CC BY
25
ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ ПИТАНИЯ
Для корреспонденции
Медведев Илья Николаевич - доктор медицинских наук, доктор биологических наук, профессор, заслуженный изобретатель РФ, профессор кафедры социальной работы, культуры и социального права Курского института социального образования (филиал) ФГБОУ ВПО «Российский государственный социальный университет» Адрес: 305035, г. Курск, ул. Пирогова, д. 12Б Телефон: (4712) 70-83-00 E-mail: [email protected]
И.Н. Медведев
Динамика нарушений внутрисосудистой активности тромбоцитов у крыс в ходе формирования метаболического синдрома с помощью фруктозной модели
#
Dynamics of violations of intravascular platelet activity in rats during the formation of metabolic syndrome using fructose models
I.N. Medvedev
Курский институт социального образования (филиал) ФГБОУ ВПО «Российский государственный социальный университет» Kursk Institute of Social Education (Branch) of Russian State Social University
Цель исследования - проследить в условиях экспериментального формирования метаболического синдрома процесс развития нарушений внутрисосудистой активности тромбоцитов. В исследование включена 61 крыса-самец линии Вистар в возрасте 2,5-3 мес. Животные разделены на 2 группы: 32 крысы получали в свободном доступе в качестве питья 10% раствор фруктозы в течение 8 нед; 29 крыс составили группу контроля. Концентрацию общего холестерина, холестерина липопротеинов высокой плотности и триглицеридов определяли энзиматическим колориметрическим способом. В плазме крови определяли содержание эндотелина-1 радиоиммунологическим методом, тромбоксана В2 и 6-кетопростагландина F1a - иммуно-ферментным методом. В крови выявляли суммарное содержание метаболитов оксида азота. Состояние внутрисосудистой активности тромбоцитов оценивали с помощью фазово-контрастного микроскопа. В условиях фруктозной нагрузки у крыс одновременно с нарастанием массы тела и развитием биохимических нарушений, свойственных для метаболического синдрома, наблюдалось выраженное прогрессирующее повышение внутрисосудистой активности тромбоцитов [понижение количества дискоцитов с 81,0±0,1 до 61,3±0,2%, нарастание числа активных форм кровяных пластинок с 19,0±0,1 до 38,7±0,2%, увеличение числа свободно перемещающихся по крови малых агрегатов с 2,4±0,0 до 14,6±0,1 на 100 свободных тромбоцитов, а средних и крупных агрегатов (из 4 клеток и более) -с 0,1±0,03 до 2,3±0,06 на 100 свободных тромбоцитов] во многом за счет нарастания (р<0,01) синтеза тромбоксана В2 (со 145,9±0,2 до 232,6±0,7 пг/мл), эндотелина-1 (с 6,9±0,2 до 12,5±0,4 пг/мл)
42
#
И.Н. Медведев
и снижения (р<0,01) генерации 6-кетопростагландин F1a (с 75,9±0,2 до 62,3±0,4 пг/мл) и суммарного количества метаболитов оксида азота (с 27,9±0,3 до 23,2±0,1 мкмоль/л).
Ключевые слова: крысы, фруктоза, метаболический синдром, тромбоциты, внутрисосудистая активность
Objective: to trace the development of disorders intravascular platelet activity in experimental form of the metabolic syndrome. The study included 61 rat male Wistar rats at the age of 2.5-3 months. Animals were divided into 2 groups: 32 rats were given free access to drink 10% solution of fructose for 8 weeks and 29 rats were the control group. The level of the total cholesterol, high density lipoprotein cholesterol (HDLD cholesterol) and triglycerides were determined using colorimetric enzymatic method. The blood plasma content of endothelin-1 was determined by radioimmunoassay, thromboxane B2 and 6-keto-prostaglandin F1a - by ELISA. The total content of nitrogen oxide metabolites was revealed in blood. Intravascular platelet activity was assessed using phase contrast microscopy. In terms of fructose load in rats simultaneously with the increase of body weight and the development of biochemical disorders that are characteristic for the metabolic syndrome, there comes a marked progressive increase in intravascular platelet activity [reduction of the number of discocytes from 81.0±0.1 to 61.3±0.2%, increase in the number of reactive platelets from 19.0±0.1 to 38.7±0.2%, an increase in the number of freely moving in the blood of small units from 2.4±0.0 to 14.6±0.1 per 100 free platelets, and of medium and large units (from 4 or more cells) from 0.1±0.03 to 2.3±0.06 per 100 free platelets], largely due to the increase (p<0.01) of the synthesis of thromboxane B2 (from 145.9±0.2 to 232.6±0.7 pg/ml), endothelin-1 (from 6.9±0.2 to 12.5±0.4 pg/ml) and reduction (p<0.01) of the generation of 6-keto-prostaglandin F1a (from 75.9±0.2 to 62.3±0.4 pg/ml), and the total amount of nitric oxide metabolites (from 27.9±0.3 to 23.2±0.1 mmol/l).
