CC BY
20
Ukrainian Journal of Ecology
Ukrainian Journal of Ecology, 2018, 8(1), 966-974 doi: 10.15421 /2018_300
ORIGINAL ARTICLE UDC 638.16.3:614.31:547.546/547.47:543.544
The development and validation of a rapid method for the
determination of nitrofurans in honey using high pressure liquid chromatography - tandem mass
spectrometry (UPLC-MS-MS)
O.V. Bayer1, O.S. Yaremchuk2, T.V. Yevtushenko1, L.V. Shevchenko3, V.M. Mykhalska3, Yu.V. Dobrozhan1, Ya.V. Dovhopol1, R.L. Varpikhovskyi2
1State Research Institute laboratory diagnostics and veterinary-sanitary expertise, Kiev, Ukraine 2 National Agrarian University of Vinnytsia, Vinnytsia, Ukraine 3National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Kiev, Ukraine E-mail: kot30@meta.ua, yarem4uk@vsau.vin.ua, t yevtuchenko@ukr.net, shevchenko laris@ukr.net, vitam@bigmir.net, alamerster@gmail.com, dndildvse@vetlabresearch.g, verel17@rambler.ru
Received: 15.02.2018Accepted: 23.03.2018
Over the past decade, Ukraine has been one of the leaders in exporting honey to EU countries. The main obstacle to increasing the export of Ukrainian honey to EU countries is the discrepancy of honey safety indicators with the requirements of importing countries. This is due to the use of a significant number of drugs with antimicrobial spectrum of action in the treatment and prevention of diseases of bees, the remains of which fall into honey. In domestic honey, according to recent data, the remains of such groups of antibiotics and antimicrobial agents as chloramphenicol, nitrofuran, nitroimidazole, sulfanilamides, tetracyclines and aminoglycosides are most commonly found.The nitrofurans, which are quite stable, can be stored in honey for a long time and are not destroyed even at high temperatures. Therefore, the urgent question remains the development and introduction into practice of laboratory analysis of a sensitive and reliable method for determining the residual amounts of nitrofurans in honey.The method developed by us allows us to determine the residual amounts of metabolites of nitrofurans in honey, namely: furazolidone derivative - 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ), furaltadone-3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone (AMOZ), nitrofurase-semicarbazide SEM) and nitrofurantoin-1-aminohydandomine (AHD).The use of drugs nitrofuran number in the treatment and prevention of infectious diseases of bees involves the receipt of their metabolites in honey in the human body.The conducted studies revealed that nitrofurantoin (38% of honey samples) was used most often in beekeeping, followed by fureladone (24%), while nitrofurase and furazolidone were used equally in 19% of honey samples, respectively.The conducted studies revealed 4 metabolites of nitrofurans in natural honey, namely the metabolite furazolidone 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ), nitrofurase-semicarbazide (SEM), furaltadone-3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone (AMOZ), and nitrofurantoin - 1-aminohydandomine (AHD).The content of 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ) and semicarbazide (SEM) in honey exceeds the MDR by the norms of Ukraine. According to EU norms, the content of 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone (AMOZ) and 1-aminohydinotin (AHD) in honey exceeds MDR and the semicarbazide content (SEM) permissible concentration.
Key words: nitrofurans; metabolites; liquid chromatography; mass spectrometry; bee; honey
Розробка та оцшка придатност методу визначення
штрофурашв в мед1 за допомогою рщинно! хроматографп високого тиску -тандемно! мас-спектрометрп (UPLC-MS-MS)
О.В. Байер1, О.С. Яремчук2, Т.В. Евтушенко1, Л.В. Шевченко3, В.М. Михальська3, Ю.В. Доброжан1, Я.В. Довгопол1, Р.Л. Варп1ховський2
1Державний науково-досл'1дний iHcmumym з лабораторной д'1агностики та ветеринарно-сан'тарно)'
експертизи, м. Кив 2Bíhhu^kuü на^ональний аграрний yHieepcumem, м. Bíhhuця, Украна 3Нацюнальний унверситет б'юресурав i природокористування Украни, м. Кив E-mail: kot30@meta.ua, yarem4uk@vsau.vin.ua, t yevtuchenko@ukr.net, shevchenko laris@ukr.net, vitam@bigmir.net, alamerster@gmail.com, dndildvse@vetlabresearch.g, verel17@rambler.ru
