CC BY
18
Ukrainian Journal of Ecology
Ukrainian Journal ofEcology, 2018, 8(1), 498-502 doi: 10.15421/2017_241
ORIGINAL ARTICLE UDC 619:614.31:637.05
Diagnosis of isoniazid poisoning in dogs
O.V. Bayer1, O.V. Bondarets1, Yu.V. Dobrozhan1, N.V. Liniichyuk1, O.M. Stupak1, G.I. Dereviaga1
L.V. Shevchenko2, V.M. Mykhalska2
1State Research Institute with laboratory diagnostics and veterinary-sanitary expertise 2National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Kiev E-mail: kot30@meta.ua, dndildvse@vetlabresearch.g, shevchenko laris@ukr.net, vitam@bigmir.net
Submitted: 15.01.2018. Accepted: 21.02.2018
The conducted researches have proved the possibility of using biological samples of pathological material from dogs containing stomachs for posthumous diagnosis of dogs with isoniazid poisoning. On the basis of the data obtained, the liquid chromatography method was modified and validated to identify and quantify the content of the isoniazid in the stomach that died from poisoning. The essence of the method for the determination of isoniazid consists in the selection of samples of the trapped stomach of the bodies of dogs, homogenization and deproteinization of samples followed by extraction of isoniazid with a solution of methanol. Identification and quantitative determination of isoniazid is carried out by liquid chromatography using a chromatograph with a dual mass spectrometric detector. It has been proved that a modified and adapted technique for determining the content of isoniazid in the stomach contents of dogs is sensitive and according to its parameters meets the European requirements. This method is fast enough, practical and reliable. The conducted researches have proved that out of 22 samples of biological material from homeless and domestic dogs that died from unspecified causes during 2016-2017, in the laboratory of the research chemical and toxicological department of the State Research Institute for Laboratory Diagnostics and Veterinary and Sanitary Expertise Injury poisoning with isoniazid has been confirmed in 9 cases, which is 41% of the total deaths. The lowest concentration of isoniazid, which caused the death of dogs during 2016-2017, was detected in the stomach containing 90.5 |jg / kg, and the highest - respectively - 5799.8 pg / kg. Given the high sensitivity, reproducibility and reliability of the method, it can be recommended for the diagnosis of poisoning homeless and domestic dogs with isoniazid in laboratories of veterinary medicine.
Key words: isoniazid, homeless and domestic dogs, corpses, liquid chromatography.
Спос1б визначення !зошазиду в оргашзм1 собак при
отруенш
О.В. Байер1, О.В. Бондарець1, Ю.В. Доброжан1, Н.В. Лшшчук1, О.М. Ступак1, Г.1. Деревяга1
Л.В. Шевченко2, В.М. Михальська2
1Державний науково-дослщний ¡нститут з лабораторноУ дiагностики та ветеринарно-саытарноУ експертизи, м. КиУв 2Нацюнальний уыверситет бюресурав i природокористування УкраУни, м. КиУв E-mail: kot30@meta.ua, dndildvse@vetlabresearch.g, shevchenko laris@ukr.net, vitam@bigmir.net
Проведеними дослщженнями доведена можливкть використання бюлопчних зразюв патолопчного матерiалу вщ собак, вмктимого шлунку для посмертно!' дiагностики отруення iзонiазидом собак.На основi одержаних даних модифковано та вальцовано метод рщинноУ хроматографи для щентифкацп та кшьюсноУ характеристики iзонiазиду у вмктимому шлунку, як загинули вщ отруення. Суть методу визначення iзонiазиду полягае у вiдборi зразюв вмктимого шлунку трутв собак, гомогеызаци i депротеУызаци зразюв з наступною екстращею iзонiазиду розчином метанолу. 1дентифка^я та юльюсне визначення iзонiазиду здмснюеться методом рщинноУ хроматографи з використанням
хроматографа з подвмним мас-спектрометричним детектором. Доведено, що модифкована та адаптована методика з визначення вмiсту iзонiазиду вмктимому шлунку собак е чутливою i за своУми параметрами вiдповiдаe европейським вимогам. Даний метод е досить швидким, практичним та достовiрним. Проведеними дослщженнями доведено, що з 22 зразюв бiологiчного матерiалу вiд бездомних i домашнiх собак, що загинули з невстановлених причин протягом 2016 -2017 роюв, в лабораторп науково-дослщного хiмiко-токсикологiчного вiддiлу Державного науково-дослщного iнституту з лабораторноУ дiагностики та ветеринарно-саытарноУ експертизи було пiдтверджено отруення тварин iзонiазидом у 9 випадках, що становить 41 % вщ загальноУ кiлькостi випадкiв загибелi. Найнижча концентра^я iзонiазиду, що спричинила загибель собак протягом 2016 - 2017 роюв, i була виявлена у вмктимому шлунку, становила 90,5 мкг/кг, а найвища - вщповщно - 5799,8 мкг/кг. Враховуючи високу чутливiсть, вiдтворюванiсть та достовiрнiсть методу, його можна рекомендувати для дiагностики отруення бездомних i домашых собак iзонiазидом в лабораторiях ветеринарноУ медицини.
