CC BY-ND
28
•Ш, IM (277)
ЗНиСО
39
УДК 579.842.23.616-074.575.25
=| ДЕТЕКЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА И
= ЕГО ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ОТ ЧУМНОГО МИКРОБА
Ц МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
5= Г.В. Демидова, С.О. Водопьянов, А.Л. Трухачев, А.С. Водопьянов,
^ Т.Н. Бородина, В.П. Зюзина, Е.П. Соколова, В.И. Тынянова
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону, Россия
Предлагается способ, позволяющий проводить видовую идентификацию возбудителя псевдотуберкулеза и дифференцировать его от близкородственного вида Y. pestis методом полиме-разной цепной реакции. В основе метода лежит существование специфической последовательности нуклеотидов в геноме Y. pseudotuberculosis и ее отсутствие у чумного микроба. Ключевые слова: возбудитель псевдотуберкулеза, возбудитель чумы, метод ПЦР, праймеры, дифференциация.
G.V. Demidova, S.O. Vodopyanov, A.L. Trukhachev, A.S. Vodopyanov, T.N. Borodina, V.P. Ziuzina, E.P. Sokolova, V.I. Tynianova □ DETECTION OF THE CAUSATIVE AGENT OF PSEUDOTUBERCULOSIS AND ITS DIFFERENTIATION FROM PLAGUE MICROBE BY POLYMERASE CHAIN REACTION □ T Rostov-on-Don Anti-Plague Scientific Research Institute of Rospotrebnadzor, Rostov-on-Don, Russia.
The method is proposed for causative agent of pseudotuberculosis identification on the species level and its differentiation from the closely related species Y. pestis with the use of polymerase chain reaction (PCR). This method is based on existence of the specific nucleotide sequence in the genome of Y. pseudotuberculosis lacking in the genome of Y. pestis.
Key words: causative agent of pseudotuberculosis, causative agent of plague, method of polymerase chain reaction (PCR), primers, detection, differentiation.
Возбудители чумы и псевдотуберкулеза -грамотрицательные бактерии, принадлежащие к роду Yersinia, являются близкородственными организмами, идентичность их геномов составляет 97-99 % [6]. Дифференциация этих видов затруднена, поскольку существует большое количество атипичных штаммов чумного микроба с отклонениями от классического фенотипа. Сюда относят штаммы, выделяемые в природных очагах в межэпизоотический период, а также штаммы, длительно хранившиеся в лабораторных условиях [2].
В свою очередь псевдотуберкулез отличает многообразие клинических проявлений и наличие значительного числа случаев с атипичным и стертым течением болезни, что значительно затрудняет лабораторную диагностику этой инфекции. Вместе с тем правильное определение видовой принадлежности этих микроорганизмов играет решающую роль в проведении профилактических и противоэпидемических мероприятий.
В настоящее время в лабораторной практике все чаще используются методы ПЦР-диагнос-тики, основанные на выявлении специфических фрагментов ДНК. Описано много способов ПЦР-диагностики возбудителя псевдотуберкулеза, все они касаются идентификации патогенных штаммов на основе выявления генов вирулентности, имеющих как плазмидную (virF [7], yadA [6], yopN/lcrE, yopT), так и хромосомную локализацию (ail [9], wzz [8], HP (BZ22); HP (BZ19-1566) [11], inv [7], yst [11]). Недостатком методов, основанных на идентификации плазмидных маркеров, является возможность элиминации плазмид при культивировании и хранении бактериальных штаммов. Недостатком хромосомных генов патогенности часто является наличие их у представителей близкородственных видов бактерий.
Известен способ идентификации бактерий рода Yersinia и дифференциации трех пато-
генных видов - Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, заключающийся в том, что для мультилокусного анализа используют шесть праймеров, выявляющих последовательности генов ompF - поринов Yersinia [3]. Видоспеци-фичность выбранных для тестирования последовательностей позволяет с помощью предложенных авторами праймеров выявлять штаммы рода Yersinia, принадлежащие к трем видам, патогенным для человека. Однако для оценки результатов детекции штаммов различных видов рода Yersinia необходимо проводить сравнение длин фрагментов амплификации, что не всегда получается точно сделать. Среди коммерческих препаратов для диагностики возбудителя псевдотуберкулеза существует две тест-системы. Одна из них производства GenPak для ПЦР с учетом результатов электрофоретического разделения ДНК. Другая тест-система - производства «Интерлабсервис» для ПЦР с учетом результатов в реальном времени. Их сравнительное испытание на ограниченном числе штаммов Y. pseudotuberculosis показало, что тест-система GenPak, в отличие от набора праймеров производства «Интерлабсервис», не выявляла 50 % штаммов возбудителя псевдотуберкулеза. Авторы коммерческих тест-систем не предоставляют данные о мишенях, используемых для конструирования праймеров [10]. По всей видимости, в тест-системе GenPak применены праймеры, выявляющие мишени на плазмидной ДНК, и бесплаз-мидные штаммы при этом не детектируются предложенным набором. Мишень в наборе праймеров производства «Интерлабсервис» также неизвестна, однако данная тест-система показала хорошие результаты при работе с ней. Но она требует специального дорогостоящего оборудования и квалифицированных специалистов.
