CC BY
23
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ УДК 759.843.1:616:577.1
Медицинский вестник Юга России
Н.Р. Телесманич, М.В. Полеева, Ю.М. Ломов, В.В. Агафонова
СПЕКТР УГЛЕВОДНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ РЕЦЕПТОРОВ АДГЕЗИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ НЕ О1/НЕ О139 СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП
ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, лаборатория экологии холеры с ЦПВ Россия, 344002, г. Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40. E-mail: plague@aaanet.ru
Цель: выявление наиболее полного спектра специфичности лектиновых рецепторов штаммов вибрионов не О1/не О139, участвующих в механизмах адгезии, на модели агглютинации эритроцитов в реакции конкурентного ингибиро-вания.
Материалы и методы: в работе исследованы атоксигенные штаммы холерных вибрионов не О1/не О139, выделенные из объектов окружающей среды, и токсигенные и атоксигенные штаммы холерных вибрионов не О1/не О139, выделенные от людей. Спектр лектиновых рецепторов определяли в реакции ингибирования гемагглютинации.
Результаты: выявлено, что штаммы вибрионов не О1/не О139 серогрупп независимо от объекта выделения обладают слабой способностью к агглютинации эритроцитов, что коррелирует с низким адгезивным потенциалом. Низкая способность к агглютинации обусловлена нестабильной от штамма к штамму экспрессией адгезинов (лектиновых рецепторов) различной специфичности. Наблюдается способность к экспрессии рецепторов очень широкого спектра, выявляющаяся на широком спектре разных видов эритроцитов с поштаммовым отличием.
Заключение: у вибрионов не О1/не О139 не выявлено различий в специфичности лектиновых рецепторов в зависимости от принадлежности к серогруппе, токсигенности, объекта выделения.
Ключевые слова: холерные вибрионы не О1/не О139 серологических групп, адгезивная активность, реакция гемаг-глютинации, лектиновые рецепторы.
N.R. Telesmanich, M.V. Poleeva, Yu.M. Lomov, V.V. Agafonova
A SPECTRUM OF CARBOHYDRATE SPECIFICITY OF RECEPTORS OF ADHESION OF VIBRIO CHOLERAE
NON-O1, NON-O139
Control plague Research Institute 117 Gorky st., Rostov-on-Don, 344002, Russia. Е-mail: plague@aaanet.ru
Purpose: revealing of the fullest spectrum of specificity lectin receptors strains of Vibrio cholerae non-O1, non-O139, participating in adgesion mechanisms, on model of agglutination of erythrocytes in reaction of competitive ingibition.
Materials and methods: in work are used strains of Vibrio cholerae non-O1, non-O139, isolated from objects of environment and from people. Spectrum lectin receptors defined in inhibition reaction hemagglutination.
Results: it is revealed, that strains of Vibrio cholerae non-O1, non-O139, irrespective of object of allocation possess weak ability to agglutination of erythrocytes that correlates with low adhesion. Low ability to agglutination is caused astable by an expression of adhesins (lectin receptors) various specificity. Ability to an expression of receptors of very wide spectrum, coming to light on a wide spectrum of different kinds of erythrocytes.
Summary: at strains of Vibrio cholerae non-O1, non-O139 it is not revealed distinctions in specificity lectin receptors depending on an accessory to serogroupe, toxigenic, object of isolation.
Keywords: Vibrio cholerae non-O1, non-O139, adhesion, hemagglutination, lectin receptors.
