CC BY
18
УДК 619:636.4.082:575.1:577.2.
Ксьонз 1.М., кандидат ветеринарних наук, старший науковий сшвроб^ник, © (E-mail: [email protected], [email protected])
Полтавська дослгдна станщя 1нституту ветеринарног медицины УААН
ВИЗНАЧЕННЯ СПЕЦИФ1ЧНОСТ1 ТЕСТ-СИСТЕМИ ДЛЯ ЩДИКАЦП ДНК ПРЕДСТАВНИК1В РОДИНИ CHLAMYDIACEAE У ПОЛ1МЕРАЗН1Й ЛАНЦЮГОВ1Й РЕАКЦП
Проведено анал1з ПЛР-тест-системи власног розробки для гндикацгг ДНК представнитв родини Chlamydiaceae щодо гг специф1чност1. Дослгдженню за методом пол1меразног ланцюговог реакцгг тдлягали зразки ДНК хламгдофгл, лептостр та мЫоплазм. При дослгдженнг вказаних зразкгв за допомогою вказаног ПЛР-тест-системи позитивт результати отримат лише в зразках хламгдгйних матер1ал1в, що свгдчить про гг специф1чтсть.
Ключовг слова: хламгдгоз, хламгдгя, хламгдофгла, пол1меразна ланцюгова реакц1я, тест-система, ампл1ф1кац1я, електрофореграма.
Вступ. Дiагностика хламщюзу е одшею i3 найбшьших проблем у комплекс заходiв оздоровлення вщ цього захворювання як в гуманнш, так i ветеринарнш медициш [1-3]. Хоча дiагноз на хламщюз встановлюеться комплексно i3 урахуванням ешзоотолопчних даних, клiнiчних ознак хвороби та патолого-анатомiчних змiн, його вважають встановленим лише при одержанш позитивних результатiв лабораторних дослiджень при видшенш збудника хламiдiозу i3 патолопчного або клiнiчного матерiалу у культурi клiтин, на курячих ембрiонах чи лабораторних тваринах; виявленш ДНК хламщш чи хламiдофiл за методом ПЛР або виявленнi антигену збудника за методами 1ФА чи Р1Ф.
Останшм часом все бшьшо! популярностi в лабораторнш практицi дiагностики iнфекцiйних захворювань i хламiдiозу, набувае метод шдикаци ДНК iнфекцiйних агентiв за допомогою полiмеразноl ланцюгово! реакци (ПЛР). Даний метод дозволяе виявляти наявшсть збудника в зразках дослщжуваного матерiалу з високою точнiстю i чутливiстю, оскшьки вiн оснований на аналiзi генетичного апарату мжрооргашзму, який найменше тдлягае мiнливостi. За специфiчнiстю, чутливiстю i швидкiстю отримання результату даний метод дiагностики значно перевищуе усi шш^ що наразi застосовуються для дiагностики хламiдiозу [3-7].
На сьогоднi кнуе чимало тест-систем для дiагностики хламщшних iнфекцiй людей, тварин i птахiв. Однак не всi вони е рiвноцiнними за основними параметрами - специфiчнiстю та чутливiстю [8, 9].
Метою роботи е ан^з специфiчностi ПЛР-тест-системи власно! розробки для виявлення ДНК представниюв родини Chlamydiaceae, що викликають захворювання тварин i птахiв.
Матер1али та методи. Для досягнення поставлено! мети нами було проведено дослщження 9 зразюв бiологiчного матерiалу, а саме: специфiчного хламiдiйного антигену з набору для дiагностики хламщюзу в РЗК виробництва
© Ксьонз 1.М., 2009 146
ФНГУ «ВНИВИ» (г. Казань, Россия) - № 1, очищених елементарних тшець Chlamydophila pneumoniae (штам Kajaani 7) - № 2, контрольно! ДНК Chlamydophila psittaci (штам 6 BC) - № 3, трьох зразюв лептостр (штам LSU, Серовар louisiana, серогрупа Louisiana), (штам 493 Poland., Серовар polonica, серогрупа Seiroe), (штам Hond Utrecht IV, Серовар canicola, серогрупа Canicola) - №№ 4-6 i трьох зразкiв мiкоплазм (штам А-А Mycoplasma hyorginis), (штам H-B Mycoplasma hyopneumoniae), (штам Acholeplasma laideawii 2775) -№№ 7-9.
