CC BY
11УДК 636.082.003+639.371.134
М.Е. Михайлова, Е.Л. Романишко, А.И. Киреева
ДЕТЕКЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА RS456206907 ГЕНА SMC2, ДЕТЕРМИНИРУЮЩЕГО ГАПЛОТИП ФЕРТИЛЬНОСТИ HH3 У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: M.Mikhailova@igc.by
Интенсивная селекция, направленная на увеличение молочной продуктивности, привела к появлению у коров голштинской породы проблем, связанных со снижением их репродуктивной способности. Изучение генетической структуры популяции крупного рогатого скота голштинизированной породы по гену SMC2, детерминирующему фертильность крупного рогатого скота, актуально для развития племенного животноводства Республики Беларусь. Негативное влияние данного рецессивного генетического дефекта приводит к эмбриональной смертности или гибели теленка в ранний постэмбриональный период. Данный наследственный дефект относится к гаплотипу фертильности HH3. Частота животных-носителей гаплотипа фертильности HH3 (HH3C), обусловленного мутацией в гене SMC2, составляет 3,46%. Во избежание распространения мутации необходимо исключать из селекционного процесса животных-носителей этого дефекта, а также строго контролировать качество ввозимой племенной продукции (материала) в Республику Беларусь.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, полиморфизм гена SMC2, гаплотип фертильности HH3.
Введение
В настоящее время голштинская порода крупного рогатого скота является самой распространенной породой молочного направления в мире, которую, согласно данным FAO (Food and Agriculture Organization), разводят по крайне мере в 161 стране [1]. В Республике Беларусь на долю молочного скота голштинской и голшти-низированной черно-пестрой пород приходится основная часть поголовья. В связи с интенсивной селекцией, направленной на увеличение молочной продуктивности, у коров голштин-ской породы появились проблемы, связанные со снижением их репродуктивной способности [2]. До недавнего времени снижение воспроизводительной способности объясняли, главным образом, послеродовыми проблемами клинического характера и развитием метаболического стресса, возникающего во время лактации. В настоящее время считается, что, по крайней мере, половина такого снижения детерминирована генетическими факторами [3].
Исследование геномов, с использованием NGS-технологий (new generation sequencing), показало, что усредненный геном несет 250300 вариантов последовательностей с наруше-
нием физиологических функций (LoF, loss-of-Шпйюп). Открытие целого ряда LoF-мутаций стало возможным благодаря разработке и применению нового подхода, так называемого картирования гомозиготности. Возрастание негативного влияния LoF-мутаций на фертильность коров связывают с поступательным ростом гомозиготности в породах, поскольку в гомозиготном состоянии такие мутации могут быть летальными, приводя к эмбриональной гибели. Так, средний коэффициент инбридинга у голштинского скота в США вырос с 0,22% в 1965 году до 6,53% в 2015 году [4]. Причинами возрастания степени инбридинга стали относительно низкое исходное генетическое разнообразие в большинстве молочных пород как следствие их происхождения от ограниченного числа родоначальников; интенсивное использование для искусственного осеменения относительно небольшого числа выдающихся быков-производителей, практикуемое в течение более 50 лет; жесткая селекция по ограниченному числу признаков. Некоторые голштин-ские быки стали отцами нескольких тысяч сыновей, оцененных по качеству потомства, и нескольких сотен тысяч и даже более миллиона
лактирующих дочерей. Кроме того, из приблизительно 5000 быков, оцениваемых ежегодно по качеству потомства, почти 50% — потомки 10 наиболее популярных быков. В этой связи диагностика LoF-мутаций, ассоциированных с летальными наследственными заболеваниями, становится одним из ключевых элементов в системе генетического мониторинга популяций сельскохозяйственных животных.
Число LoF-мутаций, обусловливающих наследственные аномалии и вызывающих эмбриональную и раннюю постэмбриональную смертность, в молочных породах крупного рогатого скота до недавнего времени ограничивалось единицами. Ранее в голштинской породе КРС были идентифицированы LoF-мутации, приводящие к наследственным генетическим дефектам: дефицит уридин-монофосфатсин-тазы (DUMPS), дефицит лейкоцитарной адгезии (BLAD), комплексный порок позвоночника (CVM), брахиспинальный синдром (BY). В настоящее время, наряду с традиционной аббревиатурой, они известны как гаплотипы фертильности (HHD, HHB, HHC, HH0, соответственно). Использование метода полногеномного секвенирования позволило выявить новые мутации, ассоциированные с гаплотипами фер-тильности голштинского скота: НН1 (APAF1, C^T, Q579X), НН3 (SMC2, T^C, F1135S), НН4 (GART, A^C, N290T), НН5 (TFB1M, 138kb Del), HCD (APOB, 1,3 kb Ins), являющиеся причиной эмбриональной смертности.
