CC BY
13Научная статья
https://doi.org/10.36233/0372-9311-298
ORIGINAL RESEARCHES
Детерминанты вирулентности и генотипы клинических изолятов Helicobacter pylori
Сварваль А.В., Старкова Д.А.И, Ферман Р.С.
Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург, Россия
Аннотация
Введение. Helicobacter pylori — основной возбудитель гастродуоденальных заболеваний человека, развитие и степень тяжесть которых зависят от вирулентности штаммов H. pylori.
Цель — выявление детерминант вирулентности и сравнительный анализ генотипов H. pylori у пациентов с хроническим гастритом (ХГ) и язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ЯБДК). Материалы и методы. Изучены 53 штамма H. pylori, выделенные в Санкт-Петербурге от пациентов с H. pylori-ассоциированными заболеваниями: 34 — с ХГ 19 — с ЯБДК. Стандартным методом ПЦР определены генетические детерминанты вирулентности cagA, iceA, vacA и генотипы H. pylori у пациентов с ХГ и ЯБДК.
Результаты. Ген cagA обнаружен у 64,1% штаммов H. pylori. У пациентов с ХГ и ЯБДК доля cagA+ штаммов H. pylori составляла 55,8 и 78,9 соответственно (р > 0,05). Аллельный вариант iceA1 H. pylori выявлен у 47,4% пациентов с ЯБДК, iceA2 — у 47,1% пациентов с Хг (р > 0,05); аллель vacAsI доминировал у штаммов, выделенных от больных ЯБДК (94,7% против 70,6% при ХГ; p < 0,05). Существенной разницы в распределении аллельных вариантов ml и m2 гена vacA H. pylori между группами пациентов не выявлено. Доля штаммов H. pylori генотипа s1/m2 у пациентов с ЯБДК (52,6%) значимо превышала таковую у пациентов с ХГ (20,6%); р = 0,02. Все cagA+ штаммы являлись носителями аллеля vacAsl. Подавляющее большинство штаммов (10 из 11) генотипа cagA-/vacAs2 выделены от больных ХГ.
Заключение. Установлена статистически значимая ассоциация аллельных вариантов vacAs1 и vacAs2, а также генотипов vacA s1/m2 и vacA s2/m2 возбудителя с тяжестью клинических проявлений инфекции H. pylori. Генотипы vacAs1 и vacA s1/m2 возбудителя ассоциированы с язвой двенадцатиперстной кишки.
Ключевые слова: Helicobacter pylori, cagA, iceA, vacA, генотипирование, гены вирулентности, хронический гастрит, язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки
Этическое утверждение. Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом СПбНИИЭМ им. Пастера (протокол № 50/04-2019 от 22.06.2020).
Благодарность. Авторы выражают благодарность д.м.н., профессору Ольге Викторовне Нарвской за ценные замечания и оказанную помощь при написании статьи.
Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Для цитирования: Сварваль А.В., Старкова Д.А., Ферман РС. Детерминанты вирулентности и генотипы клинических изолятов Helicobacter pylori. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022;99(6):692-700.
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-298
Original article
https://doi.org/10.36233/0372-9311-298
Virulence determinants and genotypes of Helicobacter pylori clinical isolates
Alena V. Svarval, Daria A. Starkova^, Raisa S. Ferman
St. Petersburg Pasteur Institute, St. Petersburg, Russia
© Коллектив авторов, 2022
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Abstract
Background. H. pylori is the principal causative agent of gastroduodenal disorders in humans. The development and severity of lesions in infected individuals depend on the virulence of H. pylori strains. Aims: Detection of virulence determinants and comparative analysis of H. pylori genotypes in patients with chronic gastritis (CG) and duodenal ulcer (DU).
Materials and methods. The 53 H. pylori strains were isolated in St. Petersburg from patients with CG (n = 34) and DU (n = 19). The genetic determinants of virulence cagA, iceA, vacA and H. pylori genotypes in patients with CG and UC were determined using the standard PCR method.
Results. The cagA gene was found in 64.1% of H. pylori strains. The proportions of cagA+ isolates from patients with CG and DU was 55.8% (15/34) and 78.9% (15/19), respectively (p > 0.05). The iceA1 allele of H. pylori was detected in 47.4% of patients with DU, the iceA2 — in 47.1% of patients with CG (p > 0.05). The vacAs1 allele was significantly dominant in patients with DU — 94.7% versus 70.6% in CG (p < 0.05). No significant difference in vacA m1 and m2 alleles was found in H. pylori from different groups of patients (p > 0.05). All cagA+ strains were carriers of the vacA s1 allele. The vast majority of strains (10 out of 11) of the cagA-/vacAs2 genotype were isolated from patients with CG.
Conclusion. The significant association between vacAs1, vacAs2 allelic variants, as well as vacA s1/m2, vacA s2/m2 genotypes of the pathogen and severity of clinical manifestations of H. pylori infection has been established in our study. The vacAs1 and vacA s1/m2 genotypes of the pathogen are associated with duodenal ulcer.
Keywords: Helicobacter pylori, cagA, iceA, vacA, virulence determinant, genotyping, chronic gastritis, duodenal ulcer
Ethics approval. The study was conducted with the informed consent of the patients. The research protocol was approved by the Ethics Committee of the St. Petersburg Pasteur Institute (protocol No. 50/04-2019, June 22, 2020). Acknowledgement. Authors thank Dr. Olga Narvskaya for help with writing assistance, technical editing and proofreading.
Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.
Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.
For citation: Svarval A.V., Starkova D.A., Ferman R.S. Virulence determinants and genotypes of Helicobacter pylori clinical isolates. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology = Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2022;99(6):692-700. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-298
Введение
Helicobacter pylori — микроаэрофильные грамотрицательные бактерии спиралевидной формы, которые являются основными возбудителями гастродуоденальных заболеваний человека (хронический гастрит, пептическая язва, аденокарцино-ма, лимфома желудка). Развитие и степень тяжести поражений у инфицированных лиц зависят от вирулентности штаммов H. pylori, факторов окружающей среды и восприимчивости организма-хозяина [1].