Вибiр саме цих матерiалiв пояснюеться тим, що три i3 них (№№ 1-3) мiстять ДНК того чи iншого збудника хламiдiозу, а шють (№ 4-9) е референтними штамами лептоспiр та мiкоплазм. Тому, на наш погляд, отримаш результати дослщжень, при застосуваннi розроблено! нами ПЛР-тест-системи, неспростовно продемонструють !! специфiчнiсть.
Видшення ДНК i3 зазначених зразкiв проводили сорбентним методом за допомогою набору «ДНК-сорб-В-50», який е складовою тест-системи «ХЛАКОМ» для дiагностики хламiдiозу тварин i птахiв методом полiмеразно! ланцюгово! реакци виробництва ФГУН КНИИЭ Роспотребнадзора (Россия).
Для проведення амплiфiкацil, тобто власне полiмеразно! ланцюгово! реакцi!, нами застосовувалась тест-система для виявлення збудниюв хламiдiйних iнфекцiй ссавцiв i птахiв з використанням олiгонуклеотидних праймерiв власного дизайну, що обмежують консервативну дшянку гену 16S ррибосомально! РНК бактерш родини Chlamydiaceae, синтезованих фiрмою «GINOSYS» (USA). Окрiм праймерiв власного дизайну, в указанш тест-системi використовувались реагенти для ПЛР виробництва фiрми «Fermentas UAB» (Lithuania).
Амплiфiкацiю проводили на програмованому термостаи «АМПЛИ 4» («Biokom», Россия), за такою програмою:
93 °С 93 °С 55 °С
72 °С 72 °С
Фракцшвання продукив амплiфiкацi! здiйснювали методом горизонтального електрофорезу у 2,0 % агарозному гелi в електрофоретичнш камерi «mini VAGOPHOR 01» iз вiзуальною оцiнкою на трансiлюмiнаторi виробництва НВО «Прогрес», тсля фарбування бромистим етидiем, та документували за допомогою цифрово! фотокамери «Nikon-coolpix 2200».
Як маркер молекулярно! маси використовувалась ДНК 1 kb DNA Ladder М 100 («Fermentas UAB», Lithuania).
Результати дослщження. Позитивними результатами при дослщженш за методом ПЛР е наявшсть на певних дорiжках гелю смуг заданого розмiру, у даному випадку - 823 п.н., якi свiтяться пiд ультрафiолетовим випромшюванням трансiлюмiнатора. Вiдсутнiсть же таких смуг на тш чи iншiй дорiжцi свiдчить про негативний результат.
На електрофореграмi продуктiв амплiфiкацi! фрагментiв ДНК дев'яти вищезазначених зразкiв бiологiчного матерiалу та негативного контролю,
147
60 с 30 с
30 с у* 35 циклге 30 с 60 с
}
отриманих при застосуванш тест-системи для виявлення ДНК збудниюв хламщшних шфекцш ссавщв i птахiв у полiмеразнiй ланцюговiй реакци з використанням ол^онуклеотидних праймерiв власного дизайну, що обмежують консервативну дiлянку гену 16S рРНК бактерiй родини Chlamydiaceae, на трьох дорiжках (№№ 1, 2, 3) мае мкце смуга 823 п.н., що за електрофоретичною рухливiстю вiдповiдае фрагменту ДНК гену, який кодуе 16S рибосомально! РНК, а на шести дорiжках (№№ 4, 5, 6, 7, 8, 9) та дорiжцi негативного контролю (-) така смуга вiдсутня (рис. 1).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 М
■^•823п. ы.
Рис. 1. Електрофореграма ПЛР-аналiзу 9 зразкiв бiологiчного матерiалу при амплiфiкацil за допомогою тест-системи, що мкить праймери власного дизайну, яю обмежують консервативну дiлянку гену 16S рРНК бактерiй родини Chlamydiaceae.
Примака: дорiжки 1, 2, 3 - позитивний результат;
4, 5, 6, 7, 8, 9 - негативний результат; «—» - негативний контроль; М - маркер молекулярно! маси.
