CC BY
82
УДК: 636.018:636.4:575.162
разработка тест-системы для диагностики гаплотипа фертильности крупного рогатого скота нн3, ассоциированного с ранней эмбриональной смертностью*
О.в. РОМАНЕНКОВА, аспирант Е.А. ГЛАДЫРЬ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией
О.В. КОСТЮНИНА, кандидат биологических наук, руководитель группы
Н.А. ЗИНОВЬЕВА, доктор биологических наук, академик РАН, директор (e-mail: [email protected])
Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени академика Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация
Резюме. Повышение уровня гомозиготности культурных пород крупного рогатого скота обусловливает возрастающее негативное влияние LoF-мутаций (LoF- нарушение функции). Целью работы была разработка молекулярно-генетической тест-системы диагностики LoF-мутации в гене SMC2, известной под названием гаплотипа фертильности HH3, ассоциированного с ранней эмбриональной смертностью. На первом этапе исследований создали серию референтных образцов с известными HH3 генотипами методом прямого анализа последовательности ДНК пиросеквенированием. На втором этапе оценили результативность тест-системы посредством генотипирования референтных образцов. На третьем этапе определили распространение HH3 в российской популяции голштинского и голштинизированного черно-пестрого скота. Предложенная нами тест-система основана на использовании однопробирочного метода аллелеспецифической ПЦР (STAS PCR). В результате проведенного генотипирования посредством пиросеквенирования была создана серия референтных образцов (n = 60), в том числе 5 образцов с генотипом TC (скрытый носитель HH3) и 55 образцов с генотипом TT (неноситель). Анализ референтных образцов с известными генотипами по SMC2 с применением разработанной тест-системы показал полное совпадение результатов генотипирования. Исследование 353 коров и 632 быков-производителей выявило наличие 49 скрытых носителей HH3, в том числе 35 коров и 14 быков, что соответствует частотам встречаемости, соответственно, 9,9 и 2,2%. Принимая во внимание относительно высокую частоту встречаемости HH3, предложенная тест-система может быть рекомендована для массового скрининга племенного скота в России с целью контроля распространения и элиминации скрытых носителей HH3. Ключевые слова: наследственные аномалии, гаплотипы фертильности голштинского скота.
Для цитирования: Разработка тест-системы для диагностики гаплотипа фертильности крупного рогатого скота HH3, ассоциированного с ранней эмбриональной смертностью / О.В. Романенко -ва, Е.А. Гладырь, О.В. Костюнина, Н.А. Зиновьева //Достижения науки и техники АПК. 2015. Т. 29. № 11. С. 91-94.
Наблюдаемый в культурных породах крупного рогатого скота поступательный рост гомозиготности (так, например, средний коэффициент инбридинга у голштинского скота США вырос с 0,4% в 1970 г. до 5,8% в 2012 г. [1]) обусловливает возрастающее негативное влияние на воспроизводительные способности коров так называемых LoF-мутаций ( loss-of-function - потеря функций). Исследования на человеке показали, что геном обычного человека несет более 100 LoF-
мутаций [2], которые в гомозиготном состоянии могут быть летальными, приводя к эмбриональной гибели. У крупного рогатого скота LoF мутации, обусловливающие наследственные аномалии и вызывающие эмбриональную смертность, проявляются практически во всех молочных породах скота, при этом регулярно регистрируются случаи появления новых дефектов. Так, в голштинской породе идентифицированы LoF мутации, вызывающие такие наследственные заболевания как дефицит уридинмонофосфатсинтазы, DUMPS, дефицит лейкоцитарной адгезии, BLAD, комплексный порок позвоночника, CVM, брахиспинальный синдром, BY [3-5]. Экономический вес таких дефектов обусловлен, прежде всего, их влиянием на фертильность коров, чем собственно на гибель теленка.
Развитие полногеномных методов анализа способствовало выявлению ряда новых гаплотипов, ассоциированных со снижением воспроизводительной способности коров, получивших название гаплотипов фертильности (HH - голштинские гаплотипы). В настоящее время в голштинской породе выявлено, по крайней мере, пять таких гаплотипов (HH1-HH5) [6-8]. Один из них (HH3) ассоциирован с эмбриональной смертностью телят-носителей до 60-го дня стельности. Анализ результатов осеменений коров, отцы которых являются скрытыми носителями HH3, с быками - скрытыми носителями аналогичного гаплотипа, проведенный в североамериканской и французской популяциях голштинов, показал снижение степени стельности, соответственно, на 3,2 и 5,4-5,5% [6, 7].
