Новая питательная среда для диагностики холеры ХДС-агар как перспективный элемент мобилизационного резерва специализированных противоэпидемических бригад Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

УДК 616.932: 57.083.13: 614.4

НОВАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРЫ ХДС-АГАР КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ЭЛЕМЕНТ МОБИЛИЗАЦИОННОГО РЕЗЕРВА СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКИХ БРИГАД

© 2011 г. А.Б. Мазрухо, Д.И. Каминский, Ю.М. Ломов, Н.Р. Телесманич, К.К. Рожков, Л.М. Овсова, О.Г. Булахова, В.Д. Кругликов, Ю.М. Пухов, В.И. Прометной, Н.Л. Пичурина

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт, Rostov Research Institute for Plague Control, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, Gorky St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002,

plague@aaanet.ru plague@aaanet.ru

Сконструирована новая питательная среда для культивирования и выделения холерного вибриона ХДС-агар на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей. Результаты лабораторных испытаний разработанной среды с использованием 28 штаммов холерного вибриона, апробации в ходе мониторинга водных объектов на наличие V. cholerae и тактико-специального учения специализированной противоэпидемической бригады (СПЭБ) свидетельствуют о её преимуществах перед контрольным щелочным агаром и создают предпосылки возможности включения данной среды в мобилизационный резерв СПЭБ.

Ключевые слова: питательные среды, холера, холерный вибрион, специализированная противоэпидемическая бригада.

A new nutrient medium for cultivation and isolation of Vibrio cholerae HDS-agar was constructed on basis of the bakery yeast pancreatic digest. The results of laboratory testing of the elaborated medium with the use of 28 Vibrio cholerae strains and approbation on examining the samples of water indicated its advantages as compared to the control alkaline agar and created prerequisites for possible inclusion of this medium into the mobilization reserve of Specialized Anti-Epidemic Team (SAET).

Keywords: nutrient media, cholera, Vibrio cholerae, Specialized Anti-Epidemic Team.

Опыт последних десятилетий по локализации и низация СПЭБ пяти научно-исследовательских про-

ликвидации очагов холеры на территории России, тивочумных институтов Роспотребнадзора (в Сарато-

бывшего СССР и стран СНГ свидетельствует, что ве, Ростове-на-Дону, Ставрополе, Волгограде и Ир-

наиболее действенной и эффективной структурой для кутске) и их оснащение современными автономными

решения этой задачи является специализированная мобильными лабораториями на базе пневмокаркас-

противоэпидемическая бригада (СПЭБ) - формирова- ных систем и автомобильного шасси [1-3]. Этот факт

ние быстрого реагирования на чрезвычайные ситуа- в совокупности с высоким уровнем профессиональ-

ции (ЧС) природного и техногенного характера, ной подготовки и большим практическим опытом

имеющие медико-санитарные последствия или угрозу специалистов бригад позволяет осуществлять необхо-

их возникновения. В ходе реализации распоряжения димый объём профилактических и противоэпидеми-

Правительства Российской Федерации от 21.05.2007 г. ческих мероприятий, в том числе связанных с обсле-

№ 642-р в период 2007-2009 гг. осуществлена модер- дованием многочисленных контингентов населения и

интенсивным масштабным мониторингом объектов окружающей среды при возникновении вспышек холеры. Одним из наиболее значимых направлений повышения эффективности мероприятий, проводимых СПЭБ в очагах холеры, является совершенствование существующих и разработка новых питательных сред для микробиологической диагностики этой инфекции, которые в перспективе могут быть включены в мобилизационный резерв специализированных противоэпидемических бригад.

Среди 16 наименований питательных сред, необходимых для проведения лабораторной диагностики холеры, наиболее высока количественная потребность в щелочном агаре [4]. Для обеспечения работы СПЭБ по локализации и ликвидации эпидемического очага холеры в течение двух месяцев (при исследовании в среднем 500 проб в сутки), согласно регламентированной схеме по выделению и идентификации Vibrio cholerae [5], требуется 4320 л готового щелочного агара. Используемые в микробиологической практике щелочные агары содержат в качестве питательных основ трудно поддающиеся стандартизации и дорогостоящие гидролизаты белков животного происхождения (мяса, субпродуктов, казеина). Это существенно увеличивает себестоимость анализа по исследованию материала, подозрительного на наличие холерного вибриона, и требует дополнительной оптимизации (по содержанию соответствующего белкового гидролиза-та в готовой среде) каждой серии щелочного агара в процессе её изготовления.

