CC BY
69
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE.
2021. No. 2
УДК 579.843.1:57.083,13:579.843.2
doi 10.18522/1026-2237-2021-2-119-125
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ШТАММОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА ОТ МИКРООРГАНИЗМОВ - ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА AEROMONAS С ПОМОЩЬЮ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ «АРГИНИН - ЖЕЛЕЗО - САХАРОЗНЫЙ АГАР»
© 2021 г. А.Б. Мазрухо1, Д.И. Каминский1, В.В. Лобанов1, Д.В. Соков1, И.В. Архангельская1, М.И. Ежова1, Д.А. Левченко1, М.М. Сагакянц1
1Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, Ростов-на-Дону, Россия
DIFFERENTIATION OF CHOLERA VIBRYO STRAINS FROM MICROORGANISMS -REPRESENTATIVES OF THE GENUS AEROMONAS USING THE NUTRITIONAL MEDIUM "ARGININE-IRON-SUGAR AGAR"
A.B. Mazrukho1, D.I. Kaminsky1, V.V. Lobanov1, D.V. Sokov1, I.V. Arkhangelskaya1, M.I. Ezhova1, D.A. Levchenko1, M.M. Sagakyants1
1Rostov-on-Don Anti-Plague Institute, Rospotrebnadzor, Rostov-on-Don, Russia
Мазрухо Алексей Борисович - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник, лаборатория питательных сред, Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, Россия, e-mail:plague@aaanet.ru
Alexey B. Mazrukho - Candidate of Medicine, Leading Researcher, Laboratory of Nutrient Media, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute, Rospotrebnadzor, Gorkogo St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: plague@aaanet.ru
Каминский Денис Игоревич - научный сотрудник, лаборатория питательных сред, Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, Россия, e-mail: plague@aaanet. ru
Denis I. Kaminsky - Researcher, Laboratory of Nutrient Media, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute, Rospotrebnadzor, Gorkogo St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: plague@aaanet.ru
Лобанов Владимир Владимирович - доктор медицинских наук, старший научный сотрудник, лаборатория питательных сред, Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, Россия, e-mail: plague@aaanet.ru
Vladimir V. Lobanov - Doctor of Medicine, Senior Researcher, Laboratory of Nutrient Media, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute, Rospotrebnadzor, Gorkogo St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: plague@aaanet.ru
Соков Дмитрий Владимирович - младший научный сотрудник, лаборатория питательных сред, Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, Россия, e-mail: plague@aaanet.ru
Dmitry V. Sokov - Junior Researcher, Laboratory of Nutrient Media, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute, Rospotreb-nadzor, Gorkogo St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: plague@aaanet.ru
Архангельская Ирина Викторовна - кандидат медицинских наук, научный сотрудник, лаборатория микробиологии холеры, Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, Россия, e-mail: plague@aaanet.ru
Irina V. Arkhangelskaya - Candidate of Medicine, Researcher, Laboratory of Cholera Microbiology, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute, Rospotrebnadzor, Gorkogo St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: plague@aaanet.ru
Ежова Мария Ивановна - научный сотрудник, лаборатория микробиологии холеры, Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, Россия, e-mail: plague@aaanet.ru
Maria I. Ezhova - Researcher, Laboratory of Cholera Microbiology, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute, Rospotrebnad-zor, Gorkogo St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, email: plague@aaanet.ru
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE.
2021. No. 2
Левченко Дарья Александровна - кандидат медицинских Darya A. Levchenko - Candidate of Medicine, Senior Re-
наук, старший научный сотрудник, лаборатория микробиологии холеры, Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, Россия, e-mail: plague@aaanet.ru
Сагакянц Маргарита Мартиросовна - младший научный сотрудник, музей живых культур, Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, Россия, e-mail: plague@aaanet.ru
searcher, Laboratory of Cholera Microbiology, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute, Rospotrebnadzor, Gorkogo St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: plague@aaanet.ru
Margarita M. Sagakyants - Junior Researcher, Museum of Living Cultures, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute, Rospotrebnadzor, Gorkogo St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: plague@aaanet.ru
Проведено исследование возможности использования разработанной питательной среды «Аргинин - железо - сахарозный агар» для дифференциации штаммов холерного вибриона различного происхождения от микроорганизмов - представителей рода Aeromonas. Полученные результаты позволяют рассматривать применение данной среды как перспективное направление решения проблемы дифференциации штаммов V. cholerae от близкородственных аэромонад на этапах отбора подозрительных колоний со щелочного агара, дифференциальных агаризованных сред типа TCBS и отбора культур для дальнейшей идентификации. Разработанная среда может быть рекомендована для бактериологических лабораторий территориального уровня, проводящих мониторинговые исследования на холеру.