Отриманий результат свщчить про специфiчнiсть дано! ПЛР-тест-системи, оскшьки амплiфiкований фрагмент ДНК розмiром 823 п.н. шдикований у зразках ДНК хламщофш i не виявлений у зразках ДНК лептостр та мжоплазм.
Висновок. Результати дослiджень зразкiв рiзних штамiв хламiдофiл, лептоспiр та мжоплазм, iз застосуванням розроблено! тест-системи для виявлення ДНК збудниюв хламiдiйних шфекцш ссавщв i птахiв у полiмеразнiй ланцюговiй реакци з використанням ол^онуклеотидних праймерiв власного дизайну, якi обмежують консервативну дшянку гену 16S рРНК бактерш родини Chlamydiaceae, свiдчать про И специфiчнiсть, а, вiдповiдно, i про И придатнiсть для застосування в дiагностицi хламiдiйних iнфекцiй тварин та птахiв.
148
Лггература:
1. Хламидиозы сельскохозяйственных животных / [Хазипов Н. З., Гафаров Х. З., Шафикова Р. А. и др.] ; под ред. Н. З. Хазипова, А. З. Равилова. -М.: Колос, 1984. - 223 с.
2. Бортничук В. А. Хламидиоз свиней: [справочное пособие] / Бортничук В. А. - К.: Урожай, 1991. - 192 с.
3. Обухов И. Л. Хламидийные инфекции животных и птиц / И. Л. Обухов // Ветеринария. - 1996.- № 10.- С. 19-25.
4. Башмакова М. А. Хламидиоз. Современные подходы к диагностике и лечению / М. А. Башмакова, Е. Г. Бочкарев, В. М. Говорун и др. // Сб. научн. труд. РАМН. - 2001. - С. 36 - 72.
5. Вафин Р. Р. Индикация и идентификация Сhlamydia psittaci с помощью полимеразной цепной реакции: автореф. дис. на соискание научн. степени канд. вет. наук: спец. 16.00.03 «Ветеринарная микробиология и вирусология» / - Казань, 2003. - 20 с.
6. Равилов Р. Х. Хламидиоз собак и кошек / Рустам Хаметович Равилов. - М.: ООО «Аквариум-Принт», 2006. - 128 с.
7. Papp J. R. Localization of chronic Chlamydia psittaci infection in the reproductive tract of sheep / J. R. Papp, P. E. Shewen // J. Infect. Dis. - 1996.-Vol. 174, № 6. - P. 302.
8. Шумик Ю.М. ПЛР^агностика орштозу (пЫтакозу) iз використанням рiзних тест-систем / Ю. М. Шумик, I. М. Ксьонз // Науковий Вкник Львiвськоl нац. академи вет. медицини iм. С.З. Гжицького. - 2006. - Том. 8, № 2 (29) Част. 1. - С. 219-223.
9. Ксьонз I. М. Порiвняльний ан^з тест-систем для шдикаци ДНК представниюв родини Chlamydiaceae у полiмеразнiй ланцюговш реакци / I. М. Ксьонз, В. М. Коршний // Ветеринарна бютехнолопя. - 2008. - № 13 (2). -С. 340-351.
Summary I.M.Ksyonz, PhD, senior researcher The Poltava Experimental Department of the UAAS Veterinary Medicine
Institute
DETERMINATION OF THE TEST-SYSTEM SPECIFICITY FOR INDICFTING THE CHLAMYDIACEAE FAMILY REPRESNTATIVES' DNA IN THE POLYMERASE CHAIN REACTION
Analyzed was the PCR-test-system developed by our own for indicating DNA of the Chlamydiaceae family representatives to determine its specificity. Samples of chlamydophila, leptospira & mycoplasma DNA were subject of study by the method of polymerase chain reaction. At studying these samples by means of the mentioned PCR-test-system, positive results were only obtained in the chlamydial materials samples, thus testifying to its specificity.
Key words: Chlamydiosis, chlamydia, chlamydophila, polymerase chain reaction, test-system, amplification, electrophoregramm
Стаття надшшла до редакцИ 30.03.2009
149