Keywords: rats, fructose, metabolic syndrome, platelets, coagulation activity
Функционирование гемостаза во многом обеспечивается оптимумом тромбоцитарной активности [1, 2]. Большая роль в этом принадлежит состоянию внутрисосудистой активности тромбоцитов, зависящей от множества влияний среды [3].
Проведенные ранее работы по различным направлениям физиологии тромбоцитарной активности сформировали современные представления о механизмах ее регуляции при различной патологии [4, 5] и пролили свет на ее динамику при изолированной артериальной гипертонии(АГ)и ее сочетаниях с различными обменными нарушениями [3, 6, 7], в том числе с метаболическим синдромом [1, 8, 9]. Стало ясно, что именно свойственный для АГ при метаболическом синдроме повышенный уровень активности тромбоцитов во многом обеспечивает высокую частоту тромботических явлений [10]. С целью ослабления проявлений тромбоцитопатии и сведений к минимому риска тромбозов при АГ с метаболическим синдромом были проведены серьезные экспериментальные
и клинические наблюдения по оценке отдельных механизмов ее развития [2, 3, 11]. Вместе с тем особенности ранних изменений тромбоцитарной активности in vivo в дебюте формирования метаболического синдрома нельзя считать окончательно выясненными. Невозможность до конца проследить этот процесс на человеке ввиду выпадения лиц с первыми признаками метаболического синдрома из поля зрения клиницистов диктует острую потребность проведения экспериментальных исследований на лабораторных животных с моделированием у них метаболического синдрома [12]. Именно эти сведения способны послужить основой для последующих клинических исследований, направленных на уточнение патогенетически оправданного момента начала коррекционных воздействий у лиц с ранними признаками метаболического синдрома. В связи с этим целью исследования было проследить в условиях экспериментального формирования метаболического синдрома процесс развития нарушений внутрисосудистой активности тромбоцитов.
43
#
Материал и методы
В исследование включена 61 крыса-самец линии Вистар в возрасте 2,5-3 мес, полученные от здоровых самок первым-вторым пометом. Масса тела животных на момент взятия в исследование составляла 261,1±1,18 г, длина окружности живота -14,7±0,26 см. До исследования все крысы не участвовали ни в каких экспериментах и не переносили никаких заболеваний. Случайным образом все животные были разделены на 2 группы: 32 крысы основной группы получали в свободном доступе в качестве питья 10% раствор фруктозы [12], а 29 крыс составили группу контроля. Эксперимент продолжался 8 нед. Кровь у экспериментальных животных брали из хвостовой вены в исходный момент, через 2, 4, 6 и 8 нед фруктозной нагрузки. Животных из группы контроля обследовали двукратно: в исходный момент и в возрасте 4,5-5 мес, т.е. одновременно с окончанием наблюдения за экспериментальными крысами. Ввиду отсутствия статистически значимых различий между результатами двух обследований контрольных крыс полученные данные представлены одной цифрой - их средней арифметической.
Массу тела животных определяли путем взвешивания на лабораторных весах. Длину окружности живота выясняли путем измерения его охвата на уровне середины туловища, выражая в сантиметрах. Концентрацию общего холестерина (ОХС) и триглицеридов (ТГ) определяли при помощи энзиматического колориметрического способа с использованием набора (ООО «Витал Диагнос-тикум», РФ). Содержание в плазме холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП) определяли при помощи набора (ООО «Ольвекс Диагностикум», РФ) энзиматическим колориметрическим способом. Концентрацию холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС ЛПНП) устанавливали расчетным путем. Концентрацию холестерина липопротеинов очень низкой плотности (ХС ЛПОНП) вычисляли, используя формулу:
ХС ЛПОНП = концентрация ТГ/2,2.
Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в жидкой части крови оценивали по количеству содержащихся в ней тиобарбитуровая кислота (ТБК)-активных продуктов с помощью набора (ООО «Агат-Мед», РФ) и по содержанию ацилгидроперекисей (АГП) с учетом уровня антиокислительной активности (АОА) крови [13]. В плазме крови определяли содержание эндоте-лина-1 радиоиммунологическим методом с помощью реактивов фирмы «DRG» (США), а также уровни тромбоксана В2 и 6-кетопростагландина F1a путем иммуноферментного анализа при помощи наборов («Enzo Life science», США). В крови крыс
выявляли суммарное содержание метаболитов оксида азота [14]. Состояние внутрисосудистой активности тромбоцитов оценивали с помощью фазово-контрастного микроскопа [15].
Результаты обрабатывали статистически с использованием критерия (t) Стьюдента.
Результаты
Изначально нормальная масса тела животных основной группы уже спустя 2 нед эксперимента имела тенденцию к росту, а начиная с 4 нед ее увеличение достигло уровня статистической значимости (см. таблицу). Окружность живота так же увеличивалась на фоне потребления фруктозы с питьевой водой (см. таблицу).
У включенных в эксперимент крыс, получавших фруктозу, уже спустя 2 нед в липидном составе плазмы плазмы появилась тенденция к ухудшению, а через 4 нед отрицательная динамика достигла уровня достоверности, что в последующем прогрессивно усугублялось. При этом уже через 2 нед экспериментального воздействия у крыс отмечено достоверное понижение АОА плазмы при нарастании в ней АГП и ТБК-активных продуктов, продолжавшееся в течение всего срока потребления животными фруктозы (см. таблицу).
Оптимальная на момент начала эксперимента концентрация метаболитов арахидоновой кислоты в плазме у крыс, получавших фруктозу, быстро изменялась - уже через 4 нед эксперимента найден дисбаланс метаболитов, достигший своего максимума к 8 нед: уровень тромбоксана В2 возрос на 37,3% при понижении концентрации 6-кетопростаглан-дина F1a на 21,8%. Это сопровождалось у наблюдаемых крыс нарастанием уровня эндотелина-1 до 12,5±0,36 пг/мл и понижением суммарного количества метаболитов оксида азота на 20,2% (см. таблицу).
При создании у крыс с помощью фруктозной модели метаболического синдрома уже через 2 нед отмечена тенденция к усилению внутрисосудистой активности тромбоцитов, динамика которой стала достоверной через 4 нед нагрузки фруктозой и испытывала дополнительное повышение в течение всего наблюдения. Это привело к 8 нед эксперимента к понижению количества дискоцитов до 61,3±0,2% и нарастанию числа активных форм кровяных пластинок до 38,7±0,2%. На протяжении 8 нед эксперимента число свободно перемещающихся по крови животных малых агрегатов в 6,1 раза, а средних и крупных агрегатов -в 23 раза значимо увеличилось. К моменту окончания эксперимента количество тромбоцитов в агрегатах в их крови превышало контроль на 80,6%.