Ключевые слова: холерный вибрион, аэромонады, питательные среды, первичная идентификация.
The study of the possibility of using the developed nutrient medium "Arginine-iron-sucrose agar" for the differentiation of Vibrio cholerae strains of various origins from microorganisms of the genus Aeromonas was carried out. The results obtained allow us to consider the use of this medium as a promising direction for solving the problem of differentiation of V. cholerae strains from closely related aeromonads at the stages of selecting suspicious colonies from alkaline agar and differential agarized media of the TCBS type and selecting cultures for further identification. The developed environment can be recommended for bacteriological laboratories at the territorial level conducting monitoring studies for cholera.
Keywords: Vibrio cholerae, aeromonads, culture media, primary identification.
Введение
Регламентированная действующими МУК 4.2.2218-07 [1] схема лабораторного исследования на холеру предусматривает использование на IV (отбор подозрительных на холерный вибрион колоний в посевах на плотные среды нативного материала, а также в высевах из 1-й и 2-й сред накопления) и V (отбор культур для идентификации) этапах полиуглеводных сред. Среди них наиболее широкое применение нашли среды лактозо-, маннозо-сахарозная, а также классические полиуглеводные [2-4]. В основе отбора подозрительных колоний с помощью этих сред для последующей идентификации лежат способность вибрионов ферментировать глюкозу и сахарозу со сдвигом рН среды в кислую сторону вследствие накопления молочной, янтарной и уксусной кислот [5] без газообразования, отсутствие способности к ферментации лактозы и продукции сероводорода. Недостатком всех применяемых в лабораторной диагностике холеры полиуглеводных сред является отсутствие возможности отбора с их помощью подозрительных колоний по какому-либо специфическому критерию, при-
сущему исключительно роду Vibrio. В этом аспекте невозможна дифференциация с помощью полиуглеводных сред колоний микроорганизмов рода Vibrio от представителей близкородственных глю-козо- и сахарозопозитивных микроорганизмов (например, рода Aeromonas) [6-10]. Наряду с полиуглеводными средами для отбора культур с целью их последующей идентификации в арсенале лабораторий территориального уровня имеются также сыворотки холерные диагностические для слайд-агглютинации и тесты на оксидазу. Однако используемые для слайд-агглютинации поликлональные иммунные сыворотки могут вступать в перекрестные реакции с гетерологичными микроорганизмами [11], а оксидазоположительными являются не только штаммы, относящиеся к роду Vibrio, но и близкородственные микроорганизмы, например, рода Aeromonas [12], которые достаточно широко распространены в воде поверхностных водоёмов, сточных водах и донных отложениях [8]. При исследовании видового состава микробиоценоза поверхностных водоёмов г. Ростова-на-Дону (реки Дон и Темерник) была выявлена круглогодичная циркуляция аэромонад; их обнаружение в тёплое
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE.
время года шло совместно с V. cholerae non O1/non O139 [6]. В Вислинском заливе во все сезоны доминировали условно-патогенные бактерии родов Aeromonas и Pseudomonas [13].
Представители рода Aeromonas близки к микроорганизмам рода Vibrio по метаболизму, экологической нише, условиям существования; характеризуются морфологически сходными с вибрионами колониями на щелочном агаре. Аэромонады, как и штаммы вибрионов, обладают способностью ферментировать сахарозу, вследствие чего образуют сходные жёлтые колонии на селективно-дифференциальных средах типа СЭДХ и TCBS. В результате для последующей идентификации зачастую отбирают культуры сахарозопозитивных микроорганизмов, не всегда относящихся к роду Vibrio, например штаммы микроорганизмов рода Aeromonas. Это увеличивает объём исследований на следующем, VI этапе лабораторной диагностики холеры.