Ключовi слова: iзонiазид, бездомнi i домашнi собаки, трупи, рiдинна хроматографiя.
Вступ
На сьогоднi за оцЫками eKcnepTiB УкраУна входить в список свтових лiдерiв за кiлькiстю бездомних собак. Ця проблема стоУть особливо гостро як у великих населених пунктах (обласн центри), так i в невеликих мктах i селах. За рiзними даними кiлькiсть бездомних собак може досягати 10 - 20 тисяч особин у великих мктах. До основних причин зростання чисельносп популяцм бездомних собак у населених пунктах можна вщнести наступнП безвщповщальне ставлення людей до тварин, що часто сприяе Ух безконтрольному розмноженню i потраплянню на вулиц небажаного потомства, а також вщсутнкть стерилiзацiУ собак, якi не використовуються для розведення i не мають породноУ цiнностi. Однiею з не менш вагомих причин швидкого збтьшення чисельностi бездомних собак е наявнкть i доступнiсть джерел корму: вщкрил смiттевi баки i смiттезвалища (часто стихмы), якi мiстять вiдходи харчових продуклв, i слугують кормом для таких тварин, а також самi мешканц населених пунктiв, якi пщгодовують i приманюють бездомних тварин до територи поблизу своУх будинкiв (Christine Dell'Amore, 2014).
Вирiшення проблеми регуляци чисельностi бездомних собак в УкраУн здiйснюеться в основному комунальними пщприемствами за рахунок створення притулкiв i Ух обслуговування, однак вони забезпечують лише 20-30% вщ реальноУ потреби. Тому ця проблема залишаеться актуальною i мешканц населених пунктiв часто вимушен вирiшувати ïï самостiйно, стикаючись з особливо агресивними тваринами, як населяють i захищають свою територ^. Незважаючи на Закон УкраУни «Про внесення змЫ до деяких законодавчих аклв УкраУни щодо запровадження гуманного ставлення до тварин» вщ 22.06.2017 № 2120-VIII, ст. 89 та ст. 299, як пщвищують рiвень вiдповiдальностi осiб за жорстоке поводження з тваринами, кшьюсть випадюв жорстокого поводження мешканцiв населених пунклв з безпритульними собаками залишаеться високою, оскшьки цей закон не врегульовуе цив^зоване вирiшення ^еУ проблеми, а лише наслщки його невиконання (Zakon Ukrainy, 2017).