На данный момент в голштинской породе регистрируется 10 гаплотипов фертильно-сти (HCD, HH0, HH1, HH2, HH3, HH4, HH5, HHB, HHC, HHD), оказывающих влияние на процент успешных осеменений (с наступлением стельности) и (или) ассоциированных с эмбриональной и ранней постэмбриональной смертностью на различных стадиях и встречающихся с частотой от 0,01 до 2,95%. Негативное влияние этих гаплотипов, оцененное в популяции североамериканских голштинов, проявляется в снижении частоты осеменений, завершившихся стельностью на 1,0-9,9%. Распространению гаплотипов фертильности способствует то, что их носители — выдающиеся быки-производители, интенсивно используемые для искусственного осеменения в странах, занимающихся молочным скотоводством, в том числе и в Республике Беларусь.
Материалы и методы
В качестве биологического материала для выделения ДНК использовали сперму племенных быков-производителей и образцы цельной крови или хрящевой ткани (ушной выщип) коров. Выделение и очистку ДНК из образцов биологического материала проводили с использованием коммерческих наборов реагентов для выделения ДНК «Нуклеосорб В», «Нуклеосорб С» («Праймтех», Беларусь) и NucleoSpin Tissue («Macherey-Nagel», Германия) согласно прилагаемым инструкциям по применению.
Концентрацию выделенной ДНК определяли с помощью флуориметра Qubit 2.0 («Invi-trogen», Австрия) с использованием набора реагентов Molecular probes Qubit dsDNA BR Assay kit («Life technologies», США). Разведение ДНК до рабочей концентрации проводили стерильной деионизированной водой (MQ-H2O) в зависимости от используемого молекулярно-генетического метода.
Полиморфные варианты гена SMC2 выявляли методом ПЦР в режиме «реального времени» (ПЦР- РВ). Для постановки ПЦР- РВ использовали термоциклер CFX 96 Real-Time PCR Detection System («Bio-Rad», США). Анализ результатов проводили в программе Bio-Rad CTX Manager (Version3.1). Выявление полиморфизма гена SMC2 проводили с помощью аллель-специфических праймеров. Реакционная смесь для ПЦР-РВ содержала 2 х Maxima Sybr Green PCR Mix («Thermo Scientific», EU), по 300 нМ каждого праймера, деионизированную воду и 5-30 нг геномной ДНК исследуемого образца. Программа амплификации: 95 oC — 10 мин; 95 °С — 10 с; 58-60 °С — 20 с; 62 °С — 30 с (50 циклов). Учет результатов проводили при снятии показаний флуоресценции на стадии отжига при 58-60 °С.
Секвенирование по Сэнгеру исследуемых локусов гена SMC2 (аллели дикого типа и мутантные аллели) осуществляли на приборе 3500 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США). ПЦР-фрагменты экстрагировали из агарозного геля, очищали с помощью набора DNA Gel Extraction Kit («Thermo scientific», EU). Для постановки секвенирующей ПЦР использовали Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», США)
и обратные праймеры для амплификации фрагментов гена SMC2. ПЦР проводили по следующей программе: 95 °С 5 мин; 50 циклов — 95 °С 30 с, 55 °С 10 с, 60 °С 40 мин; 12 °С 5 мин. Полученные амплификаты очищали от непрореагировавших ddNTP. Анализ результатов проводили с использованием программы Sequencing Analysis («Applied Biosystems», США).
Результаты и обсуждение
Гаплотип фертильности HH3 (OMLA 0018249913) локализован на хромосоме 8 в позиции с 92,485,682 до 96,594,716 (74 маркера) и рассчитан на основе координат генома (UMD 3.1.) [5].
Установлено, что причиной эмбриональной смертности телят является несинонимная однонуклеотидная замена — SNP (T / C) в экзоне 24 гена структурной поддержки хромосом (SMC2) в положении 95 410 507 (UMD3.1), (rs456206907). Данный полиморфизм является причиной замен как аминокислоты 1135 от фенилаланина до серина (Phe1135Ser) (GenBank #: XP_002689921.2), так и кодируемого белка в домене P-loop-нуклеозидтри-фосфатгидролазы (НТФазы). Белок SMC2 играет важную роль в процессах репарации ДНК, конденсации хромосом и их сегрегации в процессе клеточного деления.
[5, 6-10].