Предлагаемая нами вместо полиуглеводных сред питательная среда «Аргинин - железо - сахарозный агар» способна выявлять сразу два значимых признака принадлежности штаммов, формирующих подозрительные колонии, к микроорганизмам рода Vibrio (ферментация сахарозы и отсутствие дегидролазы аргинина). Также она позволяет отличить их от аэромонад, которые обладают способностью ферментировать аргинин. Использование разработанной среды позволит повысить эффективность отбора подозрительных колоний, что сократит объём исследований на следующем этапе -при идентификации выделенных культур.
Предлагаемая питательная среда может быть использована при исследовании материалов из объектов окружающей среды и от людей.
Цель настоящей работы - изучение дифференцирующих свойств питательной среды «Аргинин -железо - сахарозный агар» в отношении различных штаммов холерного вибриона и микроорганизмов -представителей рода Aeromonas.
Материалы и методы
В исследовании использованы 19 штаммов холерного вибриона из коллекции Музея живых культур ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора:
1. V. cholerae O1 classical P-1 (145) Inaba (dx+, tcp+), тест-штамм для контроля питательных сред.
2. V. cholerae О1 El Tor М-878 (с&+, tcp+), тест-штамм для контроля питательных сред.
3. V. cholerae О1 El Tor 90 (19764) Ogawa (ссtx-, tcp-), выделен из р. Дон (Ростов-на-Дону) в 2015 г.
4. V. cholerae О1 El Tor 16078 Ogawa {сХ+), выделен от больного.
2021. No. 2
5. V. cholerae Ol El Tor 19923 Ogawa (ctx+, tcp-), выделен из р. Темерник (Ростов-на-Дону) в 2016 г.
6. V. cholerae Ol El Tor 19925 Ogawa (ctx-, tcp-), выделен из р. Темерник (Ростов-на-Дону) в 2016 г.
7. V. cholerae O1 El Tor Ogawa 18983 (ctx-, tcp-), выделен из р. Мацеста (Сочи) в 2007 г.
8. V. cholerae O1 El Tor Ogawa 18984 (ctx-, tcp-), выделен из р. Агура (Сочи) в 2007 г.
9. V. cholerae O1 El Tor Ogawa 19813 (ctx-, tcp-), выделен от больного на Украине, Донецкая область, Мариуполь, в 1998 г.
10. V. cholerae O139 MO45 (16077) (ctx+, tcp+), выделен из поверхностного водоёма в Индии в 1991 г.
11. V. cholerae О139 16063 (ctx+, tcp+), выделен от больного в Ростове-на-Дону в 1993 г.
12. V. cholerae О139 16064 (ctx+, tcp+), выделен от больного в Ростове-на-Дону в 1993 г.
13. V. cholerae О139 16065 (ctx+, tcp+), выделен от больного в Ростове-на-Дону в 1993 г.
14. V. cholerae О139 17788 (ctx-, tcp-), выделен из р. Обь в 1998 г.
15. V. cholerae О139 17916 (ctx-, tcp-), выделен из р. Элистинка (Элиста) в 1999 г.
16. V. cholerae О139 17919 (ctx-, tcp-), выделен из р. Дон (Ростов-на-Дону) в 1999 г.
17. V. cholerae О139 18954 (ctx-, tcp-), выделен из р. Москва (Москва) в 2006 г.
18. V. cholerae non O1/ non O139 Р-9741 (ctx-, tcp-) - тест-штамм для контроля питательных сред.
19. V. cholerae non O1/ non O139 О62 2810/291 (16002) (ctx+, tcp+), выделен от больного в Узбекистане в 1971 г.
Для оценки дифференцирующих свойств опытной и контрольной сред отобраны 5 штаммов микроорганизмов - представителей рода Aeromonas из коллекции Музея живых культур ФКУЗ Ростов-ский-на-Дону противочумный институт Роспо-требнадзора: A. caviae P-6020, A. caviae P-6048, A. caviae P-6051, A. hydrophila P-6052, A. veronii P-6096. Эти штаммы выделены из объектов окружающей среды.