Введение
Холерные вибрионы не О1/не О139 серологических групп, которые распространены повсеместно и являются естественными обитателями вод поверхностных водоёмов, в то же время вызывают у людей тяжёлые гастроэнтериты и системные инфекции. Выделенные из водоёмов в процессе мониторинга холерные вибрионы не О1/не О139 представляют собой гетерогенную популяцию микроорганизмов как результат индивидуальной адаптации микробов к действию абиотических факторов конкретной экосистемы. Разнообразие серологических групп - в настоящее время их насчитывается более 200 [1], появление нового эпидемического варианта - вибрионов О139 - свидетельствуют о чрезвычайной пластичности и вариабельности поверхностных структур этой группы микроорганизмов. Познание рецепторов, участвующих в механизмах адгезии у холерных вибрионов не О1/не О139, помогло бы разобраться, почему, относясь к виду Vibrio cholerae и даже в некоторых случаях имея ген холерного токсина (ctx AB), они не являются возбудителями холеры [2,3]. В итоге более детальное изучение этих микроорганизмов может привести нас к формированию представлений о возможных маркерах энтеропатогенности. Наличие способности к адгезии у микроорганизмов в научной литературе связывают со способностью к гемагглютинации. Согласно литературным данным, адгезивная активность возбудителя холеры коррелирует с его способностью агглютинировать эритроциты человека и животных [4,5,6]. Чем больший спектр разных эритроцитов изучается в данном аспекте, тем больше можно получить данных об адгезивном потенциале конкретной группы микроорганизмов, спектре и специфичности поверхностных структур, участвующих в адгезии, наибольшем сродстве возбудителей инфекции к определённому виду эритроцитов, что может быть использовано в дальнейшем для диагностических целей. В адгезии микроорганизмов участвуют поверхностные белковые структуры бактериальной клетки, обладающие широкой специфичностью к углеводам клетки-мишени, что позволяет осуществлять процесс адгезии или специфического «прилипания». Эти структуры называются лектиновыми рецепторами и могут быть организованы в надмолекулярные структуры - пили или участвовать в сложном процессе адгезии как частные структуры [7,8]. Изучить спектр и специфичность белковых рецепторов холерных вибрионов, специфичных к углеводам клетки-мишени, возможно при помощи блокирования углеводами гемагглютинации наибольшего спектра различных по структуре эритроцитов в реакции конкурентного ингибирования. Ранее спектр углеводной специфичности рецепторов адгезии был нами изучен на штаммах холерных вибрионов эльтор и «Бенгал». Было показано, что ингибирующей способностью на реакцию гемагглю-тинации V. cholerae eltor с характеристикой ctx+ tcp+ обладают глюкоза, манноза, галактоза, сахароза, лактоза и D-глюкозамин; не было обнаружено рецепторов, специфичных арабинозе и аминосахарам: D-галактозамину, М-ацетил^-галактозамину, М-ацетил^-маннозамину. В отличие от токсигенных штаммов, у вибрионов эльтор с характеристикой ctx- tcp- выявлены лектиновые рецепторы, специфичные аминосахарам: D-галактозамину, D-глюкозамину, М-ацетил^-галактозамину, N-ацетил-D-маннозамину. Общим характерным признаком для ток-
сигенных негемолитичных и атоксигенных гемолитичных штаммов явилось отсутствие рецептора, специфичного арабинозе [5,9]. Цель работы: выявление наиболее полного спектра специфичности лектиновых рецепторов штаммов холерных вибрионов не О1/не О139, участвующих в механизмах адгезии, на модели агглютинации эритроцитов в реакции конкурентного ингибирования.
Материалы и методы
В работе были использованы штаммы V. еЬо1егае non O1/non O139, выделенные из воды поверхностных водоёмов при мониторинге водных объектов г. Ростова-на-Дону - 92 штамма, а также штаммы холерных вибрионов не О1/не О139, с различным набором генов кассеты вирулентности (ctx- tcp-, ctx- tcp+, ctx+ tcp+), выделенные от больных людей и контактных с ними лиц - 40 штаммов.
Реакции гемагглютинации и ингибирования гемаг-глютинации проводили микрометодом в соответствии с ранее предложенной методикой [9].
Результаты
Изучение способности к агглютинации различных видов эритроцитов человека и барана у холерных вибрионов не О1/не О139, выделенных из объектов окружающей среды (ООС), показало, что наибольшим сродством они обладают к эритроцитам III группы крови человека - 51,1% изученных штаммов. Остальные виды эритроцитов (I, II, IV группы крови человека и барана) агглютинировались от 15% до 30% штаммами вибрионов не О1/не О139 в зависимости от вида эритроцитов. Однако способность незначительного количества штаммов к агглютинации каждой конкретной группы крови, вида эритроцитов помогла нам выявить наиболее полный спектр специфичности лектиновых рецепторов, который может быть выявлен именно на разных эритроцитах. При инги-бировании изученной нами ранее агглютинации углеводами, у тех штаммов, которые вообще были способны к гемагглютинации хотя бы какого-либо вида эритроцитов, мы увидели чрезвычайно разноплановую картину без наличия каких-либо закономерностей (таблица 1).
Рассматривая получившийся профиль специфичности для группы V. cholerae non 01/non О139, выделенных из ООС, можно сказать, что специфичность рецепторов адгезии у вибрионов не О1/не О139 широкая, представленная сродством ко всем изученным углеводам. Однако экспрессия у разных штаммов различна и для данной группы вибрионов низкая. Нам не удалось выявить характерных рецепторов для конкретных серогрупп у холерных вибрионов не О1/не О139, выделенных из ООС. Таким образом, мы установили низкую способность группы вибрионов не О1/не О139, выделенных из ООС, к гемагглютинации, а у гемагглютинирующих штаммов малое количество штаммов реагирующих на определённый углевод. Невысокая способность к агглютинации свидетельствует об очень низкой адгезивной активности, слабой экспрессии адгезинов, но при этом, всё же о наличии определённого адгезивного потенциала этой группы свободноживущих вибрионов не О1/не О139, проявляющейся в способности к экспрессии довольно широкого спектра углеводной специфичности лектинов.