За останн десятил^тя УкраУна е одним з лiдерiв за експортом меду до краУн ЕС. Основною перешкодою на шляху збтьшення експорту украУнського меду до краУн ЕС, е невiдповiднiсть показникiв безпеки меду вимогам краУн iмпортерiв. Це пов'язано з використанням значноУ кiлькостi препаралв з антимiкробним спектром дГУ при лкуваны i профiлактицi хвороб бджт, залишки яких потрапляють у мед. У в^чизняному медi за остаными даними, найчастiше виявляють залишки таких груп антибютиюв та антимiкробних препаралв, як хлорамфенiкол, нiтрофуран, нiтроiмiдазол, сульфантамщи, тетрациклiни та амiноглiкозиди. Особливу небезпеку створюють нiтрофурани, якi досить стмю, можуть тривалий час зберiгатися у медi i не руйнуються нав^ь за високоУ температури. Тому актуальним питанням залишаеться розробка та впровадження в практику лабораторного аналiзу чутливого та надмного методу визначення залишкових кiлькостей нiтрофуранiв у медi.Розроблений нами метод дозволяе визначати залишковi ктькосл метаболiтiв нiтрофуранiв у медi, а саме: похщне фуразолiдону - 3-амЫо-2-оксазолщинон (AOZ), фуральтадону - 3-амЫо-5-морфолЫометил-2-оксазолщинон (AMOZ), нiтрофуразону - семiкарбазид (SEM) та ытрофурантоУну - 1-амiногидантоiн (AHD).Використання препаратiв нiтрофуранового ряду при лкуваны i профiлактицi iнфекцiйних захворюваннях бджт передбачае надходження Ух метаболтв у складi меду в органiзм людини. Проведеними дослiдженнями виявлено, що найчаслше в бджiльництвi використовуеться ытрофурантоУн (38 % зразюв меду), на другому мкц за частотою виявлення знаходиться фуральтадон (24 %), а ытрофуразон i фуразолiдон використовуються в однаковм мiрi - по 19 % зразюв меду вiдповiдно.Проведеними дослiдженнями виявлено 4 метаболии нiтрофуранiв у медi натуральному, а саме метаболiт фуразолщону - 3-амiно-2-оксазолiдинон (AOZ), нiтрофуразону - семкарбазид (SEM), фуральтадону - 3-амЫо-5-морфолiнометил-2-оксазолiдинон (AMOZ) та ытрофурантоУну - 1-амЫогидантоЫ (AHD).Вмiст 3-амiно-2-оксазолiдинон (AOZ) та семкарбазиду (SEM) у медi перевищуе МДР за нормативами УкраУни. За нормативами ЕС вмiст 3-амЫо-2-оксазолщинон (AOZ), 3-амiно-5-морфолiнометил-2-оксазолiдинон (AMOZ) та 1 -амЫогидантан (AHD) в медi перевищуе МДР, а вмкт семiкарбазиду (SEM) не перевищував максимально допустимо!' концентраций Ключов1 слова: нiтрофурани; метаболiти; рщинна хроматографiя; мас-спектрометрiя; бджоли; мед
Вступ
Ефективнiсть виробництва меду суттево залежить не лише вщ продуктивностi медоноав, але й вiд фiзiологiчного стану бджолоамей. Вiдомо, що бджолинi ам'У, якi забезпечують медову продуктивнiсть паск, часто заражаються iнфекцiйними та Ывазмними хвороби, що передбачае застосування Ум препаралв з антимiкробним спектром дм, у тому числi антибiотикiв, сульфанiламiдiв та нiтрофуранiв. В УкраУн дозволено використовувати у бджiльництвi антибiотики як бюстимулятори, що здатнi пiдвищувати продуктивнкть бджолосiмей, як профiлактичнi та лкувальы засоби проти iнфекцiйних захворювань бджт. Це певною мiрою обумовлено ^матичними умовами, якi пов'язанi з виникненням рiзких перепадiв температури навколишнього середовища, особливо в холодний перiод року, що призводить до попршення медоносноУ бази, стресу та зниження резистентносл бджолосiмей.
В краУнах Европейського Союзу з 1995 року дiе заборона наявносл антибiотикiв у медi. Це означае, що Ух не можна застосовувати нав^ь при лкуваны бджт. У Сполучених Штатах Америки i Канадi у нормативно-техычних документах зазначено, що мед не повинен мати у своему складi сторонах речовин (в тому чиш i антибютиюв), iнакше вiн вважаеться фальсифiкованим.
На жаль, в УкраУн нинi е чинними стандарти нацюнальы, е ще частково чиннi ДСТУ, е чины техычы умови, але жодного техычного регламенту на харчовi продукти немае (Beltiukova S. V., 2013; Department of Health, 2009). У ДСТУ на мед зазначено, що у його складi можуть бути ытрофурани, левомщетин, а стрептомщин та тетрациклЫ не дозволенi (Kosenko Yu. M. et al., 2005; Med naturalnyi, 2005).
Важливим чинником формування складу меду е також медоносна база, частота i види обробки медоносних культур пестицидами, як також мiгрують в ланцюгу грунт - вода - рослина (пилок, нектар) - мед (Jorge Barbosa et al., 2007).