Многочисленные факторы вирулентности обеспечивают адаптацию H. pylori к агрессивным условиям среды обитания, способствуя выживанию и размножению в организме хозяина. Описаны гены, ассоциированные с вирулентностью H. pylori, которые играют ключевую роль в развитии инфекционного процесса [1, 2].
Основной детерминантой вирулентности H. pylori является остров патогенности cagPAI (Cytotoxin-associated Antigen Pathogenesis Island) — протяжённый участок генома (40 kb), включающий семейство генов cag (более 30). Гены cagPAI кодируют белки системы секреции IV типа, которые обеспечивают транспорт иммуногенного белка CagA в эпителиоциты слизистой оболочки желудка, где он подвергается фосфорилированию протеинкиназа-ми. Это приводит к морфологическим изменениям
эпителиальных клеток, стимулируя развитие таких патологических процессов, как язвообразование и рак желудка [2]. Ген cagA является маркером присутствия cagPAI и обнаружен в геноме 25-99% штаммов H. pylori в зависимости от их географического происхождения [3].
Полагают, что ген iceA (Induced by Contact with Epithelium) также может служить «маркером» патогенности H. pylori. Ген iceA имеет 2 аллельных варианта: iceAl и iceA2. Экспрессия гена iceA активируется при контакте H. pylori с эпителиоцитами человека. По данным ряда авторов, генотип iceA1 стимулирует адгезию к эпителиальным клеткам желудка и связан с повышенным уровнем индукции интерлейкина-8, стимулируя развитие язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (ЯБДК) [4].
Ген vacA (Vacuolating-Associated Cytotoxin) присутствует в геноме всех штаммов H. pylori и кодирует цитотоксин (~140 кД), индуцирующий вакуолизацию эпителиальных клеток желудка, что в конечном счёте приводит к их апоптозу [5]. Установлено, что цитотоксичность белка связана с мозаичностью структуры гена vacA (s-, m-, i-ре-гионы) [6]. Рядом зарубежных авторов выявлена зависимость между генотипом и вирулентностью возбудителя: штаммы H. pylori генотипа s1/m1 обладают наибольшей цитотоксической активностью белка — продукта vacA — по сравнению со штам-
ORIGINAL RESEARCHES
мами генотипа s2/m2, а коэкспрессия генов cagA и vacA генотипа s1/m1 способствует прогрессирова-нию язвенной болезни и карциномы желудка [7]. В российской литературе имеется ограниченное число публикаций, посвящённых изучению генетического разнообразия H. pylori в России.
Целью настоящего исследования являлось выявление детерминант вирулентности и сравнительный анализ генотипов H. pylori у пациентов с хроническим гастритом (ХГ) и ЯБДК.
Материалы и методы
Изучены 53 штамма H. pylori, выделенные от 34 взрослых пациентов с ХГ и 19 пациентов с ЯБДК за 2014-2019 гг. в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. Исследуемая группа включала 28 (52,8%) женщин и 25 (47,2%) мужчин в возрасте 17-88 лет (средний возраст 44 года). Исследование одобрено независимым локальным этическим комитетом СПбНИИЭМ им. Пастера (протокол № 50/04-2019 от 22.06.2020).
Бактериологическому исследованию подлежали биоптаты слизистой оболочки антрального отдела желудка, которые были взяты во время эндоскопии в асептических условиях. Биопсийный материал помещали в пробирку типа «эппендорф» с тиоглеколевой средой для контроля стерильности. Культивирование H. pylori осуществляли на селективной среде на основе Колумбийского агара (с добавлением 5-7% дефибринированной лошадиной крови и 1% раствора IsoVitalex) при 37°С. Посевы инкубировали в микроаэрофильных условиях (содержание кислорода ~5%) с использованием анаэростатов системы «GasPak 100». Для создания микроаэробной атмосферы использовали газогенерирующие пакеты. Видимый рост культур бактерий наблюдали в течение 5-7 дней. Для пер-
вичной идентификации мазки культур окрашивали по Граму. Видовую идентификацию клинических изолятов проводили с использованием биохимических тестов (уреазный, каталазный, оксидазный). При положительном результате 3 тестов культуру идентифицировали как H. pylori.
Хромосомную ДНК из чистых культур H. pylori выделяли с помощью набора «Хеликопол II» (НПФ «Литех») и использовали для постановки ПЦР с целью детекции гена cagA и типирования генов vacA и iceA. Амплификацию осуществляли в термоциклере «Bio-Rad С1000 Thermal Cycler» («Bio-Rad»). Нуклеотидные последовательности праймеров, температура отжига и характеристика продуктов амплификации приведены в табл. 1. Условия проведения ПЦР: 95°С — 3 мин; 35 циклов: 94°С — 35 с, температура отжига — 35 с, 72°С — 45 с; 72°С — 5 мин. Продукты ПЦР разделяли в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Длину продуктов амплификации определяли с использованием маркеров молекулярной массы 50 bp и 100 bp DNA Ladder (ООО «Интерлабсервис»). Результаты визуализировали с помощью системы документации гелей «GelDoc» («BioRad»).
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета программ «SPSS Statistics v. 12» («StatSoft Inc.») и ресурса «Медицинская статистика»1, вычисляя значения критерия х2 Пирсона и отношения шансов (ОШ) с помощью четырехпольных таблиц. Различия между группами считали статистически значимыми при 95% доверительном интервале (ДИ) иp < 0,05.