Гаплотип HH3 локализован на BTA8 в области 90-95 Mb (сборка генома UMD 3.0) [6]. В последующем его локализация была уточнена в области 94,0-96,0 Mb (UMD 3.0) [7] и установлена ассоциация с мутацией в гене структурного поддержания хромосом 2 (SMC2) [9]. Б. Хайес (B. Hayes) с соавторами [10] впервые сообщили, а М. МакКлур (M.C. McClure) с соавторами [11 ] подтвердили и валидировали мутацию, служащую причиной HH3, как несинонимичную замену Т^С в позиции 95410507 в экзоне 24 гена SMC2 (UMD 3.1). Данный полиморфизм служит причиной аминокислотной замены Phe^Ser в позиции 1135, локализованной внутри домена НТФазы кодируемого белка. Животные, несущие генотип ТТ, являются не носителями HH3, генотип TC - скрытыми носителями, генотип СС - носителями (эмбрионы погибают до 60-го дня стельности). Г.Д. Детвюлер (H.D. Daetwyler) с соавторами [12] выполнили секвенирование по Сангеру десяти известных скрытых носителей мутации и подтвердили ожидаемый полиморфизм.
Частота встречаемости скрытых носителей HH3 среди быков-производителей составляет 3,0-4,7% в США, 5,0% - во Франции [7, 11, 12]. Проведенный нами анализ родословных быков-производителей (n = 560) племенных
*Исследования выполнены при финансовой поддержке Минобрнауки России, уникальный идентификационный номер проекта RFMEFI60414X0062. В проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ им. Л.К. Эрнста.
предприятий в России показал, что у тридцати быков-производителей в поколениях F1-F2 предков встречаются носители мутантного аллеля SMC2. Их частота в различных племпредприятиях варьирует от 2,7 до 8,4% и в среднем составляет 5,4%. Скрытые носители принадлежат двум широко распространенным генеалогическим линиям - Рефлекшн Соверинга и Уэс Идеала.
Исходя из изложенного, проведение ДНК-диагностики племенного поголовья коров и быков-производителей -это актуальная задача. Единственным применяемым сегодня способом диагностики HH3 служит использование кастомных (смоделированных пользователем) биочипов, используемых для полногеномного сканирования SNP. Проведение ДНК-диагностики данным способом требует наличия дорогостоящего оборудования и, кроме того, сопряжено с высокой стоимостью биочипов. Если для проведения комплексной ДНК-диагностики (геномная оценка + исследование на наличие нескольких генетических аномалий) такой способ экономически оправдан, то для массового скрининга популяций по HH3 необходима разработка простого, относительно дешевого способа, не требующего использования дорогостоящего оборудования.