ВГдомо, що ытрофурани e другим пкля сульфанiламiдiв класом синтетичних антибактерiальних препаратГв з широким спектром дП', як застосовуються бiльше нiж при 10 захворюваннях iнфекцiйноï природи бджiл. До препаратГв цieï групи вiдносяться ытрофурал, нiтрофурантоïн, нiфурател, нiфуроксазид, фуразидин та фуразолГдон (Levchenko V. ta in., 2012; Chung-wei Tsai et al., 2010; Barbosa, J. et al., 2011; Verdon, E. et al, 2007). Вказаы препарати ефективы щодо багатьох грамнегативних (E. coli, K. pneumoniae i íh.) та грампозитивних бактерм, деяких анаеробiв, грибiв роду Candida. КрГм того, фуразолiдон i ыфурател активнi щодо деяких найпроспших (лямблп, трихомонади). Будучи акцепторами кисню, нiтрофурани порушують процес клГтинного дихання бактерм, Ыпбують бГосинтез нуклеУнових кислот та, залежно вГд концентраций проявляють бактерГостатичну або бактерицидну дГю (Zhang et al., 2016; Shankar, B. P. et al, 2010). ЫтрофурановГ препарати в молекулГ мГстять нГтрогрупу - NO2, яка обумовлюе сильну антимГкробну дГю (Radovnikovic, A. et al., 2011). АнтимГкробнГ препарати як правило згодовують бджолам в складГ з сиропу. Такий споаб придатний, якщо невеликГ ам'У розмГщенГ в однокорпусному вулику. СГм'У у вуликах з декГлькома корпусами запасають сироп пГд годГвницею, тому робочГ бджоли не використовують сироп з антимГкробними препаратами вГдразу ж для годГвлГ розплоду. КрГм того, Гснуе небезпека перенесення сиропу в медовГ корпуси, звГдки вГн може бути вГдкачаний. Згодовування лГкГв бджолам з великою юльюстю сиропу може обмежити поширення ГнфекцГйних хвороб, але не завжди забезпечуе повний ефект. КрГм згодовування, антибактерГальнГ препарати використовують у виглядГ розпилення з цукровою пудрою на верхнГ планки рамок, що не дозволяе контролювати Ух дозування бджолам. Наступний шлях надходження антимГкробних засобГв у мед - це дрГбнодисперсне розпилення розчинГв препаратГв над розплодом бджГл пГд час якого ветеринары препарати потрапляють на бджГл-годувальниць, якГ очищаючи одна одну, заковтують сироп з лГкарськими засобами.
ВГдомо, що мед проходить дослГдження на вГдповГднГсть вГтчизняному стандарту, а продущя, призначена на експорт, повинна вщповщати вимогам краУни - Гмпортера.
У першу чергу ця проблема гостро стоУть перед виробниками меду, а також перед гуртовими закупГвельниками продукци бджГльництва. Такий продукт повинен вГдповГдати вимогам Директив 96/22/£ЕС та 96/23/ŒC, Постанови Ради (£С) 2377/90 (Council Directive 96/22/EC, 1996; Council Directive 96/23/EC, 1996).
При виявленнГ лабораторГею ветеринарноУ медицини невГдповГдностГ продукци встановленим вимогам, публГкуеться попередження про виявленГ вГдхилення i невГдповГднГсть даноУ продукц^' вимогам безпеки чинним для конкретно)' краУни чи краУн £С. КрГм того, при встановленнГ невгдповГдносп якостГ та безпечностГ продукцГУ у референсый лабораторГУ краУни-Гмпортера, цГ данГ публГкуються в загальноевропейськГй системГ безпеки продуклв (César Aquiles Lázaro de la Torre et al., 2015).
Вс цГ заходи щодо контролю якосп i безпечностГ продукцГУ, у тому числГ меду натурального на вмГст антимГкробних засобГв обумовленГ Ух потенцГйною небезпекою для здоров'я людини. Попередження багатьох краУн свГту щодо заборони Гмпорту меду з залишковими кГлькостями антимГкробних засобГв призвели до посилення контролю в ньому залишюв цих препаратГв, що, у свою чергу, передбачае розробку надГйних та чутливих методГв Ух контролю. Метою роботи було модифГкувати та валГдувати метод, здатний визначити залишки метаболтв нГтрофуранГв в медГ на рГвнГ ССа 0,5 мкг/кг за допомогою РХ-МС-МС.
Матерiали i методи дослiдження
ДослГдження проводили на базГ науково-дослГдного хГмГко-токсикологГчного вГддГлу Державного науково-дослГдного Гнституту з лабораторноУ дГагностики та ветеринарно-санГтарноУ експертизи (ДНД1ЛДВСЕ). Визначення залишкових кГлькостей метаболГтГв нГтрофуранГв проводили методом рщинноУ хроматографГУ з використання квадрупольного мас-спектрометра Waters XEVO та аналГтичною колонкою обернено-фазною Waters C18 100x2.1 mm ID, 3,5р. Даний метод дозволяе визначати метаболии нГтрофуранГв: фуразолГдону, який метаболГзуеться в 3-амГно-2-оксазолГдинон (AOZ), фуральтадону, який метаболГзуеться в 3-амГно-5-морфолГнометил-2-оксазолГдинон (AMOZ), нГтрофуразону, який метаболГзуеться в семГкарбазид (SEM) та ытрофурантоУну, який метаболГзуеться в 1 -амЫогидантоЫ (AHD).
Принцип методу полягае в дериватизаци продукту за допомогою 2-ытробензальдепду, наступноУ ГнкубацГУ протягом 16 годин при температурГ 37°С та екстракцГУ етилацетатом.