Досить часто проблему зменшення чисельностi бездомних собак так зван «дог хантери» вирiшують з допомогою фармацевтичних засобiв, якi використовують з метою отруення тварин. До таких речовин належить широко розповсюджений препарат iзонiазид (тубазид) - який розроблений для лкування туберкульозу людей (American..., 1994; Schraufnagel, 1990; Kim et al., 2014; Delaine T. et al., 2010). Даний препарат випускаеться у формi таблеток без смаку i запаху, кожна таблетка мктить 300 мг iзонiазиду (Committee., 1994; Manufactured., 2016; Bernadou et al., 2001). Особливктю цього препарату е пщвищена чутливкть до нього у собак, у яких в органiзмi вщсутнм специфiчний фермент N-ацетилтрансфераза, який розщеплюе дiючу речовину, що викликае отруення тварин. Незважаючи на блювотний рефлекс, що виникае у собак при надходженн в оргаызм цього препарату, значна частина його всмоктуеться в кров i викликае незворотн змЫи в оргаызмк До того ж Ыколи умисне отруення собак iзонiазидом поеднуеться з використанням протиблювотних засобiв, що ще бтьше ускладнюе перебiг i наслщки такого отруення (Dorohov, 2002; Nguyen M. et al., 2002).
^м того, досить часто рееструються випадки отруення iзонiазидом не лише бродячих бездомних собак, але й домашых, як випадково з'Удають отруенi приманки. Тому виникае необхщнкть вдосконалення, валщацп та розробки надiйних високочутливих i високоселективних методик щентифкаци цього препарату у середовищах органiзму та трупному матерiалi собак.
Матерiали i методи дослщжень
Дослiдження проводили на базi науково-дослiдного хiмiко-токсикологiчного вiддiлу Державного науково-дослщного iнституту з лабораторноУ дiагностики та ветеринарно-саытарноУ експертизи (ДНД1ЛДВСЕ).
Метою дослщжень було модифiкувати та валiдувати метод рщинноУ хроматографи з визначення вмiсту iзонiазиду в трупному матерiалi, в^браному вiд собак. Пiд час оцЫки придатностi методу використовували рiдинний хроматограф з подвмним мас-спектрометричний детектором Waters XEVO TQ-S micro. Застосовували колонку анал™чну обернено-фазну Waters ВЕН С18 1,7 мкм, 100*2,1мм, рухома фаза була метанол та 0,1% водний розчин мурашиноУ кислоти. Матерiалом для дослщження були зразки вмктиме шлунку собак, якi загинули з невщомих причин.
Паралельно з дослщжуваним зразком готували зразок з добавкою, проба контролю чистоти реактивiв та референт-матерiалiв.
Метод визначення iзонiазиду у бiологiчних зразках включае 5 основних етапiв:
- в^р середньоУ проби вмiстимого шлунку трутв собак;
- гомогенiзацiя та депротеУыза^я екстракту;
- екстракцiя залишкiв iзонiазиду метанолом;
- iдентифiкацiя та ктьюсне визначення iзонiазиду методом РХ-МС/МС.
Оцыювання придатностi методу проводили вiдповiдно до Ршення £вропейськоУ ком1сп 2002/657/ЕС в1д 12 серпня 2002 року, яке забезпечуе виконання Директиви Ради 96/23/ЕС, що стосуеться ефективностi аналiтичних методiв та Ытерпретацп результатiв, а також вщповщно до рекомендацiй референс-лабораторiй Евросоюзу в галузi контролю залишкових ктькостей (CRLs) 20/1/2010 щодо оцiнки придатносп скринiнгових методiв за визначення залишкових кiлькостей ветеринарних препаратiв.
Результати дослщжень та Ух обговорення
Як показав аналiз даних лiтератури, на сьогодн в УкраУнi е необхiднiсть розробки та використання сучасних методiв щентифкацй' окремих сполук, якi е д1ючими речовинами препаратiв як медичного, так i ветеринарного призначення (HPLC - MS Analysis, 2007; Melentev, Lavrenteva, 2011; Bajaj R. et al., 1991; ). До останых належить iзонiазид, який часто е причиною отруення собак зi смертельними наслщками.
Для щентифкаф та юльюсноУ характеристики iзонiазиду у тканинах загиблих собак використовують вмiстиме шлунка трутв.
При використаннi в якостi матриц вмiстимого шлунку трупiв собак його за необхщносп гомогенiзували, депротеУызували, центрифугували 20 хв. за юмнатноУ температури iз швидкiстю 4500 об/хв. Пкля цього до 300 мм3 метанолу додавали 100 мм3 надосадовоУ рщини з проби i перемiшували на вортекс 15 секунд. Одержанi таким чином екстракти аналiзували з використанням рщинноУ хроматографiУ.
