовало многие годы и не отразилось на их судьбе: английский исследователь Джеймс Кук, как известно, оставил пару кроликов на островах По-
научная публикация
линезии, которые размножились и стали главным бичом для земледельцев [6].
Для оценки генетического разнообразия широко применяют различные методы маркирования генома. К их числу относят генетико-биохимические, RAPD-, ISSR-, STR-методы, а также изучение полиморфизма кодирующих последовательностей генома [3, 7, 8]. Наиболее перспективным приемом в этой связи является анализ ДНК-микросателлитов (STR), высоко полиморфный характер и менделеевский тип наследования которых делает их идеальными ДНК-маркерами в геноме животных.
STR-маркеры известны под несколькими названиями: микросателлиты, STMS (sequence tagged microsattelite site), SSR (simple sequence repeat) [9]. Для их создания подбираются праймеры к уникальным последовательностям ДНК, фланкирующим микросателлитный повтор, что требует предварительного знания их нуклеотидной последовательности. Полиморфизм STR определяется различным количеством копий мономерных единиц в кластере, что приводит к существованию множественных аллельных вариантов. Гетерозиготность их очень высока (часто более 75%). При создании новых полиморфных маркеров, кроме динуклеотидов, используются микросателлиты три- и тетрамерных мотивов, значительная часть которых также высокогетерозиготна.
Микросателлитный анализ является традиционным методом для описания генетической структуры и оценки генетической изменчивости природных и искусственно поддерживаемых популяций животных.
В данном исследовании для описания и сравнения генетической изменчивости в искусственно разводимых популяциях копытных мы использовали микроса-теллитные локусы, рекомендованные Международным обществом генетики животных (ISAG/FAO, 2004) для генетической паспортизации крупного рогатого скота (КРС): TGLA53, INRA23, TGLA227, BM1824, TGLA126, ETH225 [10].
В качестве объекта исследования были выбраны популяции двух видов копытных подсемейства Bovinae: европейский зубр (Bison bonasus), разводимый на территории Беларуси в Национальном парке
«Беловежская пуща», и крупный рогатый скот отечественных животноводческих комплексов. Целью настоящей работы является сравнение полиморфизма микросателлитных локусов ДНК европейского зубра и быка домашнего для последующей оценки генетической структуры данных близкородственных видов.
Были проанализированы выборки из популяций представителей подсемейства бычьих (Bovinae) - европейский зубр (Bison bonasus, n = 48) из свободноживущей популяции НП «Беловежская пуща» и бык домашний (Bos taurus, n = 50). Для анализа использованы образцы свежезамороженной спермы и крови коров и быков черно-пестрой породы, принадлежащих животноводческим комплексам Минской области, и фрагменты ткани зубров.
Выделение ДНК проводилось методом солевой экстракции по стандартной методике [11].
Полимеразную цепную реакцию осуществляли в 20 мкл смеси, содержащей 5-10 нг геномной ДНК, по 10 пикоМ каждого прай-мера, 50 mM MgCl2, 4 тМ dNTP, 10х ПЦР-буфера, 1,7 ед Taq-полимеразы (Праймтех, Беларусь). Амплификация осуществлялась на автоматическом программируемом термоциклере фирмы Biometra (Германия) при следующих температурных условиях: 94 0С - 5 мин.; 35 циклов: 95 0С - 45 сек., 50 0С - 45 сек., 72 0С - 30 сек.; 72 0С - 7 мин.
[10]. Продукты реакции визуализировались на секвенаторе с помощью программного обеспечения ALFwin Software.
В качестве критериев оценки генетической структуры использовали следующие показатели: ожидаемая гомо- и гетерозиготность локусов (Exp Hom, Exp Het), среднее генетическое разнообразие внутри популяции (Hs), коэффициент инбридинга особи относительно популяции (Fis) [12].
Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения POPGEN 1.31.
Оценка полиморфизма микросателлиных локусов беловежского зубра показала, что из исследованных микросателлитных локусов один (TGLA227) оказался мономорфным с аллелем 89 пн, другие изученные локусы - полиморфные с числом аллелей от 2 (BM1824) до 4 (TGLA53) (табл. 1). В своем исследовании микро-сателлитных локусов польской популяции европейского зубра B. Gralak (2004) также выявила мономорфный характер локуса TGLA227, но с аллелем 74 пн [12].
Для всех полиморфных локусов рассчитывались ожидаемая гомо- и гетерозигот-ность. Среднее значение гетерозиготно-сти составило 0,3912 ± 0,2326, гомозигот-ности - 0,6088 ± 0,2326.