Для пГдготовки зразкГв та проведення аналГзу використовували реактиви компани Sigma-Aldrich (НГмеччина). МатерГалом дослГдження були зразки меду, додатково перевГренГ з використанням методу високоефективноУ рГдинноУ хроматографГУ i мас-спектрометрГУ на вГдсутнГсть у них залишкГв нГтрофуранГв.
Збагачення контрольних зразюв проводили стандартними розчинами для встановлення ССа, на рГвнях 0,25; 0,5 та 1 мкг/кг. В роботГ використовували сертифГкованГ субстанци: 3-амГно-2-оксазолГдинон (AOZ), 3-амЫо-5-морфолЫометил-2-оксазолГдинон (AMOZ), семГкарбазид (SEM) та 1 -амЫогидантан (AHD, фГрми Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO. США). Основы стандарты розчини з концентрацГею 1 мг/мл вказаних нГтрофуранГв готувались шляхом розчинення в ацетонГтрилГ.
РобочГ стандарты розчини кожного ытрофурану та комплексний стандартний розчин уах чотирьох нГтрофуранГв готували шляхом двостадГйного розведення основних стандартних розчинГв: в перший стадп - ацетонГтрилом (до концентраци 10 мкг/мл), а в друпй (до концентраци 100 нг/мл) - 0,1 % мурашиый кислотГ. Для ГдентифкацП' нГтрофуранГв використовували також внутршы стандартнГ зразки для кожного ытрафурану окремо AMOZ-D5, AOZ-D4, AHD-13C13, SEM -15N2,13C*HCL.
КГлькГсне визначення масовоУ концентраци нГтрофуранГв проводили методом зовнГшнього стандарту за здмсненим попередньо калГбруванням хроматографа за градуювальними розчинами. 1дентифГкацГю проводили за часом утримання, наявнГстю вщповГдних ГонГв та спГввГдношенням УхньоУ Ытенсивносл.
Результати дослщжень та Ух обговорення
Для визначення ытроароматичних сполук у складних матрицях, таких як мед натуральний, переважно використовують методи високоефективно' рiдинноí хроматографи у поеднанн i3 мас-спектрометричним детектором та
iмуноферментний аналiз (Novozhytska et al. 2014; Guidelines for the validation....., 2010; Leitner et al, 2001; Szilagyi., 2006).
Подготовку зразка проводили за наступною схемою: до зразка меду в кшькосл 2 г вносили сумш стандартних розчиыв та сумiш внутрiшнiх стандартних розчиыв, пiсля струшування додавали 4 мл води, 0,8 мл 1 М розчину соляно' кислоти та 150 мкл 0,1 М дериватизацмного розчину 2-ытробензальдепду.
Пiсля змiшування дослщного зразка протягом 2 хв. на вортекс та 5 хв. на шутелi проводили iнкубацiю його 16 годин при температурi 37°С в термостал. Через добу при юмнатнм температурi до зразка додавали 5 мл 0,1 М розчину дикал^ пдроген фосфату та доводили рiвень рН до 7,5 2 М розчином пдроксиду натрiю.
Для проведення екстракци додавали 5 мл етилацетату, змшували на роторi 20 хв. та центрифугували при радiальному прискоренн 4000 об/хв.. протягом 10 хв. при температурi 4°С. Пiсля цього переносили етилацетатовий екстракт в полтроптенову пробiрку та повторювали екстракцiю етилацетатом у кшькосп 5 мл.
Подвмний екстракт випаровували досуха пiд струменем азоту при температурi 40-50°С. Полм перерозчиняли сухий залишок у 200 мкл 0,1 % розчин мурашино' кислоти i додавали 500 мкл гексану для знежирення. Пкля змшування сумiшi нижню фракцiю в кшькосл 150 мкл вiдбирали для дослщження пiсля попереднього фiльтрування. Дослiдження проводили на рщинному мас-спектрометрi Wаters XEVO TQ-S micro (США).
Хроматографування зразюв проводили в градiентному режимi, система ацетоытрил / 0,1 % розчин мурашино''' кислоти в водi, швидюсть потоку 0,4 мл/хв. lонiзацiю проводили в режимi позитивно' iонiзацií по продукт-юнах (таблиця 1).
Таблиця 1. Параметри введення даних для проведення дослщжень на рщинному хроматографi з подвмним мас детектором Wаters XEVO TQ-S micro
Компонент Материнський юн Дочiрнi iони Напруження на конуа Енерпя з^кнення
AOZ 236 104 134 28 12
AMOZ 335 262 291 28 12
SEM 209 166 192 25 10
AND 249 134 178 28 15
AMOZ-D5 340 296 28 10
AOZ-D4 240 134 28 25
SEM-15N2,13C*HCL 212 168 28 15
AND -13C13 252 134 28 15
Пщтверджуючий метод був валщований у вiдповiдностi до Ршення £Bp0K0Micii 2002/657/ЕС. (Commission Decision, 2002). Протягом процедури валщацп встановлено таю параметри: спец^чнкть, селективнiсть, T04HicTb, лЫйнкть, внутрiшньо-лабораторна вiдтворюванiсть, вiдсоток витягу, межа прийняття ршення (ССа) та здатнкть виявлення (ССр). Bci цi дан отримали при використаннi програмного забезпечення InterVal Software компаыУ quo data GmbH (Ымеччина).