Результаты
В результате культивирования образцов исследуемого материала на селективной среде в течение 7 дней при 37°С в микроаэрофильных условиях был получен видимый рост гладких, круглых, прозрач-
Таблица 1. Праймеры, используемые для ПЦР-детекции гена cagA и типирования генов iceA и vacA Table 1. Oligonucleotide primers used in PCR detection of cagA gene and typing iceA и vacA genes
Гены Genes Наименование праймеров Primer designation Последовательности праймеров Primer sequence Температура отжига праймеров, °С Annealing temperature, °C Длина ПЦР продукта, п.н. Size and location of PCR product, bp Ссылка Reference
iceAl iceAIF iceAIR GTGTTTTTAACCAAAGTATC CTATAGCCACTYTCTTTGCA 43 247 [10]
iceA2 iceA2F iceA2R GTTGGGTATATCACAATTTAT TTRCCCTAIIIICTAGTAGGT 45 229/334 [10]
cagA CagA_F CagA_R GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG CTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA 56 349 [8]
vacA s1/s2 VAI-F VAI-R ATGGAAATACAACAAACACAC CTGCTTGAATGCGCCAAAC 53 259/286 [6]
vacA m1/m2 VAG-F VAG-R CAATCTGTCCAATCAAGCGAG GCGTCAAAATAATTCCAAGG 52 570/645 [9]
URL: https://medstatistic.ru/calculators.html
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ных колоний бактерий. При окраске по Граму обнаружены грамотрицательные палочки изогнутой формы. Положительные результаты биохимических тестов (каталаза/уреаза/цитохромоксидаза) позволили отнести 53 культуры бактерий к виду H. pylori.
Исследование образцов ДНК выявило неоднородность штаммов H. pylori данной выборки. Присутствие гена cagA, а также распределение аллельных вариантов генов iceA и vacA у клинических изолятов H. pylori, полученных от двух групп больных, представлено в табл. 2. Ген cagA был обнаружен у 64,1% (34 из 53) клинических изолятов. Анализ распределения cagA -позитивных штаммов H. pylori не выявил статистически значимых различий между группами пациентов с ХГ и ЯБДК (ОШ 2,96 [0,81-10,80];р > 0,05).
Гены iceA и vacA в различных аллельных вариантах выявлены у всех штаммов H. pylori (табл. 2). Доли аллельных вариантов iceAl и iceA2 штаммов H. pylori различались у пациентов с ХГ и ЯБДК: ал-лельный вариант iceA1 штаммов H. pylori преобладал у пациентов с ЯБДК (47,4%), тогда как iceA2 — у пациентов с ХГ (47,1%). Однако данное различие было статистически не значимо (р > 0,05). В 9 (17%) случаях обнаружены смешанные варианты гена iceA штаммов возбудителя, которые характеризовались присутствием как A1, так и A2 аллелей.
Среди аллелей гена vacA штаммов H. pylori доминировал s1 (79,2%). Как видно из табл. 2, доли аллеля vacAs1 существенно различались у штаммов, выделенных от больных ХГ и ЯБДК: 70,6 и 94,7% соответственно (критерий %2 4,32 превышал критическое значение 3,84; уровень значимости данной связи р < 0,05). Напротив, аллель vacAs2 H. pylori преобладал в группе больных ХГ (р = 0,04). Существенной разницы в распределении вариантов
ml и m2 гена vacA H. pylori между группами пациентов не выявлено (р = 0,58).
Аллельные варианты s и m гена vacA группировались в три генотипа: sl/ml, s1/m2 и s2/m2. Редкий генотип vacA s2/m1 в нашем исследовании не обнаружен. Все штаммы аллеля vacAs2 являлись носителями аллеля m2 в обеих группах пациентов, однако статистически значимо были ассоциированы с ХГ (р = 0,04; табл. 2). Доля штаммов H. pylori генотипа s1/m2 у пациентов с ЯБДК (52,6%) значимо превышала таковую у пациентов с ХГ (20,6%); р = 0,02. Наблюдаемая зависимость являлась статистически значимой (ОШ = 4,29 [1,26-14,60]; p < 0,05).
Анализ сочетаний генов vacA, cagA и iceA позволил выявить взаимосвязь между статусом cagA+ и аллельным вариантом sl гена vacA у клинических изолятов H. pylori: все cagA-позитивные штаммы являлись носителями аллеля vacAsl, тогда как ни один штамм аллеля s2 cagA-позитивным не был (табл. 3). При этом доля штаммов генотипа cagA+/vacAs1 H. pylori у больных ЯБДК составляла 78,9% (15 из 19) против 55,9% (19 из 34) у больных ХГ (p = 0,09). Подавляющее большинство штаммов (10 из 11) генотипа cagA-/vacAs2 выделены от больных ХГ.
Ассоциации генотипов iceAl и iceA2 с присутствием гена cagA и/или аллельными вариантами гена vacA не выявлено (табл. 3).
Суммарные результаты генотипирования по трем детерминантам вирулентности cagA, iceA и vacA в настоящем исследовании позволили выявить 14 вариантов профилей (комбинированных генотипов) у 53 штаммов H. pylori (табл. 4). Среди вариантов превалировали генотипы cagA+/iceA2/vacAs1/ m1 и cagA+/iceA1/vacAs1/m1, которые объединяли 9 (17%) и 8 (15%) штаммов соответственно. Осталь-
Таблица 2. Генотипы штаммов H. pylori при различных формах инфекции Table 2. H. pylori genotypes distribution in patients with different forms of infection
Гены и генотипы Genes and genotypes ХГ, n (%) | CG, n (%) (n = 34) ЯБДК, n (%) | DU, n (%) (n = 19) X2 р ОШ | OR 95% ДИ | 95% CI
cagA + 19 (55,8) 15 (78,9) 2,82 0,09 2,96 0,81-10,80
iceA1 12 (35,3) 9 (47,4) 0,74 0,39 1,65 0,52-5,17
iceA2 16 (47,1) 7 (36,8) 0,52 0,47 0,66 0,21-2,07
iceA1A2 6 (17,6) 3 (15,8) 0,04* 0,83 0,87 0,19-3,99
vacAs1 24 (70,6) 18 (94,7) 4,32 0,04 7,50 0,88-64,04
vacAs2 10 (29,4) 1 (5,3) 4,32 0,04 0,13 0,02-1,14
vacAm1 17 (50,0) 8 (42,1) 0,30 0,58 0,73 0,23-2,26
vacAm2 17 (50,0) 11 (57,9) 0,30 0,58 1,38 0,44-4,27
vacA s1/m1 17 (50,0) 8 (42,1) 0,30 0,58 0,73 0,23-2,26
vacA s1/m2 7 (20,6) 10 (52,6) 5,74 0,02 4,29 1,26-14,60
vacA s2/m2 10 (29,4) 1 (5,3) 4,32 0,04 0,13 0,02-1,14
Примечание. *С учётом поправки Йейтса. Note. *With the Yates's correction.