Таблица 1
Спектр лектиновых рецепторов холерных вибрионов не О1/не О139, выделенных из ООС
Реакция гемм-агглютинации Сахара Вид эритроцитов
I группа крови (абс. (%)) II группа крови (абс. (%)) III группа крови (абс. (%)) IV группа крови (абс. (%)) баран (абс. (%))
28* (30,4) 25 (27,7) 47 (51,1) 14 (15,2) 22 (22,8)
Глюкоза 16 (57,1**) 10 (40,0) 2 (4,3) 7 (50,0) 3 (13,6)
Манноза 17 (60,7) 11(44,0) 18 (38,3) 7 (50,0) 19 (86,4)
Галактоза 9 (32,1) 3 (12,0) 27 (57,4) 3 (21,4) 17 (77,3)
Арабиноза 11 (39,3) 2 (8,0) 25 (53,2) 2 (14,3) 18 (81,8)
Сахароза 14 (50,0) 11 (44,0) 15 (31,9) 11 (78,6) 15 (68,2)
Мальтоза 13 (46,4) 9 (36,0) 12 (25,5) 10 (71,4) 2 (9,1)
Б-глюкозамин 13(46,4) 10 (40,0) 15 (31,9) 9 (64,3) 12 (54,5)
М-ацетил-Б-глюкозамин 10 (35,7) 12 (48,0) 11 (23,4) 7 (50,0) 4 (18,2)
М-ацетил-Б-маннозамин 5 (17,9) 9 (36,0) 5 (10,6) 7 (50,0) 5 (22,7)
* указано количество штаммов, агглютинирующих эритроциты
** указан процент штаммов, гемагглютинация которых подавляется данным углеводом
При изучении способности к агглютинации эритроцитов человека и барана клиническими штаммами холерных вибрионов не О1/не О139, нами было отмечено, что
эритроциты I группы крови человека агглютинировали 11 штаммов из 40, при этом 8 из них не обладали геном йх АВ (таблица 2).
Таблица 2
Спектр лектиновых рецепторов холерных вибрионов не О1/не О139, выделенных от людей, на эритроцитах I, II, III групп крови человека
Реакция гемм-агглютинации Сахара Вид эритроцитов
I группа крови II группа крови III группа крови
ctx-tcp-(абс. (%)) ctx-tcp+ (абс. (%)) ctx+tcp+ (абс. (%)) ctx-tcp-(абс. (%)) ctx-tcp+ (абс. (%)) ctx+tcp+ (абс. (%)) ctx-tcp-(абс. (%)) ctx-tcp+ (абс. (%)) ctx+tcp+ (абс. (%))
8 (47) 0 3 (15,8) 10 (58,8) 0 4 (21) 8 (47) 0 2 (10,5)
Глюкоза 2 (25) - 2 (66,7) 1 (10) - 3 (75) 4 (50) - 1 (50)
Манноза 8(100) - 2 (66,7) 9 (90) - 3 (75) 5 (62,5) - 2 (100)
Галактоза 8(100) - 0 9 (90) - 0 7 (87,5) - 0
Арабиноза 5 (62,5) - 0 6 (60) - 0 5 (62,5) - 0
Сахароза 5 (62,5) - 2 (66,7) 4 (40) - 4(100) 4 (50) - 2 (100)
Мальтоза 3 (37,5) - 2 (66,7) 2 (20) - 3 (75) 4 (50) - 1 (50)
Б-глюкозамин 5 (62,5) - 3(100) 3 (30) - 3 (75) 4 (50) - 0
М-ацетил-Б-глюкозамин 5 (62,5) - 3(100) 4 (40) - 4(100) 4 (50) - 1 (50)
М-ацетил-Б-маннозамин 3 (37,5) - 2 (66,7) 0 - 2 (50) 4 (50) - 0
Всего штаммов: 17 4 19 17 4 19 17 4 19
Эритроциты II группы крови человека агглютинировали 14 штаммов из 40 взятых в работу. Из них 10 штаммов были атоксигенные и 4 токсигенных штамма. Сродство к эритроцитам III группы крови проявили только 10
штаммов из 40 штаммов, из которых 8 были атоксигенных и 2 токсигенных, что отличает данную группу вибрионов, выделенных от людей, от штаммов, которые из ООС. Клинические штаммы вибрионов не О1/не О139 не обладали
сродством к эритроцитам барана и IV группы крови человека - в 100% случаев реакция гемагглютинации была отрицательна. Таким образом, атоксигенные варианты вибрионов не О1/не О139, выделенные от людей, проявили большую способность к гемагглютинации, чем токси-генные штаммы. Изучение спектра лектиновых рецепторов проводили методом конкурентного ингибирования реакции гемагглютинации. У наибольшего количества атоксигенных штаммов холерных вибрионов не О1/не О139 ингибирование в данной реакции вызывали такие сахара, как галактоза и манноза. У токсигенных штаммов отсутствуют рецепторы галактозы и арабинозы.