ССа е важливим показником для оцiнювання придатностi пщтверджуючих методiв, а ССр - для скринЫгових. ССа - межа ршення, вище якоУ можна прийти до висновку з iмовiрнiстю помилки а, що зразок е невiдповiдним. ССр - це найменший вмiст дослщжуваноУ речовини, який можна виявити, щентифкувати або визначити кiлькiсно у пробi з iмовiрнiстю похибки р.
Bci ц параметри визначали при проведены оцЫки придатностi методу за зразками меду (всього 32 зразки) збагачен аналтом на рiвнi 0; 0,25; 0,5; 1,0 валщацмного рiвня, дослщження проводили 2 днi двома операторами. Попередньо був в^браний мед рiзнотрав'я гомогенiзований та перевiрений на наявнкть залишкiв нiтрофуранiв, яких не було виявлено. Точнкть методу оцiнювали за пщрахунком середньостатистичного вiдхилення результатiв, отриманих для кожноУ концентрацiУ.
Витяг вираховували за концентра^ею навантажених певною кшьюстю аналiту контрольних зразкiв. ССа та ССр визначали за калiбрувальною кривою, побудованою при збагаченнi рiзними концентра^ями стандарту матрицi, як описано у ISO 11843 (Capability of detection... 2003).
В результат проведених дослщжень, отриманн наcтупнi валiдацiйнi данi: AMOZ (3-амЫо-5-морфолЫометил-2-оксазолщинон)
Таблиця 2. Критичнi концентрацп та рiвень iнтереciв, мкг/кг_
PiBeHb iHTepeciB ССа ССр
0,40 0,47 0,61
Таблиця 3. Повторюванкть, внутршня лабораторна вщтворюванкть та вiдсоток повернення_
Концентращя, sr, Rel. sr swR Rel. swR Вщсоток
мкг/кг мкг/кг ,% мкг/кг ,% повернення, %
0,250 0,041 16,6 0,041 16,6 95,6
0,375 0,040 10,7 0,040 10,7 98,4
0,500 0,040 7,9 0,040 7,9 99,8
0,750 0,039 5,2 0,058 7,7 101,2
1,000 0,039 3,9 0,082 8,2 101,9
Примака: Sr - Repeatability standard deviation (стандартне вщхилення повторюваносп), Rel Sr - Коефiцiент варiацiï повторюваносп перерахований в %; SwR- In-house reproducibility standard deviation (стандартне вщхилення внутршньо лабораторноУ вщтворюваносл); Rel SwR - Коефщieнт варiацiï вiдтворюваностi перерахований в %.
AOZ (3-амiно-2-оксазолiдинон)
Таблиця 4. Критичн концентраци ССа та ССр та рiвень iнтересу, мкг/кг
Рiвень iнтересiв ССа CCß
0,40 0,48 0,62
Таблиця 5. Повторюванкть, внутрiшня лабораторна вiдтворюванiсть та вщсоток повернення
Концентра^я, sr , Rel. sr, % swR, мкг/кг Rel. swR, % Вщсоток повернення,
мкг/кг мкг/кг %
0,250 0,040 16,0 0,040 16,0 105,3
0,375 0,041 10,9 0,041 10,9 103,2
0,500 0,041 8,2 0,041 8,2 102,2
0,750 0,042 5,6 0,043 5,8 101,2
1,000 0,042 4,2 0,045 4,5 100,7
SEM (семiкарбазид)
Таблиця 6. Критичн концентраци ССа та ССр та рiвень iнтересу, мкг/кг
Рiвень iнтересiв
0,40
ССа
0,46
CCß
0,58
Таблиця 7. Повторюванкть, внутрiшня лабораторна вiдтворюванiсть та процент повернення Концентра^я, sr, Rel. sr swR Rel. swR
мкг/кг мкг/кг ,% мкг/кг ,%
0,250 0,375 0,500 0,750 1,000
0,031 0,031 0,031 0,032 0,032
12,2 8,3 6,3 4,2 3,2
0,031 0,031 0,035 0,041 0,045
12,2 8,3 6,9 5,5 4,5
Вщсоток
повернення
%
104,6 103,0 102,2 101,4 101,0
AHD (1-амЫогидантоЫ)
Таблиця 8. Критичн концентраци ССа та ССр та рiвень Ытересу, мкг/кг
Рiвень iнтересiв
0,40
ССа
0,48
CCß
0,61
Таблиця 9. Повторюванкть, внутрiшня лабораторна вщтворюванкть та процент повернення
Концентра^я, sr, Rel. sr swR Rel. swR Вщсоток повернення,
мкг/кг мкг/кг ,% мкг/кг ,% %
0,250 0,036 14,4 0,036 14,4 103,8
0,375 0,037 9,8 0,037 9,8 101,4
0,500 0,037 7,4 0,039 7,9 100,1
0,750 0,038 5,0 0,051 6,7 98,9
1,000 0,038 3,8 0,061 6,1 98,3
З отриманих даних можна зробити висновок, що Bci результати одержав при пщрахунку вщтворюваносп та повторюваносп входять в допустимi межi згiдно рiшення £С 657/2002 на рiзних рiвнях валiдацiï вщ 0,25 до 1 мкг/кг.