Мы предлагаем простой, экономичный и эффективный метод идентификации штаммов возбудителя псевдотуберкулеза.
40
ЗНиСО
лпрель №4 (277)
В последние годы расшифрована нуклео-тидная последовательность генома ряда штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis. Установлено, что в процессе эволюции чумной микроб утратил часть генов, к таковым относится ген htr B, кодирующий продукцию lipid A biosynthesis lauroyl acyltransferase. Этот фермент участвует в синтезе липида А - гидрофобной составляющей липополисахарида (ЛПС) или эндотоксина. ЛПС представляет собой один из ключевых факторов патогенеза инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, в том числе и иерсиниями [5]. Ген htr B содержится только у штаммов возбудителя псевдотуберкулеза и отсутствует у чумного микроба [4].
Цель исследования - сконструировать прай-меры к фрагменту специфического гена htrB и на их основе разработать метод детекции возбудителя псевдотуберкулеза и его дифференциации с близкородственным видом Y. pestis.
Материалы и методы. На основании компьютерного анализа штаммов иерсиний найден специфический ген Y. pseudotuberculosis htrB (YPTB R513535), к этому гену нами сконструированы специфические праймеры: htr03CGCGACCACCACTGGCACTT htr04AAAGCGACGGTGCAGCCACA [1].
В работе использованы штаммы Y. pseudo-tuberculosis, принадлежащие к 6 различным сероварам, и штаммы Y. pestis основных и неосновных подвидов, полученные из музея живых культур института.
Для постановки ПЦР выделяли ДНК из колоний исследуемых штаммов иерсиний после выращивания культур в течение 2 суток при 28 °С на питательном агаре LB. Постановку ПЦР осуществляли согласно инструкции к набору реагентов для проведения ПЦР (производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, г. Москва) в пробирках объемом 0,6 мл. Инкубационную смесь объемом 25 мкл готовили из расчета: 1,5 мМ Mg-
буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси прай-меров (по 0,5 мкМ каждого праймера), 25 нг ДНК-матрицы, 0,25 ед. ДНК-полимеразы, остав- еэ шийся объем - вода. В качестве матрицы ис- ^Б пользовали ДНК, полученную из разных штаммов бактерий рода Yersinia. Подготовленные пробирки помещали в амплификатор Терцик (ДНК-Технология). Режим амплификации: де- ■— натурация при 95 °С - 3 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 95 °С - 20 с, отжиг при 60 °С - 20 с, синтез при 72 °С - 20 с; синтез при 72 °С - 7 мин (1 цикл). Анализ продуктов амплификации проводили с помощью электрофореза в 10 %-м полиакриламидном геле. Результаты по ПЦР анализировали по длине амплифици-рованных фрагментов. В случае появления специфического ампликона длиной 229 пар нуклео-тидов (п.н.) результат оценивали как положительный. Отсутствие специфического ампликона расценивалось как отрицательный результат.
Результаты и обсуждение. Проведенный компьютерный анализ показал, что гены htrB, за исключением возбудителя чумы [4], несут ряд представителей рода Yersinia. Однако сравнение генов htrB различных микроорганизмов в базе данных GenBank с помощью программы Blast свидетельствовало о том, что пара предлагаемых праймеров специфична только для возбудителя псевдотуберкулеза. Участки ДНК, комплементарные отдельным праймерам (до 100 %), обнаруживаются как у возбудителей чумы, так и у других представителей рода Yersinia, но совместное использование праймеров должно было приводить к амплификации фрагмента ДНК, направляемого праймерами htr03 и htr04, только у возбудителя псевдотуберкулеза.
Разработанным методом в ПЦР проанализированы 16 штаммов Y. pseudotuberculosis шести различных сероваров (табл. 1) и 20 штаммов Y. pestis основных и не основных подвидов (характеристики штаммов приведены в табл. 2).