Цель нашей работы - это разработка молекулярно-генетической тест-системы для диагностики гаплотипа фертильности HH3 и ее апробация для идентификации скрытых носителей HH3 в выборке голштинского и гол-штинизированного черно-пестрого скота.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ВИЖ им. Л.К. Эрнста в 20142015 гг. В качестве материала для создания серии референтных образцов с известными генотипами по HH3 (n = 60) были использованы образцы ткани (ушной выщип, n = 30) и спермы (n = 30) коров и быков голштинской и голштинизированной черно-пестрой породы. ДНК выделяли методом экстракции перхлоратом [13], с использованием магнитных частиц (ООО «Изоген», Россия) и колонок Nexttec (Nexttec Biotechnologie GmbH, Германия) в соответствии с рекомендациями производителей. Каждым из вышеназванных методов выделяли ДНК из 10 образцов ткани и 10 образцов спермы. Создание серии референтных генотипов проводили посредством прямого определения последовательности в области мутации методом пиросеквенирования. Так как исследуемая мутация не приводит к образованию (или исключению) сайта рестрикции, в кач естве базового метода для моделирования тест-системы определения полиморфизма HH3 был выбран метод STAS PCR (single-tube allele specific polymerase chain reaction - однопробирочный метод аллелеспецифической полимеразной цепной реакции) [14]. Суть метода заключается в использовании двух «внутренних» аллелеспецифических праймеров, ориентированных в противоположных направлениях, последний нуклеотид которых на З'-конце приходится на исследуемую нуклеотидную замену. К каждому из аллелеспецифических праймеров подбираются по одному «наружному» праймеру, таким образом, чтобы длины амлифицированных фрагментов, соответствующих разным аллелям, различались. Подбор праймеров осуществляли с использованием программного обеспечения Primer3web, v. 4.0.0 [15], учитывая следующие условия: 1) температура отжига: +60°С (минимальная), +62°С (желаемая), +67°С (максимальная); 2) соотношение GC: 40% (минимальное), 50% (желаемое), 55% (максимальное); 3) длина фрагмента в пределах
150-500 пар оснований (п.о.). Всего в работе использовали четыре праймера. Продукты STAS PCR разделяли посредством электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромида димидия и визуализировали под ультрафиолетовым светом. Для идентификации длин фрагментов использовали молекулярный маркер длины 100 п.н. (500х2), (ООО «Биосан», Россия).
Результативность разработанной тест-системы оценивали посредством сравнения результатов гено-типирования референтных образцов.
С целью оценки распространения скрытых носителей HH3 среди племенного поголовья голштинского и голштинизированного черно-пестрого скота выполняли генотипирование 632 быков-производителей и 363 коров.
результаты и обсуждение. Для создания серии референтных образцов проводили амплификацию
тд
"1 И и ■ ■ ■ ■ ■
001-—-^т——■■——
С Г С О 4 С * С »
GtCGbCACl
«___^
"1 ■ | ■ ■ ■ ■ ■
ос'-■---■-—^-^-^-
О Т С < А С » С *
а)
™ ~~~ —™ —~ __ .
2Ш 2JOO
ггоо
es q т с о а с а с А
5
б)
Ев ОТСОАСДСА
_ь_
в)
рис. 1. Результаты генотипирования животных по SMC2 с использованием метода пиросеквенирования. А - теоретически смоделированные гистограммы в зависимости от генотипа по SMC2; Б, В - результирующие пикограммы последовательности SMC2 в области исследуемой мутации. На оси Y обозначены условные единицы силы люминесценции.
HH3 и получены результаты генотипирования животных (рис. 1). В результате проведенного генотипирования была создана серия референтных образцов (n = 60), в том числе 5 образцов с генотипом TC (скрытый носитель HH3) и 55 образцов с генотипом ТТ (неноситель).
Мы предложили теоретическую модель тест-системы определения HH3 на основе STAS PCR (рис. 2). Исследование референтных образцов с известными генотипами по HH3 с использованием разработанной тест-системы показало полное совпадение генотипов животных. На электрофореграмме продуктов STAS PCR образцов животных-неносителей HH3 проявляются два фрагмента длиной 219 п.о. (общий для обоих аллелей) и 155 п.о. (специфический для аллеля Т), в то время как у животных - скрытых носителей HH3 визуализируется дополнительный фрагмент длиной 112 п.о. (соответствует аллелю С).
Исследование353 корови 632 быков-производителей с использованием разработанной системы выявило наличие 49 скрытых носителей HH3, в том числе 35 коров и 14 быков, что соответствует частотам встречаемости, соответственно, 9,9 и 2,2%.
Выводы. Таким образом, предложенная нами тест-система на основе STAS PCR может быть использована для диагностики полиморфизма SMC2, служащего причиной летального гаплотипа фертильности HH3 голштинского скота. Учитывая относительно высокую частоту встречаемости HH3 в исследованной нами выборке голштинского и голштинизированного черно-пестрого скота, рекомендуем использование разработанной нами тест-системы для массового скрининга племенного скота в РФ с целью контроля за распространением и элиминации скрытых носителей HH3.
Литература.
1. Trend in Inbreeding Coefficients of Cows for Holstein or Red & White (Calculated August 2015) [Электронный ресурс] // US Department of Agriculture-Animal Improvement Laboratories (USDA-AIPL) URL: https://www.cdcb.us/eval/summary/inbrd.cfm? (дата обращения 30.09.2015).