Способность 100% клинических штаммов холерных вибрионов не О1/не О139 к агглютинации эритроцитов кролика помогла нам выявить наиболее полный спектр в реакции конкурентного ингибирования и подтвердить спектр лектинов, частично выявляемый на эритроцитах четырёх групп крови человека. Интересным является тот факт, что рецепторы галактозы и арабинозы также не участвуют в агглютинации эритроцитов кролика токси-генными клиническими штаммами вибрионов не О1/не О139. К доминирующим рецепторам, встречающимся у 60% штаммов, можно отнести глюкозу, сахарозу и мальтозу (таблица 3).
Таблица 2
Спектр лектиновых рецепторов холерных вибрионов не О1/не О139, выделенных от людей,
на эритроцитах кролика
Кол-во штамов 17 4 19 Всего 40 штаммов:
Генетическая хар-ка ctx- tcp-(абс. (%)) ctx- tcp+ (абс. (%)) ctx+ tcp+ (абс. (%))
РГА Сахара 16* (94,1) 4 (100) 19 (100) 39 (97,5)
Глюкоза 7 (43,75**) 4 (100) 13 (68,4) 24 (61,5)
Манноза 9 (56,25) 1 (25) 12 (63,2) 22 (56,4)
Галактоза 4 (25) 1 (25) 0 5 (12,8)
Арабиноза 2 (12,5) 1 (25) 0 3 (7,7)
Сахароза 12 (75) 4 (100) 15 (80) 31 (79,5)
Мальтоза 10 (62,5) 4 (100) 13 (68,4) 27 (69,2)
Б-глюкозамин 9 (56,25) 4 (100) 7 (36,9) 20 (51,3)
М-ацетил-Б-глюкозамин 8 (50) 2 (50) 9 (47,4) 19 (48,7)
М-ацетил-Б-маннозамин 6 (37,5) 2 (50) 6 (31,6) 14 (35,9)
* указано количество штаммов, агглютинирующих эритроциты
** указан процент штаммов, гемагглютинация которых подавляется данным углеводом
Обсуждение
Ранее, в наших работах, мы определили наиболее полный спектр углеводной специфичности рецепторов адгезии возбудителей холеры О1 и О139 серогрупп [5,6], что позволило сориентироваться в разнообразии углеводной специфичности поверхностных структур клетки-патогена. Интересным было то, что наблюдалась чёткая дифференциация рецепторов адгезии у токсигенных и атоксигенных штаммов эльтор вибрионов, что позволило расширить подходы к их дифференциации. Поэтому изучение спектра углеводной специфичности рецепторов адгезии вибрионов не О1/ не О139 представляет интерес, как в плане сравнения детерминант адгезии, которые могут быть характерны для конкретной серогруппы, так и в плане сравнения «профилей» специфичности со штаммами возбудителей холеры. Поэтому мы провели ингибирование изученной нами гемагглютинации углеводами у тех штаммов, которые вообще были способны к гемагглютинации хотя бы какого-либо вида эритроцитов.
Изучение способности к агглютинации различных видов эритроцитов у холерных вибрионов не О1/не О139
серологических групп, выделенных из ООС, показало, что эта группа вибрионов обладает чрезвычайно низкой способностью агглютинировать разные виды эритроцитов. Самая высокая агглютинабельность (47 штаммов из 92-х) проявилась на III группе крови; самая низкая (14 штаммов из 92-х) проявилась по отношению к эритроцитам IV группы крови. Клинические штаммы холерных вибрионов не О1/не О139 характеризовались ещё более низкой способностью к агглютинации эритроцитов, чем штаммы, выделенные в ходе мониторинга водных объектов окружающей среды. Так, наибольшее сродство (14 штаммов из 40) вибрионы данной группы проявили к эритроцитам II группы крови человека и вообще не агглютинировали в 100% случаев эритроциты барана и IV группы крови человека.