Опытная среда «Аргинин - железо - сахарозный агар» имела следующий состав, г/л:
- пептон сухой ферментативный (ГОСТ 1380576), 1,0;
- натрий хлористый ЧДА (ГОСТ 4233-77), 5,0;
- L-аргинин солянокислый ЧДА (ТУ 6-09-210078), 13,0;
- сахароза ЧДА (ГОСТ 5833-75, изм. 3), 1,0;
- натрий серноватистокислый 5-водный ЧДА (ГОСТ 27068-86), 0,3;
- соль закиси железа и аммония двойная сернокислая 6-водная (соль Мора) ЧДА (ГОСТ 4208-72, изм. 2), 0,2;
- калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный ЧДА (ГОСТ 2493-75, изм. 2), 0,3;
- агар-агар микробиологический (ГОСТ 1720696), 12,0;
- бромтимоловый синий водорастворимый ЧДА (ТУ 6-09-07-1602-87), 0,03 (в виде 1,6%-го спиртового раствора, 1,88 мл);
- крезоловый красный водорастворимый ЧДА (ТУ 6-09-769-76), 0,005 (в виде 0,1%-го спиртового раствора, 5 мл);
- вода дистиллированная (ГОСТ 6709-72), до 1,0 л;
- рН среды 6,7.
В качестве контрольных питательных сред использовали два набора реагентов для бактериологических исследований: «Питательная среда для идентификации энтеробактерий сухая» («Агар Клиглера-ГРМ»), ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, регистрационное удостоверение № ФСР 2007/00968 от 13.10.2011, серия 396, годен до 06.2021; «Среда Гисса-ГРМ с сахарозой», ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, регистрационное удостоверение № ФСР 2008/03494 от 13.10.2011, серия О18-К-2, годна до 06.2021), а также питательную среду «Де-карбоксилазный бульон Мёллера с аргинином», HiMedia Ltd., Индия, каталожный номер M689-100G, серия 0000371105, годен до 31.12.2023. Каждую питательную среду готовили по инструкции производителя.
Подготовку культур к исследованию осуществляли следующим методом. Штаммы V. cholerae, A. hydrophila, A. caviae, A. veronii, хранящиеся на 0,3%-м агаре Мартена рН 7,8, высевали в пробирки с 5 мл 1%-й пептонной воды рН 7,8 или бульона Мартена (мясо-пептонного бульона) рН 7,8 и инкубировали при температуре (37±1) °С в течение 35 ч, после чего осуществляли высев культуры с поверхности среды бактериологической петлей № 2 на чашки с агаром Мартена рН 7,8 для получения изолированных колоний (I пассаж). Через 18-20 ч культивирования при (37± 1) °С с поверхности агара отбирали типичные по морфологии колонии холерного вибриона, аэромонад и пересевали их бактериологической петлёй № 2 на чашки с агаром Мартена рН 7,8, инкубировали при температуре (37±1) °С в течение 3-5 ч (II пассаж), затем использовали для посева на опытную и контрольные питательные среды.
Посев каждого штамма на опытную и контрольные среды с агаровых пластинок после II пассажа проводили бактериологической петлей № 2. На «Аргинин - железо - сахарозный агар» рассевали по одной полной петле культуры сначала на скошенную часть, затем уколом в «столбик» среды (в
пробирке). Используемые в настоящей работе культуры микроорганизмов засевали на контрольные питательные среды («Агар Клиглера-ГРМ», «Среда Гисса-ГРМ с сахарозой», «Декарбоксилаз-ный бульон Мёллера с аргинином») согласно инструкции по применению для каждой из них.
Посевы на опытной и контрольных средах инкубировали при температуре (37±1) °С в течение 24 ч, по истечении которых проводили учёт результатов. Оценивали дифференцирующие свойства опытной и контрольных сред в отношении отобранных для исследования штаммов V. ско!егае и аэромонад.