Таким образом, в экспериментальных условиях фруктозной нагрузки выяснено, что одновременно с нарастанием массы тела и развитием биохими-
44
#
И.Н. Медведев
Динамика морфометрических, биохимических и гематологических показателей у крыс, получавших раствор фруктозы в свободном доступе (М±т)
#
Показатель Опытная группа (л=32) Контрольная группа, (я=29)
исходное состояние 2 нед нагрузки фруктозой 4 нед нагрузки фруктозой 6 нед нагрузки фруктозой 8 нед нагрузки фруктозой
Масса тела, г 262,1 ±1,2 268,5±1,1 276,3±1,2 р<0,05 283,4±1,3 р<0,01 296,6±1,3 р<0,01 260,1 ±1,12
Окружность живота, см 14,7±0,2 15,1 ±0,3 15,8±0,1 р<0,05 16,4±0,2 р<0,01 17,2±0,2 р<0,01 14,8±0,3
ОХС, ммоль/л 2,19±0,06 2,30±0,09 2,54±0,07 р<0,01 2,79±0,05 р<0,01 2,92±0,03 р<0,01 2,22±0,06
ХС ЛПВП, ммоль/л 1,12±0,05 1,06±0,04 1,01±0,00 р<0,05 0,96±0,00 р<0,01 0,94±0,01 р<0,01 1,10±0,00
ХС ЛПНП, ммоль/л 0,59±0,04 0,67±0,05 р<0,05 0,82±0,07 р<0,01 1,09±0,08 р<0,01 1,15±0,04 р<0,01 0,63±0,02
ХС ЛПОНП, ммоль/л 0,48±0,003 0,57±0,06 р<0,05 0,71 ±0,05 р<0,01 0,78±0,01 р<0,01 0,83±0,00 р<0,01 0,49±0,00
ТГ, ммоль/л 1,05±0,05 1,26±0,06 р<0,05 1,56±0,04 р<0,01 1,72±0,03 р<0,01 1,83±0,02 р<0,01 1,08±0,04
АГП, Д233/1 мл 1,37±0,12 1,64±0,06 р<0,05 1,97±0,07 р<0,01 2,50±0,05 р<0,01 2,85±0,04 р<0,01 1,41 ±0,03
ТБК-продукты, мкмоль/л 2,27±0,06 2,83±0,06 р<0,05 3,39±0,09 р<0,01 3,98±0,07 р<0,01 4,48±0,08 р<0,01 2,30±0,04
АОА, % 29,2±0,05 27,6±0,08 26,0±0,08 р<0,05 24,6±0,06 р<0,01 22,4±0,05 р<0,01 29,7±0,04
Тромбоксан В2, пг/мл 145,9±0,2 168,7±0,5 184,7±0,6 р<0,01 208,1 ±0,4 р<0,01 232,6±0,7 р<0,01 148,1 ±0,3
6-кетопростагландин Р1а, пг/мл 75,9±0,2 72,4±0,3 69,6±0,3 р<0,05 65,4±0,4 р<0,01 62,3±0,4 р<0,01 76,5±0,2
Метаболиты N0, мкмоль/л 27,9±0,3 27,1 ±0,2 26,4±0,1 р<0,05 24,7±0,2 р<0,01 23,2±0,1 р<0,01 28,5±0,3
Эндотелин-1, пг/мл 6,9±0,2 8,2±0,2 р<0,05 10,1±0,3 р<0,01 11,4±0,3 р<0,01 12,5±0,4 р<0,01 6,8±0,2
Количество дискоцитов, % 81,0 ±0,1 78,8±0,1 72,5±0,2 р<0,01 65,0±0,2 р<0,01 61,3±0,2 р<0,01 80,4±0,2
Базальное количество диско-эхиноцитов, % 14,5±0,1 15,5±0,1 р<0,05 17,3±0,1 р<0,01 21,7±0,1 р<0,01 21,0±0,1 р<0,01 15,2±0,1
Количество сфероцитов, % 2,3±0,1 2,9±0,1 5,6±0,1 р<0,01 7,9±0,1 р<0,01 10,9±0,1 р<0,01 2,2 ±0,1
Количество сферо-эхиноцитов, % 1,7±0,1 2,2±0,1 р<0,05 3,8±0,1 р<0,01 4,4±0,1 р<0,01 5,5±0,1 р<0,01 1,6±0,1
Суммарное количество активированных тромбоцитов, % 19,0±0,1 21,2±0,2 27,5±0,2 р<0,01 35,0±0,2 р<0,01 38,7±0,2 р<0,01 19,6±0,1
Количество тромбоцитов в агрегатах, % 6,3±0,1 6,9±0,1 р<0,05 8,5±0,1 р<0,01 9,9±0,1 р<0,01 11,2±0,1 р<0,01 6,2±0,1
Количество агрегатов малых размеров, по 2-3 тромбоцита на 100 свободных тромбоцитов 2,4±0,0 3,8±0,1 р<0,01 7,4±0,1 р<0,01 11,2±0,1 р<0,01 14,6±0,1 р<0,01 2,3±0,0
Количество средних и больших тромбоцитных агрегатов из 4 клеток и более на 100 свободных тромбоцитов 0,1±0,03 0,8±0,04 р<0,05 1,3±0,02 р<0,01 1,8±0,03 р<0,01 2,3±0,06 р<0,01 0,1 ±0,02
Ф
П р и м е ч а н и е. р - достоверность отличий показателя у опытных крыс от величин контроля.