Таблица 1. Результаты исследования Y. pseudotuberculosis в ПЦР со специфическими праймерами htr03-htr04
№ п/п Штаммы Y. pseudotuberculosis Серо-типы Результаты ПЦР № п/п Штаммы Y. pseudotuberculosis Серо-типы Результаты ПЦР
1 Y. pseudotuberculosis 1988 I полож. 9 Y. pseudotuberculosis 1993 II полож.
2 Y. pseudotuberculosis 2389 I полож. 10 Y. pseudotuberculosis 1985 III полож.
3 Y. pseudotuberculosis 2390 I полож. 11 Y. pseudotuberculosis 5343 III полож.
4 Y. pseudotuberculosis 5340 I полож. 12 Y. pseudotuberculosis 19049 III полож.
5 Y. pseudotuberculosis 13024 I полож. 13 Y. pseudotuberculosis 1995 IV полож.
6 Y. pseudotuberculosis 12309 II полож. 14 Y. pseudotuberculosis 282 V полож.
7 Y. pseudotuberculosis 1991 II полож. 15 Y. pseudotuberculosis 12312 V полож.
8 Y. pseudotuberculosis 1992 II полож. 16 Y. pseudotuberculosis 5504 VI полож.
Таблица 2. Результаты исследования возбудителя чумы в ПЦР со специфическими праймерами htr03-htr04
№ п/п Штаммы Происхождение штаммов Результаты в ПЦР № п/п Штаммы Происхождение штаммов Результаты в ПЦР
1 Y. pestis 231 ssp, pestis antiqua отриц 11 Y. pestis 13287 ssp, talassica medievalis отриц
2 Y. pestis 1300 ssp, pestis antiqua отриц 12 Y. pestis 1468 ssp, altaica medievalis отриц
3 Y. pestis C-540 ssp, caucasica antiqua отриц 13 Y. pestis 12131468 ssp, altaica medievalis отриц
4 Y. pestis 11695 ssp, caucasica antiqua отриц 14 Y. pestis 14771 ssp, non-main medievalis отриц
5 Y. pestis 1254 ssp, caucasica antiqua отриц 15 Y. pestis 12259 ssp, ulegeica medievalis отриц
6 Y. pestis 1255 ssp, caucasica antiqua отриц 16 Y. pestis EV1290 ssp, pestis orientalis отриц
7 Y. pestis1687 ssp, caucasica antiqua отриц 17 Y. pestis 1912 ssp, pestis orientalis отриц
8 Y. pestis 1706 ssp, caucasica antiqua отриц 18 Y. pestis 3466/2 ssp, pestis orientalis отриц
9 Y. pestis 1709 ssp, caucasica antiqua отриц 19 Y. pestis 5191 ssp, pestis orientalis отриц
10 Y. pestis 13280 ssp, talassica medievalis отриц 20 Y. pestis 14710 ssp, pestis orientalis отриц
•Ш, IM (277)
ЗНиСО
41
^^ Все исследованные штаммы возбудителя = псевдотуберкулеза формировали в ПЦР с видо-= специфичными олигонуклеотидными прайме-сэ рами htr03-htr04 целевой фрагмент массой 229 п.н., то есть содержали ген htr B, и использованные праймеры давали возможность идентифицировать штаммы возбудителя псевдоту-^ беркулеза различных сероваров. Выделенная из штаммов чумного микроба ДНК, в отличие от ДНК возбудителя псевдотуберкулеза, не образовывала специфического целевого фрагмента массой 229 п.н. в ПЦР с праймерами htr03-htr04. На основании этого можно дифференцировать возбудитель псевдотуберкулеза от чумного микроба. На рисунке представлены результаты электрофоретического разделения фрагментов ДНК в 10 %-м полиакриламидном геле, полученных в результате ПЦР с олигону-клеотидными праймерами, 11 штаммов Y. pseudo-tuberculosis и 5 штаммов Y. pestis.
1 2j_3 Л _ 2... .1 J- Л . Д. и. 1? . .13 У. J 5 1',
Рис. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в 10 % геле полиакриламида.
Лунки 1-11 содержат препарат ДНК из штаммов Y. pseudotuberculosis 5343, 10358, 12309, 12312, 19049, 1992, 1993, 1995, 1985, 1988, 1991. Лунки 13-17 содержат препараты ДНК из штаммов Y. pestis EV1290 ssp, pestis orientalis, 1255 ssp, caucasica antiqua, 13287 ssp, talassica
medievalis, 12259 ssp, ulegeica medievalis, 14710 ssp, pestis orientalis. Лунка 12 содержит препарат ладдеров ДНК. Стрелка указывает на локализацию целевого специфического фрагмента 229 п.н.
Из представленных на рисунке данных видно, что ДНК, выделенная из Y. pseudotuberculosis, формирует фрагмент массой 229 п.н. со специфическими праймерами к гену htr B, в то время как ДНК чумного микроба таких фрагментов не образует.