Статистическую обработку результатов проводили путём определения коэффициента вариации исследуемого показателя в повторных экспериментах в соответствии с рекомендациями Л.С. Каминского [14]. При этом результат определения качественного показателя «дифференцирующие свойства», соответствующий нормативу на опытную и контрольные среды, выражали цифрой 1 (один). Отклонение указанного показателя от норматива обозначали как 0 (ноль).
Результаты и обсуждение
Проведенное исследование, результаты которого представлены в таблице, продемонстрировало, что использование питательной среды «Аргинин - железо - сахарозный агар» позволяет достоверно дифференцировать штаммы холерного вибриона от штаммов - представителей рода Аегошопа5 по признаку ферментации аргинина. Все использованные штаммы холерного вибриона O1 и не O1/не O139 серо-групп вызывали изменение цвета скошенной части и «столбика» опытной среды (в пробирках) от исходного зелёного в жёлтый при температуре 37 °С за 24 ч. Это свидетельствует о том, что данные штаммы ферментируют сахарозу с образованием кислых продуктов, не обладают дегидролазой аргинина и не образуют сероводород. Все взятые в опыт водные штаммы V. еЪо1егае O139 через 24 ч культивирования при температуре 37 °С вызывали не столь значительное пожелтение скошенной части и «столбика» опытной среды (цвет был жёлто-зелёным), как штамм V. еЪо1егае O139 16064, изолированный от больного (цвет всей среды - жёлтый). Подобный феномен обнаружен нами впервые и не выявлялся ни на какой другой известной питательной среде для идентификации холерного вибриона по признакам ферментации углеводов и аминокислот. Это может свидетельствовать о более низком уровне ферментативной активности водных штаммов холерного вибриона О139 серовара в отношении сахарозы по сравнению со штаммами, выделенными от людей.
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2021. No. 2
Результаты изучения дифференцирующих свойств опытной и контрольных питательных сред в отношении штаммов холерного вибриона и аэромонад (время культивирования - 24 ч) / Results of studying the differentiating properties of experimental and control nutrient media in relation to strains of Vibrio cholerae and aeromonads (cultivation time - 24 hours)
Микроорганизм Опытная среда «Аргинин - железо -сахарозный агар» Контрольные питательные среды
Агар Клиглера-ГРМ Среда Гисса-ГРМ с сахарозой Декарбоксилазный бульон Мёллера с аргинином
Скошенная часть Столбик Скошенная часть Столбик
V. cholerae O1 (Classical и El Tor) - 9 штаммов Жёлтый Жёлтый Красный Жёлтый Жёлтый Жёлтый
V. cholerae O139 (выделены из водных источников) -5 штаммов Жёлто-зелёный Жёлто-зелёный Красный Жёлтый Жёлтый Жёлтый
V. cholerae O139 (выделены от больных) -3 штамма Жёлтый Жёлтый Красный Жёлтый Жёлтый Жёлтый
V. cholerae non O1/ non O139 - 2 штамма Жёлтый Жёлтый Красный Жёлтый Жёлтый Жёлтый
A. caviae P-6020 Синий Синий Красный Жёлтый Жёлтый Сине- фиолетовый
A. caviae P-6048 Синий Синий Красный Жёлтый Жёлтый Сине- фиолетовый
A. caviae P-6051 Синий Жёлтый Красный Жёлтый Жёлтый Сине- фиолетовый
A. hydrophila P-6052 Синий Синий Красный Жёлтый Жёлтый Сине- фиолетовый
A. veronii P-6096 Синий Синий Красный Жёлтый Жёлтый Сине- фиолетовый
Возможно, использование разработанной питательной среды является инструментом для феноти-пической дифференциации штаммов внутри О139-серогруппы. Данное обстоятельство требует дальнейшего изучения.