Таблиця 10. Коефщieнт варiацiï для кшьюсних методiв, (згiдно рiшення £С 657/2002)
Масова частка
< 1 мкг/кг 1-10 мкг/кг 10-100 мкг/кг 100-1000 мкг/кг (1 мг/кг)
Коефщкнт варiацiï (%)
*
32 23 16
* Для масових часток менших за 1 мкг/кг застосування Рiвняння Хортвща дае неприпустимо висок значення, тому CV для концентрацм менших 1 мкг/кг повинн бути мiнiмальнi
Акредитованi вiтчизнянi лаборатори ветеринарноУ медицини, в основному, визначають показники безпеки необроблених харчових продуклв тваринного походження скринiнговими методами. I вщповщно до рiшення £С 657/2002 (Commission Decision.... 2002), для виконання нацюнальних плаыв Державного монiторингу залишкових кiлькостей ветеринарних препаратiв та забруднюючих речовин у живих тваринах, продуктах тваринного походження i кормах, а також харчових продуктах, пщконтрольних ветеринарнм службi, у разi отримання позитивних скринЫгових результатiв необхiдно проводити дослщження в акредитованих лабораторiях iз застосуванням пщтверджуючих методiв, чим i являеться наш метод.
В результат дослщжень лаборатори науково-дослщного хiмiко-токсикологiчного вiддiлу Державного науково-дослiдного iнституту з лабораторноУ дiагностики та ветеринарно-санiтарноУ експертизи (ДНД1ЛДВСЕ) за 2015-2017 роки було проаналiзовано 1169 зразкiв меду натурального рiзного походження на вмкт метаболiтiв нiтрофуранiв. При цьому встановлено, що зi 146 зразкiв, меду, як надiйшли в лабораторiю для аналiз у 2015 роц^ лише 1,4 % мiстили залишки нiтрофуранiв у концентрацiУ, що не перевищувала МДР.
У 2016 роц з 581 зразка меду, залишки ытрофураыв було виявлено у 3,4 % проб, тодi як у 2017 роц з 442 зразюв меду всi виявилися негативними щодо вмiсту нiтрофуранiв.
Це вказуе на припинення Ух використання для лкування та профшактики Ыфещйних захворювань бджiл. Детальний аналiз одержаних даних свщчить, що застосування бджолам ытрофуразону спричиняе накопичення його метабол^у - семiкарбазиду (SEM) в медi (рис. 1) в концентрацiях вщ 0,79 до 1,06 мкг/кг.
Враховуючи, що на вмiст нiтрофуразону та його метаболтв у медi у чинних нормативних документах УкраУни обмеження не поширюеться, його, часто застосовують у господарствах при iнфекцiйних захворюваннях бджiл, особливо при аскоферозi методом дрiбнодисперсного розпилення над розплодом. Потрапляння його в оргаызм робочих бджш сприяе включенню у метаболiчнi процеси з наступним перетворенням в семкарбазид та видiленням з органiзму у мед, де вЫ може тривалий час збер^атися.
Крiм нiтрофуразону, при цьому ж захворюванн бджiл може використовуватися i фуразолiдон, як д^ча речовина препарату ноземацид, який застосовуеться при нозематозi бджiл. Причому Ыструщя з застосування цього препарату передбачае використання меду, одержаного пкля обробки бджш на загальних пщставах. Останнм в органiзмi бджiл трансформуеться у 3-амЫо-2-оксазолщинон (AOZ) i також потрапляе у мед (рис. 2).
Як показали результати дослщжень, залишковий вмкт 3-амiно-2-оксазолiдинону (AOZ) у всiх зразках меду, який надмшов для аналiзу, перевищував МДР бiльш, нiж у 2 рази за винятком зразка № 1. Це вказуе на застосування цього ытрофурану бджолам, ймовiрно, не лише з лкувальною, але й профшактичною метою.
Використання фуральтадону при лкуваны та профтактиц iнфекцiйних захворюваннях бджiл сприяе накопиченню його метаболiту 3-амiно-5-морфолiнометил-2-оксазолiдинону (AMOZ) у мед^ причому в концентрацiях як в ycix випадках (рис. 3), хоча й незначною мiрою, але перевищували МДР (0,6 мкг/кг), що передбачае заборону на використання цих партм меду в якосп харчового продукту.