2. A systematic survey of loss-of-function variants in human protein-coding genes/D.G. MacArthur, S. Balasubramanian, A. Frankish, N. Huang, J. Morris, K. Walter, L. Jostins, L. Habegger, J. K. Pickrell, S. B. Montgomery, C. A. Albers, Z. Zhang, D F. Conrad, G. Lunter, H. Zheng, Q. Ayub, M. A. DePristo, E. Banks, M. Hu, R. E. Handsaker, J. Rosenfeld, M. Fromer, M. Jin, X. J. Mu, E. Khurana, K. Ye, M. Kay, G. I. Saunders, M.-M. Suner, T. Hunt, I. H.A. Barnes, C. Amid, D. R. Carvalho-Silva, A. H. Bignell, C. Snow, B. Yngvadottir, S. Bumpstead,
D.N. Cooper, Y. Xue, I. Gallego Romero, 1000 Genomes Project Consortium, Jun Wang, Y. Li, R. A. Gibbs, S. A. McCarroll, E. T. Dermitzakis, J. K. Pritchard, J. C. Barrett, J. Harrow, M. E. Hurles, M. B. Gerstein, C. Tyler-Smith // Science. 2012. Is. 335. Pp. 823-828.
3. Молекулярные методы в диагностике заболеваний и наследственных дефектов сельскохозяйственных животных /
E.А. Гладырь, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст, О.В. Костюнина, А.С. Быкова, А.Д. Банникова, Е.П. Кудина, Г. Брем//Зоотехния. 2009. № 8. С. 26-27.
4. Роль ДНК-диагностики в контроле и элиминации рецессивных наследственных аномалий сельскохозяйственныхживотных /Н.А. Зиновьева, Е.А. Гладырь, В.Р. Харзинова, О.В. Костюнина, М.В. Покровская, Н.Г. Друшляк, Я.А. Кабицкая//Достижения науки и техники АПК. 2012. № 11. С. 37-40.
5. Моногенные наследственные дефекты и их роль в воспроизводстве / Н.А. Зиновьева, Н.И. Стрекозов, Г.В. Ескин, И.С. Турбина, И.Н. Янчуков, А.Н. Ермилов//Животноводство России. 2015. № 6. С. 30-31.
6. Harmful recessive effects on fertility detected by absence of homozygous haplotypes / P.M. VanRaden, K.M. Olson, D.J. Null, J.L. Hutchison // J. Dairy Sci. 2011. Is. 94. Pp. 6153-6161.
7. Detection of Haplotypes Associated with Prenatal Death in Dairy Cattle and Identification of Deleterious Mutations in GART, SHBG and SLC37A2/ S. Fritz, A. Capitan, A. Djari, S.C. Rodriguez, A. Barbat, A. Baur, C. Grohs, B. Weiss, M. Boussaha, D. Esquerré, C. Klopp, D. Rocha, D. Boichard// PLoS ONE. 2013. Vol. 8. Is. 6: e65550.
8. Genomic evaluation of Ayrshire dairy cattle and new haplotypes affecting fertility and stillbirth in Holstein, Brown Swiss and Ayrshire breeds/ T.A. Cooper, G.R. Wiggans, P.M. VanRaden, J.L. Hutchison, J.B. Cole, D.J. Null//Amer. Dairy Sci. Assoc.-Amer. Soc. Anim. Sci. joint annual meeting, Indianapolis, IN, July 9, 2013. Poster T206.
9. Novel harmful recessive haplotypes identified for fertility traits in nordic holstein cattle / G. Sahana, U.S. Nielsen, G.P. Aamand, M.S. Lund, B. Guldbrandtsen//PLoS One. 2013. Vol. 8: e82909.
10. The 1000 Bull Genomes project - toward genomic selection from whole genome sequence data in dairy and beef cattle /
B. Hayes, H.D. Daetwyler, R. Fries, B. Guldbrandtsen, M.S. Lund, D.A. Boichard, P. Stothard, R.F. Veerkamp, I. Hulsegge, D. Rocha,
C. Van Tassell, E. Mullaart, B. Gredler, T. Druet, A. Bagnato, M. Goddard, A. Chamberlain // Proc. Plant Anim. Genome XXI Conf., 1216 January, 2013, San Diego, USA. Poster W150.