Штаммы аэромонад при их культивировании на опытной среде «Аргинин - железо - сахарозный агар» характеризовались способностью к ферментации как сахарозы, так и аргинина (за счет наличия его дегидролазы). С 10-12-го ч от начала культивирования при 37 °С доминировало накопление щелочных продуктов вследствие ферментации аргинина, что проявлялось изменением цвета среды от исходного зеленого через пожелтение с 6-го по 9-й ч (вследствие ферментации сахарозы) к синему. Скошенная часть опытной среды при культивировании всех взятых в исследование штаммов микроорганизмов - представителей рода Aeromonas через 12 ч окрашивалась в синий цвет. «Столбик» опытной среды к этому времени становился синим у четырех из пяти штаммов Aeromonas. Штамм А. саугае P-6051, вероятно, характеризуется более выраженной ферментативной активностью в отношении сахарозы или сниженной дегидролазной активностью.
На контрольных питательных средах «Агар Клиглера-ГРМ» и Гисса-ГРМ с сахарозой различий между штаммами холерного вибриона и аэромонад не регистрировалось. Все исследованные штаммы V. еЪо1егае и Aeromonas при культивировании в течение 24 ч при 37 °С на агаре Клиглера-ГРМ вы-
зывали изменение цвета «столбика» среды от исходного красного к жёлтому вследствие ферментации входящей в состав среды глюкозы. Цвет скошенной части этой среды (в пробирках) оставался красным из-за отсутствия способности V. ско1егае и бактерий рода Aeromonas ферментировать лактозу, входящую в рецептуру данной среды. На среде Гисса-ГРМ с сахарозой все взятые в работу штаммы как холерного вибриона, так и аэромонад в тех же условиях меняли окраску среды от первоначальной зелёной к жёлтой за счёт ферментации сахарозы с образованием кислых продуктов.
На контрольной питательной среде - декар-боксилазном бульоне Мёллера с аргинином между взятыми в исследование штаммами V. ско1егае и представителями рода Aeromonas при культивировании в условиях 37 °С, 24 ч выявлялись различия. Культуры холерного вибриона вызывали изменение окраски этой среды от сиреневой до жёлтой из-за ферментации глюкозы с образованием кислых продуктов. Штаммы A. саугае P-6020, A. саугае P-6048, A. сау1ае P-6051, A. Ьу&орЬПа P-6052, A. уеют P-6096 меняли цвет вышеуказанной среды от сиреневого к сине-фиолетовому за счёт образования продуктов щелочного характера при ферментации аргинина.
Вариация показателя «дифференцирующие свойства» опытной и контрольной сред при его повторных определениях не регистрировалась.
Таким образом, при использовании разработанной питательной среды «Аргинин - железо - саха-
розный агар» возможно осуществлять первичную идентификацию штаммов холерного вибриона (на этапе отбора подозрительных колоний в посевах на плотные питательные среды нативного материала и материала, прошедшего через среды обогащения), а также дифференциацию V. сЪо1егае от близкородственных микроорганизмов рода Легошопа5 одновременно по двум признакам: ферментации сахарозы и отсутствию дегидролазы аргинина. Широко применяемая в микробиологической практике, в том числе лабораторной диагностике холеры на этапе отбора подозрительных колоний, среда «Агар Клиглера-ГРМ» не позволяет осуществлять дифференциацию данных микроорганизмов, так как в её принципе действия не заложено выявление способности исследуемых штаммов к ферментации сахарозы и аргинина.
Среды Гисса с сахарозой и Мёллера с аргинином позволяют выявлять только один признак отнесения исследуемых микроорганизмов к вибрионам или аэромонадам. Эти среды используются при окончательной идентификации выделенных культур, но не на этапе отбора подозрительных колоний.
Различия в ферментативной активности в отношении сахарозы водных и выделенных от человека штаммов холерного вибриона О139 серогруппы, выявляемые на предлагаемой среде «Аргинин -железо - сахарозный агар», безусловно, требуют дальнейшего изучения с использованием широкого набора различных по происхождению штаммов эпидемически значимого серовара «Бенгал».