Невысокая способность гемагглютинировать различные виды эритроцитов свидетельствует о низком адгезивном потенциале этой группы штаммов, что коррелирует с изученной нами ранее низкой адгезивной активностью в методе Бриллиса [10]. Однако способность незначительного количества штаммов к агглютинации разных видов эритроцитов помогла нам выявить наиболее полный спектр тех лектиновых рецепторов, которые
способны участвовать в механизмах адгезии у разных серогрупп вибрионов не О1/не О139. Специфичность рецепторов адгезии у вибрионов не О1/не О139, независимо от токсигенности, объекта выделения, принадлежности к серологической группе, широкая и представлена наличием рецепторов ко всем использованным в работе углеводам, т. е. рецепторы вибрионов не О1/не О139 представлены незакономерным широким и размытым спектром слабой специфической активности ко всем изученным углеводам.
Невысокая способность к агглютинации и большое количество рецепторов адгезии у холерных вибрионов не О1/не О139 (углеводы и аминосахара) могут являться одними из факторов, способствующих их сохранению и выживаемости в окружающей среде и организме человека. В связи с тем, что спектр углеводных рецепторов выражен слабо, но довольно разнообразен, можно предположить, что их наличие является своеобразным механизмом адаптации к условиям существования.
Краткое заключение
Таким образом, штаммы холерных вибрионов не О1/ не О139 серологических групп, независимо от объекта выделении,я обладают низкой способностью к агглютинации эритроцитов, что свидетельствует о низком адгезивном потенциале и подтверждается количественными показателями при изучении адгезивных свойств по методу Брилиса. Адгезивные свойства холерных вибрионов не О1/не О139 обусловлены лектиновыми рецепторами различной углеводной специфичности и представлены сродством к моносахаридам, дисахаридам и аминосахарам. Экспрессию разных по специфичности лектинов у одного и того же штамма можно выявить на разных видах эритроцитов. У холерных вибрионов не О1/не О139 серологических групп не выявлено различий в специфичности лектиновых рецепторов в зависимости от принадлежности к серогруппе, токсигенности, объекта выделения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Faruque S. M., Nair G. B. Moléculas ecology of toxigenec Vibrio cholera//Microbiol. Immunol. - 2002. - Vol. 46, N2. - P. 59-66
2. Bag P. K., Bhownik P., Hajra T. K. et al. Putative virulence traits and pathogenicity of Vibrio cholerae non-O1, non-O139 isolated from surface waters in Kalkata, India//Appl. Environ. Microbiol. -2008. - Vol. 74, №18. - P. 5635-5644.
3. Kumar P., Peter W. A., Thomas S. Detection of virulence genes in Vibrio cholerae isolated from aquatic environment in Kerala, Southern India//Appl. Biochem. Biotechnol. - 2008. - Vol. 151, №2-3. - P. 256-262.
4. Андрусенко И.Т. Исследование факторов, влияющих на вирулентность холерных вибрионов и разработка новых методов ее определения//Автореферат дисс. на соискание ученой степени докт.биолог.наук - Саратов. - 1991. - 35 с.
5. Колякина А. В. Лектиновые рецепторы холерных вибрио-нов//Автореферат на соискание уч. степени канд. мед. наук. -Ставрополь, 2009. - 18 с.
6. Телесманич Н. Р, Колякина А. В., Ломов Ю. М. и др. Характеристика адгезивной активности холерных вибрионов на эритроцитах млекопитающих для выбора дополнительного ориентировочного теста их эпидемической значимости// Клин. лаб. диагн. - 2008. - №7. - с.45-48.
7. Лахтин В.М. Биотехнология лектинов//Биотехнология. -1989. - Т. 5, № 6. - С. 616-691
8. Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Луцик А.Д. Лектины. - Львов, 1981. - 156 с.
9. Ломов Ю. М., Телесманич Н. Р, Колякина А. В. Специфичность лектиновых рецепторов холерных вибрионов// ЖМЭИ. - 2007. - №6. - с. 68-72.
10. Акулова М. В., Телесманич Н. Р., Ломов Ю. М. и др. Сравнительная характеристика способности к адгезии холерных вибрионов не О1/не О139 серогрупп, выделенных от человека и свежевыделенных из объектов окружающей среды// Здоровье населения и среда обитания. - М, 2010. - №6 -с. 17-19.
ПОСТУПИЛА: 26.02.2013