Изучение происхождения выявленных скрытых животных-носителей мутации гена SMC2 показало, что наиболее ранними известными родоначальниками мутации являются известные быки-производители американской селекции Glendell ARLINDA CHIEF (1968 г. р.), USA 1556373 и Gay View SKYLINER (1954 г. р.) USA 1244845. Анализ результатов, проведенный в североамериканской и французской популяциях голштинов у осемененных коров, отцы которых являются скрытыми носителями гаплотипа фертильности HH3, с быками -скрытыми носителями аналогичного гапло-типа, показал снижение степени стельности, соответственно, на 3,2 и 5,4-5,5% [11, 12]. Показано, что частота встречаемости скрытых носителей HH3 среди быков-производителей составляет 3,0-4,7% в США и 5,0% во Франции [13, 14]. Проведенный российскими учеными анализ родословных быков-произво-
дителей (n=560) в племенных предприятиях России показал, что у тридцати быков-производителей в поколениях F1-F2 предков встречаются носители мутантного аллеля в гене SMC2. Частота встречаемости животных-носителей гаплотипа фертильности НН3 российских племпредприятий варьирует от 2,7 до 8,4%, в среднем составляет 5,4%. Скрытые носители принадлежат двум широко распространенным генеалогическим линиям — Реф-лекшн Соверинга и Уэс Идеала [1, 15].
В результате проведенного по племенным картам анализа родословных быков, используемых для осеменения в сельхозпредприятиях Республики Беларусь, и согласно базе данных Holstein Association USA [32, 33], были определены вероятные носители мутантного аллеля гена SMC2, детерминирующего гапло-тип фертильности HH3. Секвенированием был выявлен носитель мутантного аллеля — бык Джудо, №100552. Образец ДНК, выделенный из спермы этого быка, использовали в качестве положительного контрольного образца для детекции полиморфизма rs456206907 в гене SMC2 с помощью метода аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени. Каждый образец амплифицировался с 2-мя парами праймеров. В каждой паре один из праймеров был общим, а второй комплементарен мутант-ному/дикому аллелям гена SMC2. Визуализация накопления ПЦР-продуктов происходила в режиме реального времени в присутствии интеркалирующего красителя Sybr Green I. Для интерпретации результатов ПЦР-РВ значение ACt тестируемых образцов сравнивали со значением ACt контрольного образца, содержащего два типа аллелей в гетерозиготе и отрицательного контрольного образца.
Специфичность полученных ПНР-продуктов была подтверждена секвенированием по Сэн-геру (рисунок).
Нами проведено тестирование быков-производителей и маточное поголовье в отобранной выборке (n=433) для выявления животных-носителей мутантного аллеля гена SMC2, ассоциированного с гаплотипом фертильно-сти НН3.
Выявлено 15 особей-носителей мутации SMC2, из них 4 быка производителя: Юрген/600411, Джудо/100552, Мотто/400595, Блик/200459; особей маточного поголовья — 11 голов.
GACATATGCTACGTACTCATTYCACAC СТ СA GOTAAG
GAC ATATG СТА CGTACT СATT Т САСAC ATT СТ СА GOTAAQ
ШймАшт
Рис. Секвенирование по Сенгеру фрагмента гена БМС2: А — генотип ТС (У), животное-носитель мутантного
аллеля; Б — генотип ТТ, здоровое животное
Таким образом, в результате проведенного скрининга популяции крупного рогатого скота выявлены животные-носители мутации в гене 8МС2, ассоциированной с пониженной плодовитостью КРС (гаплотип фертильности НН3). Частота животных-носителей мутации в гене БМС2 составляет 3,46%.
Заключение
Носительство гаплотипа НН3, связанного с пониженной фертильностью у быков-производителей, сперма которых была ввезена из-за рубежа — Юрген/600411, Джудо/100552, Мотто/400595, Блик/200459, подтверждает необходимость строгого контроля качества ввозимой племенной продукции (материала).
К маточному поголовью с установленным носительством гаплотипов во избежание скрытых абортов и эмбриональной смертности гомозиготного потомства следует подбирать только проверенных на генетические аномалии производителей.
Предложено исключить из селекционного процесса быков-производителей - носителей гаплотипа фертильности НН3 и строго контролировать качество ввозимой племенной продукции (материала) для избежания распространения в селекционном стаде мутаций, отрицательно влияющих на фертиль-
ность, учитывая, что скрытые носители гаплотипа фертильности HH3 принадлежат двум широко распространенным генеалогическим линиям — Рефлекшн Соверинга и Уэс Идеала.
Список использованных источников
1. Зиновьева,Н.А.Гаплотипыфертильности голштинского скота // Сельскохозяйственная биология. - 2016. - Т. 51. - C. 423-435.
2. Barbat, A. Female fertility in French dairy breeds: current situation and strategies for improvement / Barbat A., Le Mezec P., Ducrocq V. // J. Reprod. Dev. - 2010. - Vol. 56. - P. 15-21.