Внедрение в практику лабораторной диагностики холеры (прежде всего, мониторинговых исследований воды поверхностных водоёмов на наличие этого возбудителя) питательной среды «Аргинин -железо - сахарозный агар», не имеющей в настоящее время аналогов, может рассматриваться как перспективное направление решения проблемы дифференциации штаммов V. ско1егае от близкородственных аэромонад на этапах отбора подозрительных колоний со щелочного агара и дифференциальных агаризованных сред типа TCBS, а также отбора культур для дальнейшей идентификации. Разработанная среда прошла технические и клинические испытания на базе аккредитованного испытательного центра, по результатам которых получено положительное заключение, а также процедуру государственной регистрации в качестве изделия медицинского назначения. Получено регистрационное удостоверение от 3 июня 2020 г. № РЗН 2020/10543. Приказом Росздравнадзора от 03.06.2020 № 4635 питательная среда «Аргинин -железо - сахарозный агар» допущена к обращению на территории Российской Федерации.
Выводы
1. Питательная среда «Аргинин - железо - сахарозный агар» позволяет осуществлять дифференциацию штаммов холерного вибриона от микроорганизмов - представителей рода Aeromonas на этапе отбора подозрительных колоний в посевах на плотные среды нативного материала, а также материала, прошедшего через среды обогащения, при проведении лабораторной диагностики холеры.
2. Использование питательной среды «Аргинин -железо - сахарозный агар» является эффективным способом первичной идентификации холерного вибриона сразу по двум значимым критериям: ферментации сахарозы и отсутствию дегидролазы аргинина.
3. Предлагаемая питательная среда «Аргинин -железо - сахарозный агар» может рассматриваться в качестве перспективной альтернативы используемым в практике лабораторной диагностики холеры полиуглеводным средам: Клиглера, Ресселя, лактозо-сахарозной, маннозо-сахарозной.
Литература
1. МУК 4.2.2218-07. Лабораторная диагностика холеры. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007. 87 с.
2. Russel F.F. The isolation of typhoid bacilli from urine and feces with the description of a new double sugar tube medium // J. Med. Res. 1911. Vol. 25. P. 217.
3. Kligler I.J. A simple medium for the differentiation of members of the typhoid-paratyphoid group // Am. J. Public Health. 1917. Vol. 7. P. 1042-1044.
4. Kligler I.J. Modifications of culture media used in the isolation and differentiation of typhoid, dysentery and allied bacilli // J. Exp. Med. 1918. Vol. 28. P. 319-322.
5. Адамов А.К., НаумшинаМ.С. Холерные вибрионы. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1984. 328 с.
6. Меньшикова ЕА., Курбатова Е.М., Левченко Д.А. и др. Количественные и качественные изменения микробиоценоза водоёмов г. Ростова-на-Дону в течение года // Холера и патогенные для человека вибрионы: материалы совещания специалистов Роспотребнадзора. Ростов н/Д., 2018. Вып. 31. С. 86-89.
7. Erdem B., Kariptas E., Cil E., Isik K. Biochemical identification and numerical taxonomy of Aeromonas spp. isolated from food samples in Turkey // Turk. J. Biol. 2011. Vol. 35, № 1. P. 463-472.
8. Abbott S.L., Cheung W.K.W., Janda J.M. The Genus Aeromonas: Biochemical Characteristics, Atypical Reactions, and Phenotypic Identification Schemes // J. of Clin. Microbiol. 2003. Vol. 41, № 6. P. 2348-2357.
9. Pazzaglia G., Sack. R.B., Salazar E. et. al. High Frequency of Coinfecting Enteropathogens in Aer-omonas-Associated Diarrhea of Hospitalized Peruvian
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2021. No. 2
Infants // J. of Clin. Microbiol. 1991. Vol. 29. № 6. P. 1151-1156.
10. Janda J.M., Abbott S.L. The Genus Aeromonas: Taxonomy, Pathogenicity, and Infection // Clin. Microbial. Rev. 2010. Vol. 23, № 1. P. 35-73.
11. Кретенчук О.Ф. Разработка новых препаратов на основе моноклональных антител для диагностики холерных вибрионов О1, О139 серогрупп ускоренными методами : автореф. дис. ... канд. биол. наук. Ставрополь, 2014. 22 с.
