CC BY
26
УДК 579.843.1г05:91:002.5/6
С.О. Водопьянов, М.В. Полеева, Н.Р. Телесманич, А.С. Водопьянов, В.В. Агафонова
РЕТРОСПЕКТИВНЫЙ АНАЛИЗ КУЛЬТУР VIBRIO CHOLERAE NON O1/NON O139, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ЛЮДЕЙ, НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН С 1987 ПО 1990 гг., С ПОМОЩЬЮ ГИС «ХОЛЕРА-ШТАММЫ-VNTR»
ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, лаборатория экологии холеры с ЦПВ Россия, 344002, г. Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40. E-mail: plague@aaanet.ru
Цель: сравнительное изучение VNTR-генотипов различных по токсигенности штаммов V. choleraе non O1/non O139, выделенных от людей на территории республики Узбекистан с 1987 по 1990 гг.
Материалы и методы: в работе изучены ctx AB+ и ctx AB- штаммы вибрионов не О1/не О139, выделенные от людей на территории республики Узбекистан.
Результаты: показано, что ctx AB+ штаммы вибрионов не О1/не О139 потомки одного клона. Анализ характера дендрограммы показывает, что эпидпроцесс на территории республики Узбекистан, вызванный V. choleraе non O1/non O139, устойчиво протекал длительное время, поскольку между токсигенными штаммами отмечена значительная генетическая дистанция. Полученные результаты свидетельствуют о независимом характере происхождения токсигенных штаммов холерных вибрионов не О1/не О139. Не обнаружено взаимосвязи между VNTR-генотипом и серогруппой.
Заключение: методы VNTR-типирования и серотипирования являются взаимодополняющими и должны быть использованы в комплексе при проведении эпиднадзора за холерой.
Ключевые слова: холерные вибрионы не О1/не О139 серологических групп, VNTR-анализ, локус, генопип.
S.O. Vodopjanov, M.V. Poleeva, N.R. Telesmanich, A.S. Vodopjanov, V.V. Agafonova
RETROSPECTIVE ANALYSIS OF CULTURES VIBRIO CHOLERAЕ NON-O1, NON-O139, SECURED FROM PEOPLE, OF REPUBLIC UZBEKISTAN WITH 1987 FOR 1990, BY VNTR-ANALYSIS
Control plague Research Institute 117 Gorky st., Rostov-on-Don, 344002, Russia. Е-mail: plague@aaanet.ru
Materials and methods: in work are studied ctx AB + and ctx AB - strains Vibrio choleraе non-O1, non-O139, isolated from people of republic Uzbekistan.
Results: it is shown, that ctx AB + strains Vibrio choleraе non-O1, non-O139 descendants of one clone. Character analysis dendrogramne shows, that epidemiological processin in republic Uzbekistan, V. choleraе non-O1, non-O139, steadily proceeded long time as between toxigenic strains the considerable genetical distance is noted. The received results testify to independent character of a parentage toxigenic strains Vibrio choleraе non-O1, non-O139. It is not revealed interrelations between a VNTR-genotype and serougrupe.
Summary: VNTR-identification and serotyping methods are complementary and should be used in a complex at carrying out epidemiological process behind a cholera.
Keywords: Vibrio choleraе non-O1, non-O139, VNTR-analysis, locus, genotype.
Введение
Появление нового варианта возбудителя холеры - Vibrio cholerae O139 - склонного к эпидемическому распространению, открыло новую страницу в истории изучения холерных вибрионов не О1 серологической группы со времён их обнаружения и привлекло внимание к проблеме дальнейшего исследования данной группы микроорганизмов, а также показало существование реальной угрозы образования новых вирулентных для человека холерных вибрионов не О1серо-группы [1].
Теоретически можно допустить наличие двух возможных путей образования вирулентных вибрионов не О1 серогруппы: из вирулентного вибриона О1 серогруппы за счёт переноса в него генов биосинтеза соответствующего О-антигена (как в случае вибрионов О139 серогруппы, выделенных в 1992-1993 гг. в Юго-Восточной Азии) или из вирулентных вибрионов не О1 серогруппы, обитающих во внешней среде и содержащих неполный набор генов вирулентности за счет переноса полного набора соответствующих генов [1,2].
В 1987-1990 гг. в Узбекистане регистрировали большое количество случаев возникновения кишечных инфекций у людей, этиологическим агентом которых были холерные
вибрионы не Ol/не 0139. Большой интерес представляет изучение штаммов V. cholerae non O1/non O139, выделенных от людей и имеющих ген холерного токсина - ctx AB.
Наличие локусов вариабельных тандемных повторов было положено в основу схемы мультилокусного VNTR-типирования холерного вибриона. Система ГИС «Холера-штаммы-VNTR» была ранее апробирована на модели коллекций штаммов вибрионов О1 и О139, выделенных из различных источников в межэпидемические периоды и в процессе эпидемиологических осложнений [3,4,5].
Закономерно возникает вопрос о возможности использования VNTR-анализа для установления возможности происхождения токсигенных вариантов холерных вибрионов не О1/не О139 путём переноса им кассеты генов ctx AB.