В связи с вышеизложенным большой интерес представляет сконструированная в Ростовском-на-Дону научно-исследовательском противочумном институте агаризованная питательная среда для культивирования и выделения холерного вибриона ХДС-агар (холерная дрожжевая среда агаризованная). Питательной основой данной среды является разработанный сотрудниками института панкреатический перевар пекарских дрожжей, запатентованный по способу его получения [6] и являющийся универсальным базовым компонентом целого комплекса питательных сред для культивирования, выделения и изучения свойств холерного вибриона, чумного и сибиреязвенного микробов. Преимуществами сред на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей является их низкая себестоимость, простая технология изготовления, высокая чувствительность, сочетание в их составе азотистых компонентов (пептидов, аминокислот) и стимуляторов роста (витаминов группы В), обусловливающих выраженные вегетирующие свойства в отношении указанных микроорганизмов. Ранее нами была показана высокая эффективность использования жидкой накопительной питательной среды для холерного вибриона, сконструированной на основе данного белкового гидролизата [7].

Целью настоящего исследования явилась оценка разработанной питательной среды ХДС-агара как потенциальной составляющей мобилизационного резерва СПЭБ. Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи: охарактеризовать сконструированную среду в сравнении с используемым в практике щелочным агаром по основным биологическим показателям в отношении коллекционных

штаммов V. cholerae; провести апробацию разработанной среды в процессе многолетнего мониторинга водных объектов г. Ростова-на-Дону на наличие холерного вибриона и оценить её эффективность в ходе опытно-исследовательского тактико-специального учения (ТСУ) СПЭБ.

Материалы и методы

В работе были использованы 28 штаммов холерного вибриона из коллекции музея живых культур Рос-товского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора: 4 штамма V.cholerae cholerae O1 (Р-1 - тест-штамм, 41, 569В, Р-2/60); 11 штаммов V.cholerae eltor O1 (М-878 - тест-штамм, 1310, Р-5879, Р-10058/1, Р-14863, Р-14864, Р-15301, Р-15302, Р-18367, Р-18368, Р-18369); 8 штаммов V.cholerae O139 (Р-16063, Р-16064, Р-16065, РО-2, РО-7, МО 45, Р-16131, 88) и 5 штаммов V.cholerae non O1/ non O139 (Р-9741 - тест-штамм, КМ-15, КМ-6, Р-12691, Р-11972).

Опытная среда ХДС-агар имела следующий состав (из расчёта на 1,0 л среды):

- панкреатический перевар пекарских дрожжей -0,05 % (по аминному азоту);

- натрий хлористый - 4,0 г;

- натрий фосфорнокислый двузамещённый 12-водный - 6,0 г;

- агар-агар микробиологический - 12,0 г;

- вода дистиллированная - до 1,0 л;

рН готовой среды - 7,8 ± 0,2.

В качестве контрольной коммерческой среды был использован агар щелочной сухой производства ФГУП НПО «Микроген», приготовленный по инструкции производителя, заранее отконтролированный и соответствующий требованиям МУ 3.3.2.2124-06 [8].

При исследовании проб воды поверхностных водоёмов и сточных вод в ходе мониторинга объектов окружающей среды на наличие холерного вибриона и ТСУ опытный ХДС-агар был использован в комплексе с жидкой накопительной средой на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей ХДС-Н (холерной дрожжевой средой накопительной) в концентрированном и десятикратно разведённом вариантах, контрольный щелочной агар - в комплексе с пептоном основным производства ФГУП НПО «Микроген» и приготовленной из него 1%-й пептонной водой.

Подготовку коллекционных штаммов V.cholerae и их посев на опытную и контрольную среды осуществляли в соответствии с требованиями МУ 3.3.2.2124-06 [8]. Культивирование штаммов проводили при 37 °С. Учёт результатов - через 12 ч. Согласно предписаниям вышеприведённых методических указаний, оценивали следующие биологические показатели сред: чувствительность, показатель прорастания, диаметр и морфологию колоний.