12. Куклина Н.Г., Горшков И.Г., Викторов Д.А., Васильев Д.А. Конструирование питательных сред для выделения и индикации бактерий рода Aeromonas // Вестн. ветеринарии. 2013. № 1 (64). С. 75-77.
13. Авдеева Е.В., Казимирченко О.В. Мониторинг состояния европейского угря Anguilla anguilla L. Вис-линского (Калининградского) залива по бактериологическим параметрам // Фундаментальные исследования. 2005. № 8. С. 50-51.
14. Каминский Л.С. Статистическая обработка лабораторных и клинических данных. Л.: Медицина, 1964. С. 112-113.
References
1. МиК 4.2.2218-07. Laboratory diagnostics of cholera. (2007). Moscow, Federal Center for Hygiene and Epidemiology of Rospotrebnadzor Press, 87 p. (in Russian).
2. Russel F.F. (1911). The isolation of typhoid bacilli from urine and feces with the description of a new double sugar tube medium. J. Med. Res., vol. 25, p. 217.
3. Kligler I.J. (1917). A simple medium for the differentiation of members of the typhoid-paratyphoid group. Am. J. Public Health, vol. 7, pp. 1042-1044.
4. Kligler I.J. (1918). Modifications of culture media used in the isolation and differentiation of typhoid, dysentery and allied bacilli. J. Exp. Med., vol. 28, pp. 319-322.
5. Adamov A.K., Naumshina M.S. (1984). Cholera vibrions. Saratov, Saratov University Press, 328 p. (in Russian).
6. Menshikova E.A., Kurbatova E.M., Levchenko D.A. et al. (2018). Quantitative and qualitative changes in the microbiocenosis of reservoirs in Rostov-on-Don during the year. Cholera and pathogenic vibrions for humans. Materials of the Meeting of Rospotrebnadzor specialists. Rostov-on-Don, vol. 31, pp. 86-89. (in Russian).
7. Erdem B., Kariptas E., Cil E., Isik K. (2011). Biochemical identification and numerical taxonomy of Aeromonas spp. isolated from food samples in Turkey. Turk. J. Biol., vol. 35, No. 1, pp. 463-472.
8. Abbott S.L., Cheung W.K.W., Janda J.M. (2003). The Genus Aeromonas: Biochemical Characteristics, Atypical Reactions, and Phenotypic Identification Schemes J. of Clin. Microbiol., vol. 41, No. 6, pp. 23482357.
9. Pazzaglia G., Sack. R.B., Salazar E. et. al. (1991). High Frequency of Coinfecting Enteropathogens in Aer-omonas-Associated Diarrhea of Hospitalized Peruvian Infants. J. of Clin. Microbiol., vol. 29, No. 6, pp. 11511156.
10. Janda J.M., Abbott S.L. (2010). The Genus Aeromonas: Taxonomy, Pathogenicity, and Infection. Clin. Microbial. Rev., vol. 23, No. 1, pp. 35-73.
11. Kretenchuk O.F. (2014). Development of new drugs based on monoclonal antibodies for diagnostics of cholera vibrions O1, O139 serogroups by accelerated methods. Dissertation Thesis. Stavropol, 22 p. (in Russian).
12. Kuklina N.G., Gorshkov I G., Viktorov D.A., Va-siliev D.A. (2013). Design of nutrient media for isolation and indication of bacteria of the genus Aeromonas. Vest-nik veterinarii, No. 1 (64), pp. 75-77. (in Russian).
13. Avdeeva E.V., Kazimirchenko O.V. (2005). Monitoring the state of the European eel Anguilla anguilla L. Vislinsky (Kaliningrad) Bay on bacteriological parameters. FundamentaVnye issledovaniya, No. 8, pp. 50-51. (in Russian).
14. Kaminsky L.S. (1964). Statistical treatment laboratory and clinical data. Leningrad, Meditsina Publ., pp. 112-113. (in Russian).
Поступила в редакцию /Received_28 марта 2021 г. /March 28, 2021