Вопросы питания. Том 85, № 1, 2016 45
ческих нарушений, свойственных для метаболического синдрома, возникает быстро углубляющееся усиление внутрисосудистой активности тромбоци-
тов, во многом связанное с понижением в крови уровня простациклина и NO и нарастанием уровня тромбоксана, эндотелина-1 и продуктов ПОЛ.
Литература
#
Громнацкий Н.И., Медведев И.Н. Коррекция нарушений тромбо- 8. цитарного гемостаза немедикаментозными средствами у больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом // Клин. мед. 2003. Т. 81, № 4. С. 31-34. 9.
Симоненко В.Б., Медведев И.Н., Толмачев В.В. Динамика активности первичного гемостаза у больных артериальной гипертонией при метаболическом синдроме на фоне лечения кандесар-таном // Клин. мед. 2011. Т. 89, № 3. С. 35-38. 10.
Симоненко В.Б., Медведев И.Н., Носова Т.Ю. Агрегационная функция тромбоцитов у лиц с артериальной гипертонией с абдоминальным ожирением // Клин. мед. 2008. Т. 86, № 5. 11. С. 22-24.
Кутафина Н.В., Медведев И.Н. Тромбоцитарная агрегация у клинически здоровых лиц второго зрелого возраста, прожива- 12. ющих в Курском регионе // Успехи геронтологии. 2015. Т. 28, № 2. С. 321-325.
Медведев И.Н., Лапшина Е.В., Завалишина С.Ю. Активность тромбоцитарного гемостаза у детей с искривлениями позвоноч- 13. ника // Бюл. экспер. биол. 2010. № 5. С. 579-580. Медведев И.Н., Скорятина И.А. Влияние ловастатина на адгезив-но-агрегационную функцию тромбоцитов у больных артериаль- 14. ной гипертонией с дислипидемией // Клин. мед. 2010. Т. 88, № 2. С. 38-40.
Симоненко В.Б., Медведев И.Н., Гамолина О.В. Активность 15. первичного гемостаза у больных артериальной гипертонией с нарушением толерантности к глюкозе на фоне применения трандолаприла // Клин. мед. 2011. Т. 89, № 2. С. 29-31.
Медведев И.Н., Громнацкий Н.И. Воздействие небиволола на агрегацию тромбоцитов больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом // Клин. мед. 2005. Т. 83, № 3. С. 31-33. Медведев И.Н. Сравнительный анализ влияния нормодипина и спираприла на внутрисосудистую активность тромбоцитов у больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом // Тер. арх. 2007. Т. 79, № 10. С. 25-27. Симоненко В.Б., Медведев И.Н., Кумова Т.В. Патогенетические аспекты артериальной гипертонии при метаболическом синдроме // Воен.-мед. журн. 2010. Т. 331, № 9. С. 41-44. Медведев И.Н. Коррекция первичного гемостаза у больных артериальной гипертонией при метаболическом синдроме // Клин. мед. 2007. Т. 85, № 3. С. 29-33.
Решетняк М.В., Хирмаков В.Н., Зыбина Н.Н., Фролова М.В. и др. Модель метаболического синдрома, вызванного кормлением фруктозой: патологические взаимосвязи обменных нарушений // Мед. акад. журн. 2011. Т. 11, № 3. С. 23-27. Волчегорский И.А., Долгушин И.И., Колесников О.Л., Цейликман В.Э. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма. Челябинск, 2000. 167с. Метельская В.А., Гуманова Н.Г. Оксид азота: роль в регуляции биологических функций, методы определения в крови человека // Лаб. мед. 2005. № 7. С. 19-24.
Завалишина С.Ю., Краснова Е.Г., Медведев И.Н. Методические вопросы исследования функциональной активности тромбоцитов при различных состояния // В мире науч. открытий. 2012. № 2. С. 145-147.