Исследование проб воды поверхностных водоёмов и сточных вод на наличие холерного вибриона осуществляли в период 2000-2008 гг. силами специалистов СПЭБ Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора согласно схеме, регламентированной действовавшими в указанный период выполнения работы нормативно-

методическими документами [5, 9]. Пробы отбирали из сети пунктов отбора проб воды на территории г. Ростова-на-Дону. Данная работа проводилась с целью оказания помощи учреждениям практического здравоохранения и как один из этапов подготовки личного состава СПЭБ к работе в зонах ЧС, обусловленных или осложнённых вспышками холеры. За девять указанных лет было исследовано 1120 проб воды (980 проб из поверхностных водоёмов и 140 - из стоков). Посев материала осуществляли параллельно на опытную и контрольную среды. Сравнение данных сред осуществляли по числу выделенных штаммов, идентифицированных как V. сШегае О1 и не О1 серогрупп.

При подготовке тактико-специального учения СПЭБ, проведённого в период с 26 по 30 июля 2010 г., специалистами института была разработана оригинальная легенда, согласно которой имел место занос холеры на территорию Южного федерального округа РФ (в г. Ростов-на-Дону) гражданкой Х., прибывшей из Индии, где она находилась в командировке. Был введён в действие режим ЧС, реализованы схемы оповещения и сбора личного состава СПЭБ и проведена мобилизация бригады с целью проведения мероприятий по локализации и ликвидации возникшей вспышки холеры. В ТСУ приняли участие 46 членов СПЭБ и сотрудников института, были задействованы восемь единиц автотранспорта, в том числе четыре мобильные лаборатории на базе шасси автомобиля КАМАЗ 43118 и прицепа СЗАП 8305: «индикационная лаборатория», «бактериологическая лаборатория», «блок поддержки бактериологических исследований» и «универсальный штабной жилой модуль». После совершения марша и прибытия колонны в пункт дислокации полевого лагеря СПЭБ было проведено развёртывание подразделений бригады на базе указанных мобильных лабораторий для работы в автономном режиме. Электроснабжение полевого лагеря СПЭБ осуществлялось с помощью четырёх штатных дизельных электрогенераторов мощностью от 9,0 до 12,0 кВт/ч. Вода для обеспечения функционирования мобильных лабораторий и хозяйственно-бытовых нужд была резервирована во встроенных ёмкостях

каждого модуля, заполненных через быстроразъём-ные соединения.

Личным составом СПЭБ, согласно требованиям СП 3.1.1.2521-09 [10], проведено обследование эпидемического очага, разработан оперативный план противоэпидемических мероприятий. Специалистами бригады было организовано выявление и контроль исполнения медицинского наблюдения за 30 лицами, контактировавшими с больными и вибрионосителями, отбор точечных проб из сети пунктов отбора проб воды рек Дон и Темерник.

Исследование 20 поступивших учебных проб, в том числе 10 проб из реальных объектов окружающей среды (вода поверхностных водоёмов и стоков) и 10 проб (семь из которых были искусственно контами-нированы токсигенным штаммом V. сИо1егае еког 5879 до конечной концентрации возбудителя в пробе от 103 до 107 микробных клеток/мл), имитирующих, согласно легенде, клинический материал от больных, вибрионосителей и лиц, контактировавших с ними, осуществляли в соответствии с требованиям МУК 4.2.2218-07 [5] с использованием всех современных методов, рекомендованных практическим руководством по лабораторной диагностике опасных инфекционных болезней [11]. Посев материала с целью биологического обогащения и последующего выделения культур V.cho1erae проводили параллельно на опытные (ХДС-Н и ХДС-агар) и контрольные (основной пептон, 1%-я пептонная вода и щелочной агар) питательные среды.

Результаты и обсуждение

Результаты сравнительного изучения опытной (ХДС-агар) и контрольной (агар щелочной сухой производства ФГУП НПО «Микроген», приготовленный по инструкции производителя) питательных сред по основным биологическим показателям представлены в таблице. Анализ данных свидетельствует о том, что опытная среда достоверно превосходила контрольную по показателю прорастания и диаметру колоний в отношении группы из 4 штаммов V.cho1erae Ло1егае 01.

Результаты сравнительного изучения опытной и контрольной сред по их основным биологическим показателям

Группа Чувствительность, м.к. (M±m) Показатель прорастания, % (M±m) Диаметр колоний, мм (M±m) Морфология колоний

штаммов Опытная Контрольная Опытная Контрольная Опытная Контрольная Опытная Контрольная

среда среда среда среда среда среда среда среда

V.cholerae

cholerae O1 10,0±0,0 32,5±22,5 36,5±1,6 20,6±1,8 2,2±0,2 1,6±0,1 Типичная* Типичная

4 штамма

V.cholerae

eltor O1 10,0±0,0 10,0±0,0 36,3±3,4 31,2±2,9 2,8±0,3 1,8±0,1 » »

11 штаммов

V.cholerae

O139 10,0±0,0 426,3±168,3 29,6±2,5 4,9±0,3 2,4±0,2 1,0±0,1 » »

8 штаммов

V.cholerae non

O1/ non O139 10,0±0,0 10,0±0,0 36,1±3,4 34,3±2,8 2,4±0,3 2,1±0,2 » »

5 штаммов

*- колонии гладкие, блестящие, прозрачные или полупрозрачные, голубоватые, с ровными краями.