3. Dobson, H. The high producing dairy cow and its reproductive performance / Dobson H., Smith R.F., Royal M.D. Reprod. Domest. // Anim. - 2007. - Vol. 42(Suppl. 2). - P. 17-23.
4. Council on dairy cattle breeding. Inbreeding trend for holstein or red & white cows. -Mode of access: https://www.cdcb.us/eval/sum-mary/inbrd.cfm. - Date of access: 27.02.2016.
5. Van Raden, P.M. Harmful recessive effects on fertility detected by absence of homozygous haplo-types // Van Raden P.M., Olson K.M., Null D.J.// J. Dairy Sci. - 2011. - Vol. 94. - Р. 6153-6161.
6. Hayes, B. 1000 Bull Genomes Consortium. The 1000 Bull Genomes project — toward genomic selection from whole genome sequence
data in dairy and beef cattle / Hayes B., Daet-wyler H.D., Fries R. // Proc. Plant and Animal Genome XXI Conf. San Diego. - 2013. - P. 150.
7. Schmiesing, J.A. Identification of two distinct human SMC protein complexes involved in mitotic chromosome dynamics / Schmiesing J.A., Ball A.R. Jr., Gregson H.C. // PNAS USA. -1998. - Vol. 95(22). - 12906-12911.
8. Pausch, H. Homozygous haplotype deficiency reveals deleterious mutations compromising reproductive and rearing success in cattle / Pausch H., Schwarzenbacher H., Burgstaller // J. BMC Genomics. - 2015. - Vol. 16. - P. 312.
9. Mc Clure, Bovine exome sequence analysis and targeted SNP genotyping of recessive fertility defects BH1, HH2 and HH3 reveal causative mutation in SMC2 for HH3/ Mc Clure, M.C., Bickhart D., Null D. // PLoS ONE. -2014. - Vol. 9. - P. 125-130.
10. Daetwyler, H.D. Whole-genome sequencing of 234 bulls facilitates mapping of monogenic and complex traits in cattle / Daetwyler H.D., Capitan A., Pausch H. // Nature Genet. - 2014. -Vol. 46. - P. 858-865.
11. Washburn, S.P. Trends in reproductive performance in Southeastern Holstein and Jersey DHI herds / Washburn S.P., Silvia W.J., Brown C.H.// J. Dairy Sci. - 2002. - Vol. 85. -P. 244-251.
12. Lucy, M.C. Reproductive loss in high-producing dairy cattle: where will it end? // J. Dairy Sci. - 2001. - Vol. 84. - 1277-1293.
13. Oltenacu, P. A. The impact of genetic selection for increased milk yield on the welfare of dairy cows / Oltenacu P.A., Broom D.M. // Animal Welfare. - 2010. - Vol. 19. - P. 39-49.
14. Durbin, R.M. The 1000 Genomes Project Consortium. A map of human genome variation from population-scale sequencing // Nature. -2010. - Vol. 467. - Р. 1061-1073.
15. Романенкова, О.С. Разработка тест-системы для диагностики гаплотипа фертильности крупного рогатого скота HH3, ассоциированного с ранней эмбриональной смертностью /О.С. Романенкова, Е.А. Гладырь, О.В. Костюнина, Н.А. Зиновьева // Достижения науки и техники АПК. - 2015. -Т. 29, № 11. - С. 91-94.
M.E. Mikhailova, E.L. Romanishko, A.I. Kireeva
DETECTION OF RS456206907 POLYMORPHISM OF SMC2 GENE DETERMINING HH3 FERTILITY HAPLOTYPE IN CATTLE
Institute of Genetics and Cytology, NASB Minsk, 220072, the Republic of Belarus
Intensive breeding aimed at an increase in milk productivity has led to the problems associated with a decreased reproductive capacity in Holstein cows. Study of a genetic structure of the cattle population of holsteinized breed by the SMC2 gene that determines the cattle fertility is relevant for the development of livestock breeding in the Republic of Belarus. A negative effect of this recessive genetic defect in the homozygous state leads to embryonic death or calf death in the early postembryonic period. This hereditary anomaly refers to the HH3 fertility haplotype. Carriers of the HH3 fertility haplotype have been identified. The frequency of the HH3 fertility haplotype in animal carriers (HH3C) determined by the SMC2 gene mutation is 3,46%. In order to avoid the spread of this mutation, it is necessary to exclude the carriers of such mutation from the breeding process and strictly control the quality of imported pedigree products (material) to the Republic of Belarus.
Key words: cattle, SMC2 gene polymorphism, HH3 fertility haplotype.
Дата поступления статьи: 13 сентября 2018 г.