Цель работы: сравнительное изучение VNTR-генотипов токсигенных и атоксигенных штаммов V. Локгае non O1/non O139, выделенных от людей на территории республики Узбекистан с 1987 по 1990 гг.
Материалы и методы
Характеристика штаммов V. cholerae non O1/non О139, использованных в работе, представлена в таблице 1.
Таблица 1
Характеристика штаммов V. cholerae non O1/non О139, использованных в работе
№ п/п Характеристика штаммов Место и год выделения Серогруппа Количество штаммов
О41 1
Узбекистан, 1987 г. О74 3
О84 1
Узбекистан, 1988 г. н/о 1
О9 4
1 ctx+ / tcp+ О15 1 24
Узбекистан, 1990 г. О28 1
О74 4
н/о 7
Судан, 1999 г., типовой штамм коллекции Саказаки О37 1
2 ctx- / tcp- Узбекистан, 1987 г. не типируется 8 8
Ранее данные штаммы были изучены нами по способности ферментации маннита и сорбита, по адгезивным свойствам, по гемолитической и липазной активностям [6]. Штаммы холерных вибрионов не О1/не О139 хранили в столбиках 0,3% агара Мартена (рН 7,8) под слоем вазелинового масла. Перед проведением опытов штаммы 2-3-кратно пассировали через бульон Мартена (рН
7,8), после чего из суточной агаровой культуры готовили 1 млрд. микробную взвесь по стандарту мутности ОСО ГИСК им. Тарасевича в дистиллированной воде и кипятили на водяной бане в течение 30 минут. Затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 2 минут. Надо-садочные жидкости использовали в качестве источника хромосомальной ДНК для постановки ПЦР. Амплифика-
цию ДНК проводили с использованием авторских специфических праймеров к VNTR локусам холерных вибрионов: VcA, VcB, VcI, VcD, VcG. Результаты обрабатывали с помощью стандартного программного обеспечения. Размеры аллелей рассчитывали с использованием авторской программы GEL1.0. и программы Quatity One 4.40, "Bio-Rad". В качестве маркеров молекулярных стандартов использовали ДНК штаммов с известной аллельной формулой [3,4,5].
Кластерный и территориально-пространственный анализ штаммов осуществляли построением дендро-
граммы с учётом полиморфизма аллельного состояния исследованных VNTR-локусов с использованием геоинформационной системы (ГИС) «Холера-штаммы-VNTR», а также открытого программного обеспечения Phylip 3.6 [3,4,5,7].
Результаты
VNTR-анализ позволил протипировать все 32 изученные культуры штаммов V. сЬэкгае non O1/non O139, включая изоляты с неустановленым серотипом (таблица 2).
Таблица 2
Генотипы токсигенных и атоксигенных штаммов холерных вибрионов не О1/не О139, выделенных от людей на территории Узбекистана
№ п/п VNTR генотип Серогруппы Место и время выделения Количество штаммов
Токсигенные штаммы V. cholerae non O1/non О139 - ctx AB+
Самаркандская обл., 1987 г. 2
Джизакская обл., 1990 г. 8
1. A1 О74, О41, О28, О9, О15, Ферганская обл, 1990 г. 1
не типируются Самаркандская обл., 1990 г. 3
Узбекистан, 1988 г. 1
Хорезмская обл., 1990 г. 1
2. A2 О74 Самаркандская обл., 1990 г. 1
3. A3 О9 Джизакская обл., 1990 г. 1
4. B1 О74 Самаркандская обл., 1987 г. 1
5. B2 О74 Кашка-Дарьинская обл., 1990 г. 1
6. D1 О74 Самаркандская обл., 1990 г. 1
7. D2 не типируется Самаркандская обл., 1990 г. 1
8. D3 О84 Ташкентская обл., 1987 г. 1
9 Е О37 Судан, 1999 г., типовой штамм коллекции Саказаки 1
Установлено, что все нетоксигенные щтаммы не обладали локусом УеБ, что проявилось в отсутствии полосы специфического амплификата при постановки ПЦР. По результатам кластерного анализа построена дендрограм-ма УМТК-генотипов (рисунок 1).
Было показано, что в коллекции токсигенных штаммов холерных вибрионов не О1/не О139 серологических групп, выделенных на территории Узбекистана [7], преобладают потомки одного клона. Формально 24 изученных йх+ штамма четко подразделились на 4 кластера А, В, Б и Е. Типовой штамм из коллекции Саказаки, относя-
щийся к О37 серологической группе с генотипом Е, был выделен на территории Судана в 1999 году. Подавляющее большинство токсигенных культур (16 из 24) относились к мажорному УМТЯ-генотипу А1. Штаммы данного генотипа циркулировали на территории Узбекистана в течение 1987-1990. Девять оставшихся культур сформировали 9 минорных УМТВ.-генотипов. Два минорных УОТВ.-генотипа входили в состав мажорного кластера А, пять оставшихся сформировали три минорных кластера В (генотипы В1 и В2), Б (Б1 и Б2) и Е (типовой штамм).
Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное на основе распределения аллелей VNTR штаммов V. choleraе non O1/non O139, выделенных от людей, на территории республики Узбекистан
с 1987 по 1990 гг.
По результатам дендрограммы отмечена четкая дискриминация токсигенных от нетоксигенных вариантов холерных вибрионов не О1/не О139 серогрупп, выделенных в течение 1987 года на территории республики Узбекистан. Восемь нетоксигенных изолятов не содержали локуса VcB и сформировали отдельно расположенный кластер С, представленный семью VNTR-генотипам. При этом для нетоксигенных вариантов было характерно отсутствие клональности, поскольку лишь генотип С1 был представлен двумя штаммами. Отсутствие выраженной клональности было продемонстрировано нами ранее при анализе коллекции нетоксигенных штаммов вибрионов О1, выделенных из объектов внешней среды [3]. Интересной особенностью всех нетоксигенных штаммов явилось отсутствие локуса VcB. Это вызывает некоторое удивление, поскольку в секвенированных геномах вибрионов О1 локус VcB располагается на значительном удалении от гена ctx (штаммы MJ-1236 и O395), а в случае штамма V. choleraе non O1/non O139 16961 указанные гены вообще локализованы на разных хромосомах.
Обсуждение
Существование среди изученного набора штаммов мажорного VNTR-генотипа А1 указывает на устойчивую циркуляцию потомков данного токсигенного клона в течение трех лет среди населения Узбекистана и свидетельствует высоком эпидемическом потенциале данного уникального геноварианта. Подобная картина распределения с преобладанием одного мажорного VNTR-генотипа была выявлена нами при анализе штаммов вибрионов О1 серо-группы, выделенных в ходе вспышки в Казани [5].
На основании анализа характера дендрограммы можно предположить, что эпидпроцесс на территории республики Узбекистан, вызванный V. choleraе non O1/non O139, устойчиво протекал длительное время, поскольку между токсигенными штаммами отмечена значительная генетическая дистанция.
При сопоставлении результатов серотипирования с распределением аллелей VNTR не обнаружено взаимосвязи между VNTR-генотипом и серогруппой. Напротив, токсигенные штаммы мажорного VNTR-генотипа А1 относились к серовариантам О74, О41, О28, О9, О15 и вариантам с неустановленным серотипом.
Заключение
Полученные результаты, на наш взгляд, свидетельствуют о независимом характере происхождения ток-сигенных штаммов холерных вибрионов не О1/не О139 серологических групп. Нетоксигенные варианты представляют собой отдельную популяцию, не связанную происхождением с токсигенными вариантами. Наиболее вероятным событием, объясняющим существование различных сероваров внутри одного VNTR-генотипа, нам представляется перенос кассеты генов, детерминирующих продукцию О-антигена. Подобные предположения на сегодняшний день широко обсуждаются в литературе [1,2]. На наш взгляд необходимы дополнительные исследования для проверки этого предположения.
Кроме того, на основании полученных результатов можно сделать вывод, что методы VNTR-типирования и серотипирования являются взаимодополняющими и должны быть использованы в комплексе при проведении эпиднадзора за холерой.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ерошенко Г. А., Куклева Л. М., Шавина Н. Ю. и др. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика и возможное происхождение Vibrio cholerae не О1/не О139 с полным и ограниченным набором генов вирулентности// ЖМЭИ. - 2007. - №5. - с.24-28
2. Ерошенко Г. А. Vibrio cholerae О139: генетика и молекулярные механизмы образования возбудителя холеры не О1 серогруппы//Проблемы особо опасных инфекций, Саратов, 2006. - Вып. 92. - с. 15-18
3. Мишанькин Б. Н., Водопьянов А. С., Ломов Ю. М. и др. Вариабельные тандемные повторы (VNTR-анализ) у Vibrio с^юкгае О139, выделенных от людей и из воды поверхностных водоёмов России//ЖМЭИ, - 2003. - №6. -с. 11-15
4. Мишанькин Б. Н., Водопьянов А. С., Ломов Ю. М. и др. Ретроспективный VNTR-анализ генотипов штаммов Vibrio сЫкгае О1, выделенных на территории Ростовской области
в годы VII пандемии холеры//Мол. генетика, микробиол. и вирусол. - 2004. - №2. - с. 28-33
5. Онищенко Г. Г., Ломов Ю. М., Мишанькин Б. Н. и др. Характеристика холерных вибрионов эльтор, выделенных в г. Казань в 2001 г.//ЖМЭИ. - 2002. - №2. - с. 3-6
6. Акулова М. В., Телесманич Н. Р., Ломов Ю. М. и др. Сравнительная характеристика способности к адгезии холерных вибрионов не О1/не О139 серогрупп, выделенных от человека и свежевыделенных из объектов окружающей среды//Здоровье населения и среда обитания. - М, 2010. -№ 6 - с.17-19
7. Онищенко Г.Г., Мишанькин Б.Н., Водопьянов А.С. и др. Холерные вибрионы серогрупп не О1, выделенные в Узбекистане в 1987-1990 г.: ретроспективный анализ// Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2003. - № 6. -с.25-29
ПОСТУПИЛА: 26.02.2013