ORIGINAL RESEARCHES
Таблица 3. Аллельные варианты генов vacA и iceA у cagA+ и cagA- штаммов H. pylori, n Table 3. Allelic variants of the vacA and iceA genes in cagA+ and cagA- H. pylori strains, n
Генотипы Genotypes cagA+ (n = 34) cagA- (n = 19)
vacAsI 34 8
vacAs2 - 11
vacAml 20 5
vacAm2 14 14
vacA s1/m1 20 5
vacA s1/m2 14 3
vacA s2/m2 - 11
iceAl 14 7
iceA2 14 9
ice A1A2 6 3
ные генотипы были представлены группами от 1 до 6 штаммов. Таким образом, явно доминирующего комбинированного генотипа в нашем исследовании не выявлено.
Обсуждение
Ген cagA, являясь наиболее информативной детерминантой вирулентности, широко используется для генотипирования H. pylori. Гетерогенность клинических изолятов H. pylori в разных странах обусловлена этническими, социоэкономически-ми и экологическими особенностями. Так, многочисленные исследования, проведённые в странах Европы и США, показали, что CagA-продуцирую-щие штаммы H. pylori более вирулентны, нежели
CagA-негативные, и вызывают тяжёлые поражения желудочно-кишечного тракта человека: от больных с пептической язвой и раком желудка cagA-пози-тивные штаммы выделяли в 80-100% случаев [11, 12]. Известно, что практически все штаммы восточ-ноазиатской популяции являются носителями гена cagA независимо от степени тяжести инфекционного процесса [13, 14].
В российской литературе имеется ограниченное число публикаций, посвящённых генетическому разнообразию H. pylori, причём сведения о роли различных генотипов в развитии гастродуоденаль-ной патологии противоречивы. Согласно результатам исследований, проведённых в Москве [15], ген cagA был обнаружен у 100% клинических изолятов H. pylori, тогда как в Ярославле — территориально близком городе — доля cagA+ штаммов составляла лишь 43% [16]. В городах южного региона — Астрахани и Ростове — cagA+ штаммы выявлены в 71 и 81% случаев соответственно [17, 18]. В нашем исследовании ген вирулентности cagA был обнаружен у 64,1% клинических изолятов. Несмотря на преобладание штаммов cagA+ у больных ЯБДК (78,9% против 55,8% с ХГ), статистически значимых различий между группами пациентов не выявлено. Полученные результаты указывают на роль белка CagA как фактора вирулентности возбудителя, однако вместе с тем свидетельствуют о необходимости проведения масштабной оценки перспективности гена cagA в качестве генетического маркера тяжести поражений при инфекции H. pylori.
Роль гена iceA H. pylori в развитии гастродуо-денальной инфекции до сих пор не определена, а данные, полученные в разных странах, противо-
Таблица 4. Комбинированные генотипы штаммов H. pylori при различных формах инфекции, n (%) Table 4. Combined genotypes of H. pylori strains in different forms of infection, n (%)
Комбинированные генотипы H. pylori ХГ | CG ЯБДК|DU Всего | Total
Combined genotypes (n = 34) (n = 19) (n = 53)
cagA-/iceA1/vacA s1/m1 1 (2,9) - 1 (1,9)
cagA-/iceA1/vacA s1/m2 - 1 (5,3) 1 (1,9)
cagA-/iceA1/vacA s2/m2 4(11,8) 1 (5,3) 5 (9,4)
cagA-/iceA1A2/vacA s1/m1 2 (5,9) - 2 (3,8)
cagA-/iceA1A2/vacA s2/m2 1 (2,9) - 1 (1,9)
cagA-/iceA2/vacA s1/m1 1 (2,9) 1 (5,3) 2 (3,8)
cagA-/iceA2/vacA s1/m2 1 (2,9) 1 (5,3) 2 (3,8)
cagA-/iceA2/vacA s2/m2 5 (14,7) - 5 (9,4)
cagA+/iceA1/vacA s1/m1 5 (14,7) 3 (15,8) 8 (15,1)
cagA+/iceA1/vacA s1/m2 2 (5,9) 4 (21,1) 6(11,3)
cagA+/iceA1A2/vacA s1/m1 3 (8,8) - 3 (5,7)
cagA+/iceA1A2/vacA s1/m2 - 3 (15,8) 3 (5,7)
cagA+/iceA2/vacA s1/m1 5 (14,7) 4 (21,1) 9 (16,9)
cagA+/iceA2/vacA s1/m2 4(11,8) 1 (5,3) 5 (9,4)
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
речивы. Принято считать, что генотип iceA1 является «маркером» язвенного поражения гастродуо-денальной системы. Исследования, проведённые в Нидерландах [10], Египте [19] и Китае [20], демонстрируют связь генотипа iceA1 H. pylori не только с язвенной болезнью, но и раком желудка. Однако в ряде других исследований (США, Колумбия, Япония, Корея, Болгария, Таиланд, Португалия) сообщается об отсутствии ассоциации iceA1 с тяжестью клинических проявлений инфекции H. pylori [9, 12, 13, 20, 22]. В разных регионах России выявляют в среднем от 46% (Москва) до 60% (Казань, Ростов-на-Дону) штаммов H. pylori генотипа iceA1 [15, 17, 23]. Ряд авторов указывают на характерный для российских регионов высокий уровень встречаемости смешанных генотипов iceA1A2 (20-40%), что может свидетельствовать о присутствии в организме человека нескольких штаммов микроорганизма. Более того, К. Momynaliev и со-авт. сообщают об отсутствии выявляемости генотипа iceA2 у клинических изолятов H. pylori (только в составе смешанного генотипа iceA1A2) [24].