Наиболее выраженные преимущества разработанной питательной среды ХДС-агара перед контрольной были зарегистрированы в отношении группы из 8 штаммов V.cholerae O139 как по чувствительности, которая более чем на порядок превышала аналогичный показатель щелочного агара, так и по показателям прорастания и диаметра колоний. Эти преимущества новой питательной среды приобретают особую значимость в связи с эпидемической опасностью штаммов холерного вибриона серовара О139 «Бен-гал» и высокой частотой их обнаружения в последние десятилетия.

Результаты использования группы из 11 штаммов V.cholerae eltor для оценки биологических показателей изучаемых сред свидетельствуют, что на опытной среде среднее значение диаметра колоний данных культур было в 1,55 раз выше, чем на контрольной среде при практически идентичных остальных показателях.

Полученные значения изученных биологических показателей сконструированной питательной среды ХДС-агара в отношении тест-штаммов холерного вибриона (V.cholerae cholerae O1 P-1, V.cholerae eltor O1 M-878 и V.cholerae non O1/non O139 P-9741), используемых для контроля качества питательных сред, продемонстрировали её полное соответствие требованиям МУ 3.3.2.2124-06 [8].

Разработанная на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей агаризованная питательная среда для культивирования и выделения холерного вибриона ХДС-агар не только соответствует критериям качества, регламентированным действующими методическими указаниями, но и превосходит используемый в практике аналог - коммерческий щелочной агар по ряду биологических показателей в отношении трёх из четырёх исследованных групп штаммов V.cholerae.

Результаты сравнительного изучения эффективности использования опытной и контрольной сред для исследования проб воды поверхностных водоёмов и сточных вод на наличие холерного вибриона в ходе ежегодно проводимого специалистами СПЭБ мониторинга водных объектов на территории г. Ростова-на-Дону за период 2000-2008 гг. подтвердили преимущества опытной среды, выявленные при её лабораторных испытаниях с использованием коллекционных штаммов V.cholerae. За девять лет апробации сконструированной питательной среды ХДС-агара при мониторинге водных объектов с её помощью были выделены 18 штаммов V. cholerae O1 и 302 штамма V. cholerae non O1, в то время как на контрольном щелочном агаре были изолированы только один штамм V. cholerae O1 и 164 штамма холерного вибриона не О1 серо групп. Благодаря использованию разработанной питательной среды ХДС-агара в августе 2001 г. из сточных вод на территории г. Ростова-на-Дону был выделен токсиген-ный эпидемически значимый штамм V. cholerae O1, сходный по генотипу (по данным VNTR-анализа) со штаммами, вызвавшими вспышку холеры в г. Казани месяцем раньше. Это позволило своевременно провести необходимый комплекс санитарно-противоэпидеми-ческих (профилактических) мероприятий и предотвратить распространение инфекции.

При апробации сконструированной агаризованной среды в ходе ТСУ было установлено следующее. Исследование поступивших учебных проб, проведённое на базе мобильных лабораторий СПЭБ «индикационная лаборатория» и «бактериологическая лаборатория» с использованием разработанной на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей питательной среды для диагностики холеры ХДС-агара, позволило выделить и идентифицировать 7 токсиген-ных штаммов V.cholerae eltor из 10 проб, имитирующих клинический материал от больных, вибрионоси-телей и контактных, а также один атоксигенный штамм V.cholerae eltor из 10 проб реальных объектов окружающей среды. При параллельном применении контрольной среды - щелочного агара из проб, имитирующих клинический материал, были изолированы и идентифицированы как V.cholerae eltor (токсиген-ные) только 5 штаммов, а в пробах объектов окружающей среды холерный вибрион не был обнаружен.