Из исследуемых локусов мы выявили 16 аллелей у зубра и 56 у быка домашнего. Размеры локусов зубра приблизительно
№5(99) Май 2011 НАУКА И ИННОВАЦИИ 61
в мире науки
Таблица 1. Полиморфизм микросателлитных локусов Bison bonasus
Локус Аллель Частота аллеля Гетерози-готность (Exp Het) Гомозигот- ность (Exp Hom)
TGLA53 143 149 145 139 0,4479 0,2812 0,1458 0,1250 0.6906 0.3094
INRA23 190 192 198 194 0,7604 0,1354 0,0417 0,0208 0.4046 0.5954
ETH225 166 168 0,5833 0,4167 0.4912 0.5088
TGLA227 89 1,0 0.0 1.0
BM1824 186 188 0,6250 0,3750 0.4737 0.5263
TGLA126 108 104 106 0,8333 0,1458 0,0208 0.2868 0.7132
Среднее 0,3912 (±0,2326) 0,6088 (±0,2326)
Таблица 2. Генетический полиморфизм и оценка генетического разнообразия в популяциях European bison и Bos taurus, полученные на основании анализа вариабельности микросателлитных локусов
Локус Hs Fis
European bison
TGLA53 0,6834 0,1829
INRA23 0,4004 0,8886
ETH225 0,4861 0,7429
TGLA227
BM1824 0,4685 0,4667
TGLA126 0,2839 0,4713
Среднее 0,4645 (±0,1458) 0,5504 (±0,2737)
Bos taurus
TGLA53 0,8777 0,2866
INRA23 0,7687 0,1174
ETH225 0,5312 0,3235
TGLA227 0,80 0,1912
BM1824 0,8520 0,090
TGLA126 0,7674 0,2338
Среднее
0,7662 (±0,123)
0,2070 (±0,0922)
такие же, как у тех же локусов КРС. Однако по локусу BM1824 у данных видов совпало всего два аллеля - 186 и 188 пн. Некоторые другие аллели отличаются только на 1 пару оснований, и высока вероятность, что это одни и те же аллели. Наши предположения могут быть подтверждены после секвени-рования изучаемых участков ДНК.
Сравнение количества аллелей двух представителей семейства бычьих отражает очень низкую генетическую вариабельность популяции беловежского зубра. Это усиливается и высоким уровнем го-мозиготности, то есть количество аллелей мало и большинство из них находится в гомозиготном состоянии (табл. 1).
Расчет индекса фиксации Fis показал, что в каждой группе данный индекс имеет положительное значение, что указывает на нехватку (дефицит) гетерозигот (табл. 2). Положительные значения индекса Fis можно расценивать как признак несбалансированности исследуемых групп животных по числу гетерозигот. С другой стороны, для вида Bos taurus эти значения далеки от единицы (0,09-0,32), поэтому можно утверждать, что в данной группе имеется достаточный резерв гетерозиготности для избегания тесного инбридинга. Показатели же индекса Fis для вида Bison bonasus
Примечание. Hs - среднее генетическое разнообразие популяции, Fis -- коэффициент инбридинга особи относительно популяции
(0,18-0,88) говорят об угрожающе высоком уровне инбридинга популяции (табл. 2).
Средние значения индекса № у зубра и быка домашнего (0,4645 и 0,7662 соответственно) свидетельствуют о том, что степень родства между особями в стаде зубров гораздо выше, чем в стаде КРС.
Наблюдаемое снижение генетической из-
менчивости может быть вызвано тесным инбридингом и эффектом основателя [3]. Известно, что вся мировая популяция произошла от 12 диких зубров. За все время существования европейской популяции по крайней мере 2 раза наблюдалось резкое колебание численности, и поэтому для сохранения генофонда зубра было предложено их независимое разведение отдельными линиями. Вследствие такой практики все разводимые линии зубра оказались высокоинбредными [3].
Сопоставляя показатели генетического разнообразия и уровня инбридинга - как по отдельным STR-маркерам, так и по сумме маркеров, - мы можем утверждать, что по сравнению с КРС популяция зубра характеризуется низкими показателями генетического разнообразия и высокими индексами инбридинга. Получение потомства от таких родителей может усилить отрицательный эффект близкородственного скрещивания, поэтому для генетико-селекционной работы с зубрами обязательно должна проводиться предварительная молекулярная паспортизация животных.
Наше исследование подтверждает, что микросателлитные маркеры, разработанные для генетической паспортизации КРС, могут успешно использоваться для характеристики генетической структуры белорусской популяции европейского зубра.
Литература
1. Флинт В.Е., Белоусова И.П., Прерва В.И. Стратегия сохранения зубра в России. - М., 2002.
2. Электронный ресурс: http://www.wwf.ru/data/publ/zubr.pdf.
3. Семенова С.К., Васильев В.А. ДНК-фингерпринтинг и генетическое разнообразие европейского зубра (Bison bonasus), американского бизона (Bison bison) и серого украинского скота (Bos taurus) // Генетика. 2000. Т. 36, №11. С. 1535-1545.
4. Топалов Ф.Г. Основы генетики и разведения домашнего скота. - М., 2004.
5. Кашкаров Е.П. Почему краевым популяциям не грозит вымирание от инбридинга? // Р1ТМ. №1, 2009. С. 71-80.
6. Кулагин Н. Зубр Беловежской пущи. - М., 1919.
7. Luenser K. Low level of genetic variability in European bisons (Bison bonasus) from the Bialowieza National Park in Poland. -Leibniz-Institute for Zoo- and Wildlife Research, 2005. P. 84-87
8. Gralak B. Polymorphism of bovine microsatellite DNA sequences in the lowland European bison / Acta Theriologia. №49. P. 449-456.
9. Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения / ИО-Ген им. Н.И. Вавилова РАН / Электронный журнал // 2004.
10. Михайлова М.Е. Методические рекомендации по проведению генетической экспертизы крупного рогатого скота с помощью микросателлитного анализа. - Мн., 2010.
11. Зиновьева Н.А., Гладырь Е.А., Эрнст Л.К., Брем Г. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных. - Дубровицы, 2002.
12. Гончаренко Г.Г., Падутов В.Е. Популяционная и эволюционная генетика елей палеарктики . - Гомель, 2001.