Видiлення та кшьюсне визначення iзонiазиду у бiологiчнiй матриц методом РХ-МС/МС здiйснювали за допомогою рiдинного хроматомас-спектрометра «Wаters» з подвмним мас-детектором.
Таблиця 1. Характеристики похибок вимiрювань та валiдацiйнi данi
..... Границя сумарноУ
Д|апазон вим1рювань Допустима розб1жн1сть м1ж . . J
... . вшносноУ похибки при
№ Назва анал!ту масовоУ частки воыазиду, двома паралельними . ___
, „, дов1рч1й ймов1рност1
мкг/мл результатами, % „
к у Р=0,95%
1 lзонiазид 10 - 1000 20 30
При цьому д!апазон вим!рювань становив 10-10000 мкг/мл (табл. 1). Для даного анал!зу застосовували колонку анал!тичну обернено-фазну Waters C18 100x2.1mm ID, 3,5р. В якосп стандарту використовували iзонiазид VETRANAL® analytical standard. Тривалкть хроматографування становила 5 хв., град!ент (рухома фаза) А: 100% метанол В: 0,1% розчин мурашиноУ кислоти. Елюювання iзонiазиду проводили зг1дно схеми, наведеноУ в табл. 2.
Таблиця 2. Стввщношення град!ент!в А та В
Час А (100% метанол) В (0,1% розчин мурашиноУ кислоти)
0 20 80
1 20 80
2 80 20
3 80 20
4 20 80 5 20 80
Проводячи дослщження на мас-спектрометрi задаються параметри наведен у табл. 3. Час виходу iзонiазиду залежить вщ змiни градieнту, витрати елюенту, колонки.
Використовуючи рщинний хроматомас-спектрометр або колонки iншого типу, умови проведення аналiзу, порядок виходу компоненлв та вiдносний час утримання можуть бути Ышими.
Умови виконання вимiрювань пiдлягають перевiрцi та, за потреби, корегуванню в наступних випадках:
а) при використанн рiдинного хроматомас-спектрометра ЫшоУ марки;
б) при зам^ колонок;
в) пiсля ремонту вузлiв рiдинного хроматомас-спектрометра, що впливають на чутливкть детектора.
Таблиця 3. Параметри введення даних для проведення дослщжень на рщинному хроматомас-спектрометрi
Компонент Материнський юн Дочiрнi iони Напруження на конус Енерпя зiткнення lзонiазид_138_79 ; 121_60_22_
Рщинний хроматомас-спектрометр калiбрують за градуювальними розчинами. За результат аналiзу приймають середне арифметичне результатiв двох паралельних визначень, розбiжнiсть мiж якими не перевищуе значення допустимо!' розбiжностi, що встановлюеться нормами точностi вимiрювань. Якщо ця умова не виконуеться, то вимiрювання повторюють для виключення грубих помилок. Пкля калiбрування рiдинного хроматографа проводять аналiз екстрактiв дослiдних зразюв, розрахунок концентрацп проводили з урахуванням площi пiкiв на хроматограмах. Як показали результати дослщжень за 2016 рк, в лабораторiю науково-дослiдного хiмiко-токсикологiчного вiддiлу Державного науково-дослiдного iнституту з лабораторноУ дiагностики та ветеринарно-саытарноУ експертизи надмшло 13 зразкiв вмiстимого шлунку трупiв собак, якi загинули з невстановлених причин, з них 6 зразюв виявилося позитивними щодо отруення Ух ¡зонмазидом (рис. 1).