Несмотря на то что в нашем исследовании генотип iceA1 штаммов H. pylori преобладал у пациентов с ЯБДК (47,4%), а генотип iceA2 — у пациентов с ХГ (47,1%), статистически значимой разницы между группами не выявлено. Возможно, одной из причин являлось наличие смешанных вариантов iceA1A2 (17%), которые могут скрывать потенциальную связь между генотипами iceA возбудителя и клиническими проявлениями инфекции H. pylori. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о нецелесообразности использования аллелей гена iceA в качестве генетических маркеров тяжести инфекции H. pylori.
Разнообразие аллельных вариантов s- и m-об-ластей гена vacA обусловливает разную степень ци-тотоксической активности кодируемого ими белка, которая определяет тяжесть поражений при инфекции H. pylori [5, 6].
В нашем исследовании среди аллелей гена vacA штаммов H. pylori доминировал s1 (79,2%), что согласуется с результатами исследований, проведённых в Москве, Ростове-на-Дону, Казани [15, 17, 23]. Нами также установлено, что штаммы H. pylori генотипа vacAs1 статистически значимо ассоциированы с ЯБДК (лишь 1 из 19 штаммов относился к альтернативному аллелю vacAs2). Таким образом, тяжесть поражения зависела от присутствия аллеля vacAs1.
Вопреки распространённому мнению о роли генотипа vacA s1/m1 H. pylori в развитии язвенной болезни, в нашем исследовании значимых различий в распределении штаммов данного генотипа возбудителя между группами пациентов не выявлено. Напротив, доля штаммов H. pylori генотипа s1/m2 у пациентов с ЯБДК значимо пре-
вышала таковую у пациентов с ХГ (р = 0,02). Таким образом, штаммы H. pylori генотипа s1/m2 достоверно чаще встречаются в группе ЯБДК. Полученные данные согласуются с исследованиями в Китае [20], Иране [25], Тунисе [26], Бразилии [27], Тайване [28] и Турции [29]. Генотип vacA s2/m2 H. pylori встречался преимущественно у больных ХГ (p = 0,04), что не противоречит общепринятому мнению об отсутствии цитотоксической активности штаммов H. pylori генотипа s2/m2.
Анализ комбинированных генов vacA, cagA и iceA позволил выявить взаимосвязь между статусом cagA+ и аллельным вариантом si гена vacA. Кроме того, доля штаммов генотипа cagA+/vacAsi H. pylori у больных ЯБДК составляла 78,9%, тогда как подавляющее большинство штаммов (90,9%) генотипа cagA-/vacAs2 были выделены от больных ХГ. Полученные данные согласуются с представлением об ассоциации генотипа cagA+/vacAsi штаммов с риском развития язвенной болезни, тогда как штаммы cagA-/vacAs2 считаются менее вирулентными и редко связаны с прогрессирующим течением инфекции H. pylori [10, 11, 22, 30].
Заключение
Анализ генетического полиморфизма клинических штаммов H. pylori выявил неоднородность популяции возбудителя хеликобактериоза в Санкт-Петербурге. Показано, что частота встречаемости генов cagA, iceA и vacA, а также их комбинированных генотипов различается у штаммов H. pylori, выделенных от больных ХГ и ЯБДК. Установлена статистически значимая ассоциация аллельных вариантов vacAsi и vacAs2, а также генотипов vacA si/m2 и vacA s2/m2 возбудителя с клиническими проявлениями инфекции H. pylori. Генотипы vacAsi и vacA si/m2 возбудителя ассоциированы с ЯБДК. Полученные результаты вносят существенный вклад в характеристику глобальной популяции данного возбудителя, а также свидетельствуют о необходимости поиска надёжных генетических маркеров клинических проявлений инфекции H. pylori.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. de Brito B.B., da Silva F.A.F., Soares A.S., Pereira V.A., Santos M.L.C., Sampaio M.M., et al. Pathogenesis and clinical management of Helicobacter pylori gastric infection. World J. Gastroenterol. 2019; 25(37): 5578-89. https://doi.org/10.3748/wjg.v25.i37.5578
2. Nejati S., Karkhah A., Darvish H., Validi M., Ebrahimpour S., Nouri H.R. Influence of Helicobacter pylori virulence factors CagA and VacA on pathogenesis of gastrointestinal disorders. Microb. Pathog. 2018; 117: 43-8. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2018.02.016
3. Covacci A., Telford J.L., Del Giudice G., Parsonnet J., Rappuoli R. Helicobacter pylori virulence and genetic geography. Science. 1999; 284(5418): 1328-33. https://doi.org/10.1126/science.284.5418.1328
4. Whitmire J.M., Merrell D.S. Helicobacter pylori genetic polymorphisms in gastric disease development. Adv. Exp. Med. Biol. 2019; 1149: 173-94. https://doi.org/10.1007/5584_2019_365
5. Foegeding N.J., Caston R.R., McClain M.S., Ohi M.D., Cover T.L. An overview of Helicobacter pylori VacA toxin biology. Toxins (Basel). 2016; 8(6): E173. https://doi.org/10.3390/toxins8060173
6. Atherton J.C., Cao P., Peek R.M.Jr., Tummuru M.K., Blaser M.J., Cover T.L. Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori. Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration. J. Biol. Chem. 1995; 270(30): 17771-7. https://doi.org/10.1074/jbc.270.30.17771
7. Van Doorn L.J., Figueiredo C., Megraud F., Pena S., Midolo P., Queiroz D.M., et al. Geographic distribution of vacA allelic types of Helicobacter pylori. Gastroenterol. 1999; 116(4): 82330. https://doi.org/10.1016/s0016-5085(99)70065-x
8. Tumurru M.K., Cover T.L., Blaser M.J. Cloning and expression of a high-molecular mass major antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage to cytotoxin production. Infect. Immun. 1993; 61(5): 1799-809.
https://doi.org/10.1128/iai.61.5.1799-1809.1993
9. Yamaoka Y., Kodama T., Gutierrez O., Kim J.G., Kashima K., Graham D.Y. Relationship between Helicobacter pylori iceA, cagA, and vacA status and clinical outcome: studies in four different countries. J. Clin. Microbiol. 1999; 37(7): 2274-9. https://doi.org/10.1128/jcm.37.7.2274-2279.1999
10. van Doorn L.J., Figueiredo C., Sanna R., Plaisier A., Schneeber-ger P., de Boer W., et al. Clinical relevance of the cagA, vacA, and iceA status of Helicobacter pylori. Gastroenterol. 1998; 115(1): 58-66. https://doi.org/10.1016/s0016-5085(98)70365-8
11. Miehlke S., Kirsch C., Agha-Amiri K., Günther T., Lehn N., Malfertheiner P., et al. The Helicobacter pylori vacA s1, m1 genotype and cagA is associated with gastric carcinoma in Germany. Int. J. Cancer. 2000; 87(3): 322-7.