Вывод. Таким образом, полученные результаты дают основание сделать вывод о том, что сконструированные нами олигонуклеотидные праймеры htr03-htr04 являются специфичными и позволяют не только идентифицировать бактерии вида Y. pseudotuberculosis, но и дифференцировать их от близкородственного вида Y. pestis. Следовательно, проведение ПЦР с праймерами htr03-htr04 возможно как при лабораторной диагностике псевдотуберкулеза в схеме его идентификации, так и для точного определения вида микроорганизма при исследовании материала подозрительного на зараженность возбудителем
чумы в природных очагах, где существует вероятность выявления обоих микроорганизмов. Идентификация вида Y. pseudotuberculosis происходит с использованием праймеров, мишенью к которым являются хромосомные участки ДНК, что увеличивает возможности метода, делая выявление микроорганизма более эффективным. В дальнейшем предполагается провести исследования по включению в тестирование прайме-ров других представителей рода Yersinia.
ЛИТЕРАТУРА
1. Способ видовой идентификации и дифференциации штаммов Yersinia pseudotuberculosis от Yersinia pestis и Yersinia enterocolitica: Патент № RU 2486252 С1 от 27.06.2013. Авторы: Демидова Г.В., Водопьянов С.О., Трухачёв А.Л., Водопьянов А.Л., Соколова Е.П.
2. Лебедева С.А. и др. Поиск праймеров на основе хромосомной ДНК Yersinia pestis для эффективной ПЦР-идентификации типичных и атипичных штаммов возбудителя чумы / С.А. Лебедева, В.С. Иванова, А.Л. Тру-хачев // Клинич. лабораторная диагностика. 2008. 12: С. 49-59.
3. Стенькова А.М. и др. Разработка многопраймерной ПЦР для идентификации бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных видов (Y. pestis, Y. Pseudotuberculosis, Y. enterocolitica) / А.М. Стенькова, М.П. Исаева, В.А. Рассказов // Мол. генет., микробиол и вирусол. 2008. №3. С. 18-23.
4. Pouillot F. et al. Characterization of chromosomal regions conserved in Yersinia pseudotuberculosis and lost by Yersinia pestis / F. Pouillot, C. Fayolle, E. Carniel // Infect. and Immunity. 2008. 76 (10). P. 4592-4599.
5. Skurnik M. et al. Characterization of the O-antigen gene clusters of Yersinia pseudotuberculosis and cryptic O-anti-gen gene cluster of Yersinia pestis shows that the plague bacillus is most closely related to and has evolved from Y. pseudotuberculosis serotype O:1b. / M. Skurnik, A. Peip-po, E. Ervela // Mol. microbial. 2000. 37 (2). P. 316-330.
6. Fukushima H. et al. Duplex real-time SYBR green PCR assays for detection of 17 species of food- or waterborne pathogens in stools / H. Fukushima, Y. Tsunomori, R. Seki // Journal of Clinical Microbiology. 2003. Vol. 41. № 11. P. 5134-5146.
7. Nakajima H. et al. Watanabe H. Detection and identification of Yersinia Jour nal of Pathogens Yersinia pseudotu-berculosis and pathogenic Yersinia enterocolitica by an improved polymerase chain reaction method / H. Nakajima, M. Inoue, T. Mori [et al.] // Journal of Clinical Micro-biology.1992. Vol. 30. No. 9. P. 2484-2486.
8. Matero P. et al. Real time multiplex PCR assay for detection of Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis / P. Matero, T. Pasanen, R. Laukkanen [et al.] // APMIS, 2009.117. P. 34-44.
9. Lambertz S.T. et al. TaqMan based real-time PCR method for detection of Yersinia pseudotuberculosis in food / S.T. Lam-bertz, C. Nilsson, S. Hallanvuo // Applied and Enviromen-tal Microdiology. 2008. Vol. 74. № 20. P. 6465-6469.
10. Woubita A.S. et al. Simultaneous, specific and real-time detection of biothreat and frequently encountered food-borne pathogens / A.S. Woubita, T. Yehualaesheta, T. Habtema-riamb, T. Samuel // J. Food Prot. 2012. 75(4). P. 660-670.
11. Vishnubhatla A. et al. Rapid 5' nuclease (TaqMan) assay for detection of virulent strains of Yersinia enterocolitica. / A. Vishnubhatla, D.Y.C. Fung, R.D. Oberst [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. Vol. 66. № 9. P. 4131-4135.
Контактная информация:
Водопьянов Алексей Сергеевич, тел.: +7 (863) 240-22-66, e-mail: alexvod@gmail.com Contact information:
Vodopyanov Alexey, phone: +7 (863) 240-22-66, e-mail: alexvod@gmail.com