й (-1
2
Рисунок L Нвень 130ш азиду у вмктимоыу шлунку трушв собак шо загинули в 2016 рощ
Як видно з рис. 1, концентра^я iзонiазиду у вмктимому шлунку загиблих собак (проби 1 i 2) досить незначна, незважаючи на те, що ймовiрною причиною Ух загибелi був вказаний препарат. У вмктимому шлунку собак (проби № 3, 5 та 6) вмкт iзонiазиду вищий в деюлька разiв порiвняно з результатами проби № 1 i 2, що вказуе про рiзну дозу цього засобу, яка потрапила в шлунково-кишковий тракт тварин, а також, можливо, це пояснюеться дещо меншим термЫом перебування iзонiазиду в органiзмi собаки, що сприяло меншому всмоктуванню даноУ дiючоУ речовини в кров iз шлунку, або ж проходження його в наступи вiддiли системи травлення - кишечник, чи в процес блювоти - назови. Особливо високою виявилася концентра^я iзонiазиду у вмктимому шлунку собаки (проба № 4), яка бтьше нiж в 10 разiв перевищувала аналогiчний показник у дослщжуваних пробах № 3, 5 та 6, що з високою вiрогiднiстю вказуе на значну кшьюсть цього препарату у корм^ який з'Ула загибла тварина, а також про незначний термН що пройшов пiсля надходження його в оргаызм.
Як показали результати дослщжень вмктимого шлунку загиблих бездомних i домашнiх собак за 2017 рк з 9 проб 3
виявилися позитивними (рис. 2).
1091.
Проса 1 Прооа 2 Проса 3
Рисунок 2 Р1Еень ¿зошазидуу вмктимому шлунку трутв собак, шо загинули е 2017 рощ
Як видно з одержаних даних (рис. 2), рiвень iзонiазиду у вмктимому шлунку собак в пробах 1 та 3 був високим, а в пробi № 2 вЫ був значно нижчим, однак його ктьюсть також виявилася смертельною для тварини.
В основi мехаызму токсично!' дм iзонiазиду на органiзм собак лежить блокування iзонiазидом пiридоксину, що в свою чергу приводить до порушення синтезу гамма-амiномасляноí кислоти (ГАМК), яка приймае участь в утилiзацií (засвоенню) глюкози нервовими клiтинами, впливае на кровопостачання, дихання кл™н i енергетичний обмiн органiзму в цтому. ГАМК - найважливiший гальмiвний нейромедiатор центрально' нервово''' системи, що попереджуе перезбудження i нормалiзуе тонус м^в.
Аналiзуючи данi щодо отруення iзонiазидом собак, одержанi протягом 2016 - 2017 роюв, можна прийти до висновку, що найменша смертельна концентра^я цiеí речовини, яка була виявлена у вмктимому шлунку, становила 90,5 мкг/кг, а найвища - 5799,8 мкг/кг.
Як вщомо смертельно небезпечна доза iзонiазиду для собак становить - 50 мг/кг маси тта. Отже, якщо маса собаки складае 10 кг, то ктьюсть таблеток, що можуть бути смертельними для не''' складае 2 штуки, а при мае 20 кг - 3 таблетки iзонiазиду. Однак, нав^ь якщо собаки дрiбних порщ, або цуценята крупних порщ випадково зТдять навiть 1 таблетку, то вщбудеться отруення рiзного ступеня тяжкосп. Крiм того, iзонiазид як речовина проникае через плацентарний бар'ер i видтяеться з молоком у лактуючих сук, що може спричинити не лише загибель матер^ але й цуценят як в пренатальний, так i постнатальний перiоди життя.
Висновки
Таким чином, одержав результати дослщжень дозволяють рекомендувати для щентифкацп i кiлькiсного визначення iзонiазиду у вмктимому шлунку собак як метод дiагностики отруення тварин метод рщинноУ хроматографГ'' з використанням хроматографа з подвмним мас-спектрометричним детектором. Даний метод е чутливим i за сво'ми параметрами вiдповiдае европейським вимогам.
Встановлено, що смертельна концентра^я iзонiазиду у вмктимому шлунку собак становить вщ 90,5 мкг/кг до 5799,8 мкг/кг маси тта.