Як видно з одержаних даних, найбтьш поширеним препаратом з групи ытрофураыв у бджiльництвi виявився ытрофурантан. Про це свiдчить залишковий вмiст 1 -амiногидантоíну (AHD) у зразках меду. При цьому слщ вiдмiтити, що нiтрофурантоíн, ймовiрно, використовувався як у рiзних концентрацiях, так i з рiзною тривалiстю обробок, осктьки залишковий вмiст його метабол^ - 1 -амiногидантоíну (AHD) у медi коливався вiд 1,09 до 4,3 мкг/кг (рис. 4).
Поширена практика використання цього препарату при лкуваны та профтактиц захворювань бджт пов'язана, ймовiрно, з вiдсутнiстю обмеження його вмкту в чинних нормативних документах УкраУни на мед натуральний. Аналiз частоти виявлення в медi бджолиному залишкових кiлькостей метаболiтiв нiтрофуранiв показав, що найчаслше при лiкуваннi i профтактиц захворювань бджiл iнфекцiйноï природи використовуеться ытрофурантоУн, на другому мiсцi за частотою виявлення знаходиться фуральтадон, а ытрофуразон i фуразолщон використовуються в однаковм мiрi (рис. 5).
■ SEM
■ AOZ
■ AMOZ
■ AHD
Рисунок 5 СгпЕЕ1дношення мтрофурамв.. виявлених у мед натуральному
Таким чином, можна зробити висновок, що при вживанн меду в оргаызм людини може надходити певна юльюсть залишкiв метаболiтiв ытрофуранового ряду, якi можуть проявляти свою д^ i в органiзмi людини. Незважаючи на те, що ытрофурани малотоксичнi, але будучи окислювачами встановлено, що у новонароджених i грудних дтей можуть викликати гемолiтичну анем^ та метгемоглобiнемiю. lнодi нiтрофурани викликають порушення функцй' органiв дихання (задишка, сухий кашель, озноб, раптове пщвищення температури), легеневий фiброз. Фуразолiдон пригычуе моноамiноксидазу (МАО), тому його одночасне надходження в оргаызм з речовинами, як цей фермент iнактивують (адреналН норадреналiн, дофамiн, мезатон i Ы.), а також з iншими препаратами, як iнгiбують МАО (нуредал), i трици^чними антидепресантами несумiсне. В Ышому випадку може виникнути рiзке звуження судин, ппертоычний криз, викликанi ендогенними катехоламЫами i Ух попередниками, що всмокталися в шлунково-кишковому трактi.
Висновки
Проведено оцЫювання придатностi методу та встановлено параметри МС/МС детектування i визначено валщацмы характеристики. Даний метод е точним, практичним та уыверсальним, що пщтверджуеться отриманими даними ССа для AOZ - 0,48 мкг/кг; AMOZ - 0,47 мкг/кг; SEM -0,46 мкг/кг; AHD - 0,48 мкг/кг; вщсоток повернення складае 99,8 - 101,4 %. Ц результати задовольняють вимоги Европейських директив, у яких ытрофурани регламентуються на рiвнi 1 мкг/кг. Розроблений нами метод та впроваджений в роботу лаборатори здатний виявляти залишковi кiлькостi ытрофураыв на рiвнi 0,5 мкг/кг, що пщтверджуе його чутливiсть, точнiсть методу додатково забезпечуеться використанням внутршых дейтерованих стандарлв (AMOZ-D5, AOZ-D4, SEM-15N2,13C*HCL, AND-13C13). Унiверсальнiсть та практичнiсть методу фунтуеться на одночасному виявленнi метаболiтiв ытрофураыв в медi. На основi експериментальних даних встановлено, що методика визначення метаболтв ытрофураыв методом РХ/МС/МС е придатною для дослщження меду i може успшно використовуватися лабораторiями ветеринарноУ медицини.
Проведеними дослiдженнями виявлено 4 метаболии нiтрофуранiв у медi натуральному, а саме метабол^ фуразолiдону - 3-амЫо-2-оксазолщинон (AOZ), нiтрофуразону - семкарбазид (SEM), фуральтадону - 3-амЫо-5-морфолЫометил-2-оксазолщинон (AMOZ) та нiтрофурантоУну - 1 -амЫогидантоЫ (AHD).
Вмiст 3-амiно-2-оксазолiдинон (AOZ) та семiкарбазиду (SEM) у медi перевищуе МДР за нормативами УкраУни. За нормативами ЕС вмкт 3-амЫо-2-оксазолщинон (AOZ), 3-амiно-5-морфолiнометил-2-оксазолiдинон (AMOZ) та 1-амiногидантоiн (AHD) в медi перевищуе МДР, а вмкт семiкарбазиду (SEM) не перевищував максимально допустимо)' концентраций
References
Мета болгги ттрофуранш
19%
Barbosa, J., Freitas, A., Moura, S., Mourao, J. L., Noronha da Silveira, M.I., Ramos, F. (2011). Detection, accumulation, distribution, and depletion of furaltadone and nifursol residues in poultry muscle, liver, and gizzard. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59, 22, 11927-11934.
Beltiukova, S.V., Leventsova E.O. (2013). Metody opredelenyia antybyotykov v pyshchevykh produktakh (Obzor). Metody y obekty khymycheskoho analyza, 1, 4-13 (in Russian).