12. Podzorski R.P., Podzorski D.S., Wuerth A., Tolia V. Analysis of the vacA, cagA, cagE, iceA, and babA2 genes in Helicobacter pylori from sixty-one pediatric patients from the Midwestern United States. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2003; 46(2): 83-8. https://doi.org/10.1016/s0732-8893(03)00034-8
13. Perng C.L., Lin H.J., Sun I.C., Tseng G.Y. Helicobacter pylori cagA, iceA and vacA status in Taiwanese patients with peptic ulcer and gastritis. J. Gastroenterol. Hepatol. 2003; 18(11): 1244-9. https://doi.org/10.1046/j.1440-1746.2003.03214.x
14. Uchida T., Miftahussurur M., Pittayanon R., Vilaichone R.K., Wisedopas N., Ratanachu-Ek T., et al. Helicobacter pylori infection in thailand: a nationwide study of the CagA phenotype. PLoS One. 2015; 10(9): e0136775. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0136775
15. Говорун В.М., Момыналиев К.Т., Смирнова О.В., Челыше-ва В.В., Кудрявцева Л.В., Сергиенко В.И. и др. Современные подходы к молекулярной диагностике и типированию клинических изолятов Helicobacter pylori в России. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопрок-тологии. 2002; 12(3): 57-65.
16. Спивак Е.М., Левит Р.М., Кузьмина Г.В., Деменчук М.Ю. Влияние генетической характеристики Helicobacter pylori на воспалительный процесс в слизистой оболочке верхних отделов пищеварительного тракта детей с хроническим гастритом. Бактериология. 2017; 2(4): 25-9. https://doi.org/10.20953/2500-1027-2017-4-25-29
17. Березняк Е.А., Сорокин В.М., Карпова И.О., Ступина Н.А., Терентьев А.Н. Особенности генотипов штаммов Helicobacter pylori, циркулирующих в Ростовской области. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2013; (4): 30-3.
18. Сорокин В.М., Писанов Р.В., Водопьянов А.С., Голубкина Е.В., Березняк Е.А. Сравнительный анализ генотипов штаммов Helicobacter pylori в Ростовской и Астраханской
ORIGINAL RESEARCHES
области. Медицинский вестник Юга России. 2018; 9(4):81-6. https://doi.org/10.21886/2219-8075-2018-9-4-81-86
19. Abu-Taleb A.M.F., Abdelattef R.S., Abdel-Hady A.A., Om-ran F.H., El-Korashi L.A., Abdel-Aziz El-Hady H., et al. Prevalence of Helicobacter pylori cagA and iceA genes and their association with gastrointestinal diseases. Int. J. Microbiol. 2018; 2018: 4809093. https://doi.org/10.1155/2018/4809093
20. Wei G.C., Chen J., Liu A.Y., Zhang M., Liu X.J., Liu D., et al. Prevalence of Helicobacter pylori vacA, cagA and iceA genotypes and correlation with clinical outcome. Exp. Ther. Med. 2012; 4(6): 1039-44. https://doi.org/10.3892/etm.2012
21. Boyanova L., Yordanov D., Gergova G., Markovska R., Mitov I. Association of iceA and babA genotypes in Helicobacter pylori strains with patient and strain characteristics. Antonie Van Leeuwenhoek. 2010; 98(3): 343-50. https://doi.org/10.1007/s10482-010-9448-y
22. Almeida N., Donato M.M., Romäozinho J.M., Luxo C., Cardoso O., Cipriano M.A., et al. Correlation of Helicobacter pylori genotypes with gastric histopathology in the central region of a South-European country. Dig. Dis. Sci. 2015; 60(1): 74-85. https://doi.org/10.1007/s10620-014-3319-8
23. Ахтереева А.Р., Давидюк Ю.Н., Файзуллина Р.А., Ивановская К.А., Сафин А.Г., Сафина Д.Д. и др. Распространённость генотипов Helicobacter pylori у пациентов с гастроду-оденальной патологией в Казани. Казанский медицинский журнал. 2017; (5): 723-8. https://doi.org/10.17750/KMJ2017-723
24. Momynaliev K., Smirnova O., Kudryavtseva L., Govorun V. Helicobacter pylori genotypes in Russia. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2003; 22(9): 573-4. https://doi.org/10.1007/s10096-003-0987-2
25. Keikha M., Ali-Hassanzadeh M., Karbalaei M. Association of Helicobacter pylori vacA genotypes and peptic ulcer in Iranian population: a systematic review and meta-analysis. BMC Gastroenterol. 2020; 20(1): 266.