503
Cnoci6 eu3Ha*-ieHHH isoHia3udy e органiзмi co6aK npu ompyeHHi
References
American Academy of Pediatrics. Committee on Infectious Diseases. Committee on the Control of Infectious Diseases. (1994). Red book: report of the Committee on Infectious Diseases. Elk Grove Village, IL: American Academy of Pediatrics. Bass, J.B. Jr., Farer, L.S., Hopewell, P.C., O'Brien, R., Jacobs, R.F., Ruben, F., Snider, D.E. Jr., Thornton, G. (1994). American Thoracic Society/Centers for Disease Control: Treatment of Tuberculosis and Tuberculosis Infection in Adults and Children. Amer. J. Respir Crit Care Med, 149(5), 1359-1374.
Bajaj R., Nangia H., Jain C.L. (1991). Colorimetric deterrninaition of isoniazid in formulation by cornplexation with nicel (n) and copper (n) picrates. J. Indian chem. 1991. 68, 9. 534-535.
Bernadou J1, Nguyen M, Meunier B. (2001). The mechanism of action of isoniazid. A chemical model of activation. Ann Pharm Fr. 2001 Sep;59(5):331 -7.
Delaine T, Bernardes-Genisson V, Quemard A, Constant P, Meunier B, Bernadou J. (2010). Development of isoniazid-NAD truncated adducts embedding a lipophilic fragment as potential bi-substrate InhA inhibitors and antimycobacterial agents. Eur J Med Chem. 2010 0ct;45(10):4554-61. doi: 10.1016/j.ejmech.2010.07.016. Epub 2010 Jul 15.
Christine Dell'Amore (2014). Stray Dogs in Sochi: What Happens to the World's Free-Roaming Canines? National Geographic. Published february 8, 2014 https://news.nationalgeographic.com/news/2014/02/140206-stray-dogs-russia-sochi-olympics-killing-animals-world/
Dorohov, S.M. (2002). Farmakolohyia. Kharkov: Yzdatelskyit sentr KhAY (in Russian).
Kim, M.U., Murzagulova, M.U., Stepanova, E.F. (2014). Issledovanie biodostupnosti lekarstvennogo preparata Izoniazid-D tabletki dispergiruemyie. Fundamentalnyie issledovaniya, 3, 766-769 (in Russian).
Manufactured for: Sandoz Inc., Princeton, NJ 08540. Manufactured by: Epic Pharma, LLC, Laurelton, NY 11413. Revised: Apr 2016.
Melentev, A.B., Lavrenteva, A.V. (2011). Opredelenie izoniazida v trupnoy krovi i plazme metodom vyisokoeffektivnoy zhidkostnoy hromatografii s diodno-matrichnyim detektorom. Sudebno-meditsinskaya ekspertiza, 4, 27-30 (in Russian). Nguyen M, Quemard A, Broussy S, Bernadou J, Meunier B. (2002). Mn(III) pyrophosphate as an efficient tool for studying the mode of action of isoniazid on the InhA protein of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 2002 Jul;46(7): 2137-44.
Schraufnagel, D.E. (1990). Testing for Isoniazid; Chest (United States), 98(2), 314-316.
Wang, A., Zhang, W., Sun, J., Liu, J., Sang, Y., Gao, S., He, Z. (2007). HPLC - MS Analysis of Isoniasid in dog plazma. Chromatographia, 66(9), 741 -745.
Zakon Ukrainy Pro vnesennia zmin do deiakykh zakonodavchykh aktiv Ukrainy shchodo zaprovadzhennia humannoho stavlennia do tvaryn vid 22.06.2017 № 2120-VIII chynnyi z 04.08.2017 Available from: http://search.ligazakon.ua/! doc2.nsf/link1/T172120.html/ Accessed on 12.01.2018 (in Ukrainian).
Citation:
Bayer, O.V. Bondarets, O.V., Dobrozhan, Yu.V., Liniichyuk, N.V., Stupak, O.M., Dereviaga, G.I., Shevchenko, L.V., Mykhalska, V.M. (2018) Diagnosis of isoniazid poisoning in dogs. Ukrainian Journal of Ecology, 8(1), 498-502. I ("OE^^^MlThk work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0. License