Commission Decision 2002/657/EC, 2002. Implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Off. J. Europ. Comm., No. L 221 /8.
Concerning the prohibition on the use in stockfarming of certain substances having a hormonal or thyrostatic action and of B -agonists: Council Directive 96/22/EC. Off. J. Eur. Comm., 1996. L. 125. 3-9.
CRLs (2010). Guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines (Initial validation and transfer). Community Reference Laboratories 20/1/2010
Chung-wie, Tsai, Chuan-ho, Tang, Wei-hsien, Wang (2010). Quantitative determination of four nitrofurans and corresponding metabolites in the fish muscle by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry. Journal of Food and Drug Analysis, 18(2), 98-106.
Department of Health (2009). Method of test for veterinary drug residues in foods-test of nitrofuran metabolites. Announcement No. 0981800137.
ISO 11843 Capability of detection. Part 1: Terms and definitions, Part 2: Methodology in the linear calibration case, 2003. Jorge Barbosa, Sara Moura, Rita Barbosa, Fernando Ramos, Maria Irene Noronha da Silveira (2007). Determination of nitrofurans in animal feeds by liquid chromatography-UV photodiode array detection and liquid chromatography-ionspray tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 586, 359-365
Kosenko, Yu. M., Stetsko, T. I., Sviatotska, L. O., Khomiak, O. I., Uhryn, H. P. (2005). Ekspres-metody vyznachennia zalyshkiv antybiotykiv u produktakh tvarynnytstva. Naukovo-tekhnichnyi biuleten Instytutu biolohii tvaryn i DNDKI vetpreparativ ta kormovykh dobavok, 6, 173-179 (in Ukrainian).
Leitner, A., Zollner, P., Lindne,r W. (2001). Determination of the metabolites of nitrofuran antibiotics in animal tissue by highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A, 939, 49-58.
Levchenko, V.I., Rozumniuk, A.V., Novozhytska, Yu.M. (2012). Laboratorna veterynarna toksykolohiia. Bila Tserkva: Bilotserkivska knyzhkova fabryka (in Ukrainian).
Med naturalnyi. Tekhnichni umovy DSTU 4497-2005 (in Ukrainian).
Novozhytska, Yu.M., Ivanova, O.V., Stupak, O.M., Vasyliuk, V.V., Liniichuk, N.V., Korostinska, N.V. (2014). Vyznachennia antybiotykiv u produktsii tvarynno hopokhodzhennia za dopomohoiu ridynnoho khromatomas-spektrometra: metod. vkazivky. Kiev. PP Salon soft (in Ukrainian).
On measures to monitor certain substances and residues thereof in live animals and animal products: Council Directive 96/23/EC. Off. J. Eur. Comm., 1996. L. 125. 10-32.
Radovnikovic, A., Moloney, M., Byrne, P., Danaher, M. (2011). Detection of banned nitrofuran metabolites in animal plasma samples using UHPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B, 879, 2, 159-166.
Shankar, B. P., Manjunatha Prabhu, B. H., Chandan, S., Ranjith, D, Shivakumar, V. (2010). Rapid methods for detection of veterinary drug residues in meat. Veterinary World, 3(5), 241-246.
Szilagyi, S., Calle, B. (2006). Development and validation of an analytical method for the determination of semicarbazide in fresh egg and in egg powder based on the use of liquid chromatography tandem mass spectrometry. Anal. Chim. Acta 572: 113-120. Torre, C.A.L., Blanco, J.E., Silva, J.T., Paschoalin, V.M.F., Conte Júnior, C.A. (2015). Chromatographic detection of nitrofurans in foods of animal origin. Arquivos do Instituto Biológico. Arq. Inst. Biol, 82, 1 -9. http://dx.doi.org/10.1590/1808-1657000532013 Verdon, E., Couedor, P., Sanders, P. (2007). Multi-residue monitoring for the simultaneous determination of five nitrofurans (furazolidone, furaltadone, nitrofurazone, nitrofurantoine, nifursol) in poultry muscle tissue through the detection of their five major metabolites (AOZ, AMOZ, SEM, AHD, DNSAH) by liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry—In-house validation in line with Commission Decision 657/2002/EC. Analytica Chimica Acta, 586, 1 -2, 336-347. Zhang, Y, Qiao, H, Chen, C.,Wang, Z., Xia, X. (2016). Determination of nitrofurans metabolites residues in aquatic products by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Food Chem, 1(192), 612-627. doi: 10.1016/j.foodchem.2015.07.035.
Citation:
Bayer, O.V., Yaremchuk, O.S., Yevtushenko, T.V., Shevchenko, L.V., Mykhalska, V.M., Dobrozhan, Yu.V., Dovhopol, Ya.V., Varpikhovskyi, R.L. (2018). The development and validation of a rapid method for the determination of nitrofurans in honey using high pressure liquid chromatography -tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS).Ukrainian Journal of Ecology, 8(1), 966-974. I work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0. License