11. Bovine exome sequence analysis and targeted SNP genotyping of recessive fertility defects BH1, HH2 and HH3 reveal causative mutation inSMC2 for HH3 / M.C. McClure, D. Bickhart, D. Null, P. VanRaden, L. Xu, G. Wiggans, G. Liu, S. Schroeder, J. Glasscock, J. Armstrong, J.B. Cole, C.P. Van Tassell, T.S. Sonstegard//PLoS ONE. 2014. Vol. 9: e92769.
12. Whole-genome sequencing of 234 bulls facilitates mapping of monogenic and complex traits in cattle / H.D. Daetwyler, A. Capitan, H. Pausch, P. Stothard, R. van Binsbergen, R.F. Br0ndum, X. Liao, A. Djari, S.C. Rodriguez, C. Grohs, D. Esquerré, O. Bouchez, M.-N. Rossignol, C. Klopp, D. Richa, S. Fritz, A. Eggen, P.J. Bowman, D. Coote, A.J. Chamberlain, C. Anderson, C.P. Van Tassell, I. Hulsegge, M.E. Goddard, B. Guldbrandtsen, M.S. Lund, R.F. Veerkamp, D.A. Boichard, R. Fries, B.J. Hayes// Nature Genet. 2014. Vol. 46. Pp. 858-865.
Рис. 2. Теоретическая модель тест-системы определения гаплотипа НН3 на основе STAS-PCR (А) и результаты генотипирования референтных образцов (Б). А: SMC1, SMC2 - внешние праймеры, SMC2CR - внутренний праймер, специфический для аллеля С; SMC2FR - внутренний праймер, специфический для аллеля Т; * - место исследуемой мутации; Б: М - маркер; дорожки 1-3 - генотип ТТ (неноситель НН3); дорожка 4 - генотип ТС (скрытый носитель НН3).
фрагмента длиной 199 п.о. с использованием праймеров SMC2_1Pyro и SMC2_2Pyro_Bio (меченые биотином) с последующим отжигом зонда SMC2_Zond и пиросек-венированием. Для него использовали базовую последовательность етТ/СОАСАСА, где Т/С - мутируемый нуклеотид, О - контрольные нуклеотиды. Были теоретически смоделированы гистограммы возможных генотипов
13. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных / Н.А. Зиновьева, Е.А. Гладырь, Л.К. Эрнст, Г. Брем. Дубровицы: ВИЖ. 2002. 112 с.
14. Single tube allele specific (STAS) PCR for direct determination of the mutation in the porcine ryanodine receptor gene associated with malignant hyperthermia / N. Zinovieva, B. Aigner, M. Muller, G. Brem //Animal Biotechnology. 1996. Vol. 7. Is. 2. Pp. 173-177.
15. Primer3web version 4.0.0 - Pick primers from a DNA sequence. [Электронный ресурс] / S. Rozen, A. Untergasser, M. Remm, T. Koressaar, H. Skaletsky// Whitehead Institute for Biomedical Research, URL: http://primer3.ut.ee/(дата обращения: 30.07.2015).