https://doi.org/10.1186/s12876-020-01406-9
26. Ben Mansour K., Fendri C., Zribi M., Masmoudi A., Lab-bene M., Fillali A., et al. Prevalence of Helicobacter pylori vacA, cagA, iceA and oipA genotypes in Tunisian patients. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 2010; 9: 10. https://doi.org/10.1186/1476-0711-9-10
27. Ribeiro M.L., Godoy A.P., Benvengo Y.H., Mendonça S., Pedrazzoli J. Jr. Clinical relevance of the cagA, vacA and iceA genotypes of Helicobacter pylori in Brazilian clinical isolates. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003; 36(3): 181-5. https://doi.org/10.1016/S0928-8244(03)00029-4
28. Lin H.J., Perng C.L., Lo W.C., Wu C.W., Tseng G.Y., Li A.F., et al. Helicobacter pylori cagA, iceA and vacA genotypes in patients with gastric cancer in Taiwan. World J. Gastroenterol. 2004; 10(17): 2493-7. https://doi.org/10.3748/wjg.v10.i17.2493
29. Erzin Y., Koksal V., Altun S., Dobrucali A., Aslan M., Erdamar S., et al. Prevalence of Helicobacter pylori vacA, cagA, cagE, iceA, babA2 genotypes and correlation with clinical outcome in Turkish patients with dyspepsia. Helicobacter. 2006; 11(6): 574-80. https://doi.org/10.1111/j.1523-5378.2006.00461.x
30. Marie M.A. Relationship between Helicobacter pylori virulence genes and clinical outcomes in Saudi patients. J. Korean Med. Sci. 2012; 27(2): 190-3. https://doi.org/10.3346/jkms.2012.27.2.190
REFERENCES
1. de Brito B.B., da Silva F.A.F., Soares A.S., Pereira V.A., Santos M.L.C., Sampaio M.M., et al. Pathogenesis and clinical management of Helicobacter pylori gastric infection. World J. Gastroenterol. 2019; 25(37): 5578-89. https://doi.org/10.3748/wjg.v25.i37.5578
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. Nejati S., Karkhah A., Darvish H., Validi M., Ebrahimpour S., Nouri H.R. Influence of Helicobacter pylori virulence factors CagA and VacA on pathogenesis of gastrointestinal disorders. Microb. Pathog. 2018; 117: 43-8. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2018.02.016
3. Covacci A., Telford J.L., Del Giudice G., Parsonnet J., Rappuo-li R. Helicobacter pylori virulence and genetic geography. Science. 1999; 284(5418): 1328-33.
https://doi.org/10.1126/science.284.5418.1328
4. Whitmire J.M., Merrell D.S. Helicobacter pylori genetic polymorphisms in gastric disease development. Adv. Exp. Med. Biol. 2019; 1149: 173-94. https://doi.org/10.1007/5584_2019_365
5. Foegeding N.J., Caston R.R., McClain M.S., Ohi M.D., Cover T.L. An overview of Helicobacter pylori VacA toxin biology. Toxins (Basel). 2016; 8(6): E173. https://doi.org/10.3390/toxins8060173
6. Atherton J.C., Cao P., Peek R.M.Jr., Tummuru M.K., Blaser M.J., Cover T.L. Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori. Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration. J. Biol. Chem. 1995; 270(30): 17771-7. https://doi.org/10.1074/jbc.270.30.17771
7. Van Doorn L.J., Figueiredo C., Megraud F., Pena S., Midolo P., Queiroz D.M., et al. Geographic distribution of vacA allelic types of Helicobacter pylori. Gastroenterol. 1999; 116(4): 82330. https://doi.org/10.1016/s0016-5085(99)70065-x
8. Tumurru M.K., Cover T.L., Blaser M.J. Cloning and expression of a high-molecular mass major antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage to cytotoxin production. Infect. Immun. 1993; 61(5): 1799-809.
https://doi.org/10.1128/iai.61.5.1799-1809.1993
9. Yamaoka Y., Kodama T., Gutierrez O., Kim J.G., Kashima K., Graham D.Y. Relationship between Helicobacter pylori iceA, cagA, and vacA status and clinical outcome: studies in four different countries. J. Clin. Microbiol. 1999; 37(7): 2274-9. https://doi.org/10.1128/jcm.37.7.2274-2279.1999
10. van Doorn L.J., Figueiredo C., Sanna R., Plaisier A., Schnee-berger P., de Boer W., et al. Clinical relevance of the cagA, vacA, and iceA status of Helicobacter pylori. Gastroenterol. 1998; 115(1): 58-66. https://doi.org/10.1016/s0016-5085(98)70365-8
11. Miehlke S., Kirsch C., Agha-Amiri K., Günther T., Lehn N., Malfertheiner P., et al. The Helicobacter pylori vacA s1, m1 genotype and cagA is associated with gastric carcinoma in Germany. Int. J. Cancer. 2000; 87(3): 322-7.
12. Podzorski R.P., Podzorski D.S., Wuerth A., Tolia V. Analysis of the vacA, cagA, cagE, iceA, and babA2 genes in Helicobacter pylori from sixty-one pediatric patients from the Midwestern United States. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2003; 46(2): 83-8. https://doi.org/10.1016/s0732-8893(03)00034-8
13. Perng C.L., Lin H.J., Sun I.C., Tseng G.Y. Helicobacter pylori cagA, iceA and vacA status in Taiwanese patients with peptic ulcer and gastritis. J. Gastroenterol. Hepatol. 2003; 18(11): 1244-9. https://doi.org/10.1046/j.1440-1746.2003.03214.x
14. Uchida T., Miftahussurur M., Pittayanon R., Vilaichone R.K., Wisedopas N., Ratanachu-Ek T., et al. Helicobacter pylori infection in thailand: a nationwide study of the CagA phenotype. PLoS One. 2015; 10(9): e0136775. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0136775
15. Govorun V.M., Momynaliev K.T., Smirnova O.V., Chelyshe-va V.V., Kudryavtseva L.V., Sergienko V.I., et al. The modern approaches to molecular diagnostics and identification of Helicobacter pylori clinical isolates in Russia. Rossiyskiy zhurnal gastroenterologii, gepatologii, koloproktologii. 2002; 12(3): 57-65. (in Russian)
16. Spivak E.M., Levit R.M., Kuz'mina G.V., Demenchuk M.Yu. Influence of genetic characteristics of Helicobacter pylori on pathomorphology of gastric mucosa in young persons with chronic gastritis. Bakteriologiya. 2017; 2(4): 25-9. https://doi.org/10.20953/2500-1027-2017-4-25-29 (in Russian)