На опытной среде холерный вибрион был выделен из всех 7 искусственно контаминированных штаммом V. cholerae eltor 5879 проб (с конечной концентрацией данного микроорганизма 103, 105 и 107 микробных клеток/мл), в то время как с помощью контрольного щелочного агара возбудитель холеры был изолирован только из проб, содержавших указанный штамм V.cholerae в концентрациях 105 и 107 микробных клеток/мл. Этот факт свидетельствует о более высокой чувствительности опытной среды ХДС-агара по сравнению с использованной контрольной средой аналогичного назначения.

Выделение в ходе ТСУ атоксигенного штамма V. cholerae eltor из реальной пробы воды открытого водоёма только с помощью разработанной среды ХДС-агара подтверждает полученные в результате многолетнего мониторинга водных объектов данные о преимуществе данной среды перед используемым в микробиологической практике щелочным агаром.

Таким образом, в ходе выполнения настоящего исследования было установлено, что сконструированная питательная среда ХДС-агар существенно превосходит традиционный щелочной агар. Это создаёт хорошие предпосылки возможности включения разработанной среды в мобилизационный резерв СПЭБ, необходимый для обеспечения работы специализированных бригад по проведению противоэпидемических мероприятий в зонах ЧС, обусловленных или осложнённых возникновением очага холеры.

Выводы

1. Сконструирована новая агаризованная питательная среда на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей для культивирования и выделения холерного вибриона - ХДС-агар.

2. Разработанная среда превосходит используемый в практике коммерческий щелочной агар по ряду биологических показателей в отношении различных штаммов холерного вибриона, характеризуясь при этом значительно более низкой себестоимостью.

3. Продемонстрирована высокая эффективность использования разработанной среды в процессе многолетнего мониторинга водных объектов на наличие хо-

лерного вибриона, а также практического применения тематического опытно-исследовательского тактико-специального учения как этапов подготовки специалистов СПЭБ.

4. Сконструированная агаризованная питательная среда для диагностики холеры ХДС-агар уже на этапе её лабораторных испытаний способствовала реальному обеспечению санитарно-эпидемиологического благополучия на территории Ростовской области.

5. Разработанная среда может быть рекомендована для включения в мобилизационный резерв питательных сред СПЭБ, что в перспективе должно способствовать повышению готовности бригад и более эффективной их работе в зонах ЧС, обусловленных или осложнённых возникновением очага холеры.

Литература

1. Распоряжение Правительства Российской Федерации «О

финансировании мероприятий по модернизации и расходов на содержание 10 специализированных противоэпидемических бригад в целях осуществления инициативы по предотвращению и ликвидации последствий стихийных бедствий и техногенных катастроф» от 21.05.2007 г. № 642-р // Собр. закон. Российской Федерации. 2007. № 22. Ст. 2669.

2. Организация лабораторного мобильного комплекса спе-

циализированной противоэпидемической бригады про-

Поступила в редакцию_

тивочумного института / Е.С. Казакова [и др.] // Журн. микробиол. 2010. № 2. С. 24-27.

3. Сборник нормативно-методических документов по орга-

низации работы специализированных противоэпидемических бригад Роспотребнадзора / под ред. Г.Г. Онищен-ко и В.В. Кутырева. Саратов, 2008. С. 10, 12-14, 79-82.

4. Алгоритм и тактика обеспечения питательными средами

специализированной противоэпидемической бригады при работе в очаге холеры / А.Б. Мазрухо [и др.] // Здоровье населения и среда обитания. 2009. № 11. С. 8-16.

5. Лабораторная диагностика холеры: метод. указания

МУК 4.2.2218-07. М., 2007. 87 с.

6. Пат. 2375441 Российская Федерация, МПК 8 С 12 N 1/16.

Способ получения белкового гидролизата.

7. Оценка жидкой накопительной питательной среды

ХДС-Н для культивирования и выделения холерного вибриона / Д.И. Каминский [и др.] // Биотехнология. 2003. № 4. С. 70-74.

8. Контроль диагностических питательных сред по биоло-

гическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллёза, легионеллёза: МУ 3.3.2.2124-06. М., 2006. 26 с.

9. Инструкция по организации и проведению противохо-

лерных мероприятий. М., 1995. 173 с.

10. Профилактика холеры. Общие требования к эпидемио-

логическому надзору за холерой на территории Российской Федерации: СП 3.1.1.2521-09. М., 2010.

11. Лабораторная диагностика опасных инфекционных бо-

лезней: практ. руководство / под ред. Г.Г. Онищенко и В.В. Кутырева. М., 2009. С. 27-61.

26 октября 2010 г.