DEVELOPMENT OF TEST SYSTEM FOR DIAGNOSTICS OF CATTLE FERTILITY HAPLOTYPE HH3 ASSOCIATED WITH EARLY EMBRYONIC MORTALITY
O.V. Romanenkova, E.A. Gladyr, O.V. Kostyunina, N.A. Zinovieva
L.K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, pos. Dubrovitsy, 60, Podolsky r-n, Moskoskaya obl.,142132, Russian Federation
Summary. Increase in the level of homozygosity of cattle breeds contributes to the growing negative impact of LoF-mutations (LoF -loss of function). The aim of this work was to develop a molecular genetic test system for diagnostics of LoF mutation in SMC2 gene, known as fertility haplotype HH3, which is associated with early embryonic mortality. At the first stage of the research, we created the series of reference samples with known genotypes for HH3 using direct DNA sequence analysis by pyrosequencing. At the second stage we evaluated the applicability of the test system by genotyping reference samples. At the third stage we determined the distribution of HH3 in the Russian population of Holstein and holsteinized Black-and-White cattle. Proposed test system is based on the use of single tube allele-specific PCR method (STAS PCR). Because of genotyping by pyrosequencing we created a series of reference samples (n = 60), including 5 samples with TC genotype (latent carriers for HH3) and 55 samples with TT genotype (non-carriers for HH3). The analysis of reference samples using the developed test system showed full concordance of results of genotyping. A study of 353 cows and 632 bulls revealed the presence of 49 carriers of HH3, including 35 cows and 14 bulls, which corresponds to the frequencies of 9.9 and 2.2%, respectively. Taking in into account the relatively high distribution of HH3, we recommend using the developed test system for screening cattle to control the spread and to eliminate this genetic disorder among Russian breeding cattle population. Keywords: hereditaty defects, Holstein fertility haplotypes
Acknowledgments: The studies were performed under financial support of the Russian Ministry of Education and Science (unique project identification number RFMEFI60414X0062).
Author Details: O.V. Romanenkova, post-graduate student; E.A. Gladyr, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow, head of laboratory; O.V. Kostjunina, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow, head of group; N.A. Zinovieva, D. Sc. (Biol.), member of the RAS, director (e-mail: [email protected]).
For citation: Romanenkova O.V., Gladyr E.A., Kostyunina O.V., Zinovieva N .A. Development of Test System for Diagnostics of Cattle Fertility Haplotype HH3 Associated with Early Embryonic Mortality. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2015. Vol. 29. No 11. Pp. 91-94 (in Russ.).
-НАШИ ЮБИЛЯРЫ
Доктору сельскохозяйственных наук, академику РАЕН, профессору Кемеровского ГСХИ, Заслуженному зоотехнику России Анне Павловне ГРИШКОВОЙ 70 лет!
Анна Павловна родилась 29 октября 1945 г. в селе Квашнино Новосибирской области. В 1967 г. она окончила зоотехнический факультет Новосибирского сельскохозяйственного института, после чего работала в Сибирском научно-исследовательском институте животноводства. Многие годы ее деятельность была связана с Кемеровским НИИСХ, в котором А.П. Гришкова руководила группой учёных, создававших новые генотипы свиней.
В 1982 г. Анна Павловна защитила диссертацию на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук.
В 1985 г. с коллективом производственников ее удостоили звания Лауреата премии Совета Министров СССР за работу по совершенствованию и внедрению в производство животных заводского типа КМ-1.
За многолетний труд А.П. Гришкова опубликовала более 150 работ, в 1995 г. защитила докторскую диссертацию на тему «Создание и совершенствование высокопродуктивных типов и пород свиней для условий Сибири с использованием современных методов селекции».
На сегодняшний день Анна Павловна выполняет большой объем хоздоговорных работ, связанных с оптимизацией технологии производства свинины в Кемеровской области, с ней сотрудничают лучшие сельскохозяйственные предприятия. Результаты ее научных исследований за последние 10 лет изложены в монографиях «Селекционно-генетические основы промышленной технологии производства свинины», «Теоретические и практические основы интенсивного производства свинины», «Современные технологии в промышленном свиноводстве».
В течение 18 лет А.П. Гришкова занимается не только научной, но и педагогической деятельностью в Кемеровском государственном сельскохозяйственном институте. Под её руководством защищено три кандидатских и одна докторская диссертации, успешно работают еще три соискателя.
За достигнутые успехи в развитии народного хозяйства Анна Павловна награждена серебряной медалью ВДНХ (1979 г.), медалями «За особый вклад в развитие Кузбасса» III степени (2000 г.), «За служение Кузбассу» (2008 г.), «За достойное воспитание детей» (2014 г.).
Продолжая и сегодня работать в должности профессора кафедры биотехнологии Кемеровского государственного сельскохозяйственного института, она служит ярким примером высочайшего профессионализма, трудолюбия и любви к науке.
Сердечно поздравляем Анну Павловну с юбилеем и от всей души желаем здоровья на долгие годы, успехов в научной и педагогической деятельности, личного счастья в жизни.
Коллектив Кемеровского ГСХИ