17. Bereznyak E.A., Sorokin V.M., Karpova I.O., Stupina N.A., Terent'ev A.N. Genotype peculiarities of regional Helicobacter pylori strains from the Rostov district. Epidemiologiya i vaktsi-noprofilaktika. 2013; (4): 30-3. (in Russian)
18. Sorokin V.M., Pisanov R.V., Vodop'yanov A.S., Golubkina E.V., Bereznyak E.A. Comparative analysis of genotypes of Helico-bacter pylori strains in the Rostov and Astrakhan regions. Me-ditsinskiy vestnik Yuga Rossii. 2018; 9(4):81-6. https://doi.org/10.21886/2219-8075-2018-9-4-81-86
(in Russian)
19. Abu-Taleb A.M.F., Abdelattef R.S., Abdel-Hady A.A., Om-ran F.H., El-Korashi L.A., Abdel-Aziz El-Hady H., et al. Prevalence of Helicobacter pylori cagA and iceA genes and their association with gastrointestinal diseases. Int. J. Microbiol. 2018; 2018: 4809093. https://doi.org/10.1155/2018/4809093
20. Wei G.C., Chen J., Liu A.Y., Zhang M., Liu X.J., Liu D., et al. Prevalence of Helicobacter pylori vacA, cagA and iceA genotypes and correlation with clinical outcome. Exp. Ther. Med. 2012; 4(6): 1039-44. https://doi.org/10.3892/etm.2012
21. Boyanova L., Yordanov D., Gergova G., Markovska R., Mi-tov I. Association of iceA and babA genotypes in Helicobacter pylori strains with patient and strain characteristics. Antonie Van Leeuwenhoek. 2010; 98(3): 343-50. https://doi.org/10.1007/s10482-010-9448-y
22. Almeida N., Donato M.M., Romäozinho J.M., Luxo C., Cardoso O., Cipriano M.A., et al. Correlation of Helicobacter pylori genotypes with gastric histopathology in the central region of a South-European country. Dig. Dis. Sci. 2015; 60(1): 74-85. https://doi.org/10.1007/s10620-014-3319-8
23. Akhtereeva A.R., Davidyuk Yu.N., Fayzullina R.A., Ivanov-skaya K.A., Safin A.G., Safina D.D., et al. Prevalence of He-licobacter pylori genotypes in patients with gastroduodenal pathology in Kazan. Kazanskiy meditsinskiy zhurnal. 2017; (5): 723-8. https://doi.org/10.17750/KMJ2017-723 (in Russian)
24. Momynaliev K., Smirnova O., Kudryavtseva L., Govorun V. Helicobacter pylori genotypes in Russia. Eur. J. Clin. Micro-biol. Infect. Dis. 2003; 22(9): 573-4. https://doi.org/10.1007/s10096-003-0987-2
25. Keikha M., Ali-Hassanzadeh M., Karbalaei M. Association of Helicobacter pylori vacA genotypes and peptic ulcer in Iranian population: a systematic review and meta-analysis. BMC Gas-troenterol. 2020; 20(1): 266. https://doi.org/10.1186/s12876-020-01406-9
26. Ben Mansour K., Fendri C., Zribi M., Masmoudi A., Labbe-ne M., Fillali A., et al. Prevalence of Helicobacter pylori vacA, cagA, iceA and oipA genotypes in Tunisian patients. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 2010; 9: 10. https://doi.org/10.1186/1476-0711-9-10
27. Ribeiro M.L., Godoy A.P., Benvengo Y.H., Mendonça S., Pe-drazzoli J. Jr. Clinical relevance of the cagA, vacA and iceA genotypes of Helicobacter pylori in Brazilian clinical isolates. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003; 36(3): 181-5. https://doi.org/10.1016/S0928-8244(03)00029-4
28. Lin H.J., Perng C.L., Lo W.C., Wu C.W., Tseng G.Y., Li A.F., et al. Helicobacter pylori cagA, iceA and vacA genotypes in patients with gastric cancer in Taiwan. World J. Gastroenterol. 2004; 10(17): 2493-7. https://doi.org/10.3748/wjg.v10.i17.2493
29. Erzin Y., Koksal V., Altun S., Dobrucali A., Aslan M., Erdam-ar S., et al. Prevalence of Helicobacter pylori vacA, cagA, cagE, iceA, babA2 genotypes and correlation with clinical outcome in Turkish patients with dyspepsia. Helicobacter. 2006; 11(6): 574-80.
https://doi.org/10.1111/j.1523-5378.2006.00461.x
30. Marie M.A. Relationship between Helicobacter pylori virulence genes and clinical outcomes in Saudi patients. J. Korean Med. Sci. 2012; 27(2): 190-3. https://doi.org/10.3346/jkms.2012.27.2.190
Информация об авторах
Сварваль Алена Владимировна — к.м.н., зав. лаб. идентификации патогенов СПбНИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург, Россия, https://orcid.org/0000-0001-9340-4132
Старкова Дарья Андреевнам — к.б.н., с.н.с. лаб. идентификации патогенов, н.с. лаб. молекулярной эпидемиологии и эволюционной генетики СПбНИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург, Россия, [email protected], https://orcid.org/0000-0003-3199-8689
Ферман Раиса Семеновна — м.н.с. лаб. идентификации патогенов СПбНИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург, Россия, https://orcid.org/0000-0001-7661-3725
Участие авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.
Статья поступила в редакцию 30.08.2022; принята к публикации 01.11.2022; опубликована 30.12.2022
ORIGINAL RESEARCHES
Information about the authors
Alena V. Svarval — Cand. Sci. (Med.), Head, Department for identification of pathogens, St. Petersburg Pasteur Institute, St. Petersburg, Russia, https://orcid.org/0000-0001-9340-4132
Daria A. StarkovaM — Cand. Sci. (Biol.), researcher, Department for identification of pathogens, Department of molecular epidemiology and evolutionary genetics, St. Petersburg Pasteur Institute, St. Petersburg, Russia, [email protected], https://orcid.org/0000-0003-3199-8689
Raisa S. Ferman — researcher, Department for identification of pathogens, St. Petersburg Pasteur Institute, St. Petersburg, Russia, https://orcid.org/0000-0001-7661-3725
Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published.
The article was submitted 30.08.2022; accepted for publication 01.11.2022;
published 30.12.2022