References
Gromnatskiy N.I., Medvedev I.N. Non-pharmacological correction 8. of impaired platelet hemostasis in hypertensive patients with metabolic syndrome. Klinicheskaya medicina [Clinical Medicine]. 2003; Vol. 81 (4): 31-4. (in Russian)
Simonenko V.B., Medvedev I.N., Tolmachev V.V. Dynamics of primary 9. hemostasis activity in patients with arterial hypertension and metabolic syndrome treated with candesartan. Klinicheskaya medicina [Clinical Medicine]. 2011; Vol. 89 (3): 35-8. (in Russian) Simonenko V.B., Medvedev I.N., Nosova T.Yu. Aggreation function 10. of platelets in persons with arterial hypertension and abdominal obesity. Klinicheskaya medicina [Clinical Medicine]. 2008; Vol. 86 (5): 22-4. (in Russian) 11.
Kutafina N.V., Medvedev I.N. Platelet aggregation clinically healthy persons of the second coming of age living in the Kursk region. Uspehi gerontologii [Advances in Gerontology] 2015; Vol. 28 (2): 12. 321-5. (in Russian)
Medvedev I.N., Lapshina E.V., Zavalishina S.Yu. Experimental methods for clinical practice: Activity of platelet hemostasis in children with spinal deformities. Byulleten' eksperimental'noy biologii i mediciny [Bulletin of Experimental Biology and Medicine]. 2010; 13. Vol. 5: 579-80. (in Russian)
Medvedev I.N., Skoryatina I.A. Effect of lovastatin on adhesive and aggregation function of platelets in patients with arterial hyperten- 14. sion and dyslipidemia. Klinicheskaya medicina [Clinical Medicine]. 2010; Vol. 88 (2): 38-40. (in Russian)
Simonenko V.B., Medvedev I.N., Gamolina O.V. Primary hemostasis 15. activity in patients with arterial hypertension and impaired glucose tolerance treated with trandolapril. Klinicheskaya medicina [Clinical Medicine]. 2011; Vol. 89 (2): 29-31. (in Russian)
Medvedev I.N., Gromnatskii N.I. The influence of nebivolol on thrombocyte aggregation in patients with arterial hypertension with metabolic syndrome. Klinicheskaya medicina [Clinical Medicine]. 2005; Vol. 83 (3): 31-3. (in Russian)
Medvedev I.N. A comparative analysis of normodipin and spirapril effects on intravascular activity of platelets in patients with metabolic syndrome. Terapevticheskij arhiv [Therapeutic Archive]. 2007; Vol. 79 (10): 25-7. (in Russian)
Simonenko V.B., Medvedev I.N., Kumova T.V. Pathogenetic aspects of hypertension in case of metabolic syndrome. Voenno-medicinskij zhurnal. 2010; Vol. 331 (9): 41-44. (in Russian) Medvedev I.N. Correction of primary hemostasis in patients suffering from arterial hypertension with metabolic syndrome. Klinicheskaya medicina [Clinical Medicine]. 2007; Vol. 85 (3): 29-33. (in Russian) Reshetnyak M.V., Khirmakov V.N., Zybina N.N., Frolova M.V. et al. The model of the metabolic syndrome, caused by feeding fructose: pathologic correlation of metabolic disorders. Medicinskij aka-demicheskij zhurnal [Medical Academic Journal]. 2011; Vol. 11 (3): 23-7. (in Russian)
Volchegorskiy I.A., Dolgushin 1.1., Kolesnikov O.L., Cejlikman V.Je. Experimental modeling and laboratory evaluation of adaptive reactions. Cheljabinsk, 2000: 167 p. (in Russian) Metel'skaja V.A., Gumanova N.G. Nitric oxide: role in the regulation of biological functions, methods of determining human blood. Laboratornaya medicina [Laboratory Medicine]. 2005; Vol. 7: 19-24. (in Russian) Zavalishina S.Yu., Krasnova E.G., Medvedev I.N. Methodological aspects of research of platelet functional activity in various state. V mire nauchnykh otkrytiy [In the World of Scientific Discoveries]. 2012; Vol. 2: 145-147. (in Russian)
46
2.
3.
4
5
6
7
2.
3.
5
6
7
