CC BY
27
4. Абонеев, В.В. Шерстная продуктивность потомтсва от использования линкольнов кубанского заводского типа / В.В. Аюонеев, В.В. марченко, Л.Г. Горковенко, А.Я. Куликова, Н.И. Цапкина // Вестник Воронежского Государственого аграрного университета. - 2016. - Т.1. - № 5. - С. 24-29.
5. Ульянов, А.Н. К проблеме сохранения генофондных стад овец кубанского заводского типа породы линкольн / А.Н. Ульянов, А.Я. Куликова // Овцы, козы, шерстяное дело. - 2016. -№ 1. - С. 17-20.
УДК 636.22/.28.082.2
НОВАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ HH1 -ГАПЛОТИПА ФЕРТИЛЬНОСТИ КРУПНОГО РОГАТОГО
СКОТА ГОЛШТИНСКОЙ ПОРОДЫ NEW TEST SYSTEM FOR DETECTING HH1 - HAPLOTYPE OF FERTILITY IN HOLSTEIN CATTLE
Ковалюк Наталья Викторовна, д-р биол. наук, Мачульская Елена Витальевна, канд. биол. наук, Шахназарова Юлия Юрьевна,
ФГБНУ КНЦЗВ, Российская Федерация, г. Краснодар
Иванченко Анастасия Александровна, магистрант
ФГБОУ Кубанский государственный университет, Российская
Федерация, г. Краснодар
Kovalyuk Natalia Viktorovna, Dr. Biol. Sci.
Machulskaya Elena Vitalievna, Cand. Biol. Sci.
Shakhnazarova Yulia Yurievna, research worker
Krasnodar Research Centre for Animal Husbandry and Veterinary
Medicine, Krasnodar, Russian Federation
Ivanchenko Anastasia Aleksandrovna, undergraduate student
Kuban State University, Krasnodar, Russian Federation
Аннотация: с использованием данных баз OMIA и GenBank нами разработана тест - система на основе AC-ПЦР (аллель - специфической ПЦР). Она позволяет выявлять носителей гаплотипа HH1 голштинского скота и доступна для большинства исследовательских лабораторий.
Разработанная тест-система позволила провести генотипи-рование 27 быков - производителей и 40 племенных коров гол-штинской породы по локусу APAF1. Установлено, что среди них 1 животное (1,4 %) является носителем гаплотипа НН1. В связи с обнаружением данной мутации в поголовье Краснодарского края, необходимо вести контроль за ее распространением в популяции.
Ключевые слова: гаплотип HH1; мутация в гене APAF1; полимеразная цепная реакция; частота встречаемости.
Abstract: using OMIA and GenBank databases, we developed a test system based on AC-PCR (allele-specific PCR). It allows to identify the carriers of haplotype HH1in Holstein cattle and is available for most research laboratories.
The developed test system allowed genotyping of 27 bulls-producers and 40 breeding cows of Holstein breed at the APAF1 locus. It was found that among them 1 animal (1.4 %) is the carrier of the HH1 haplotype. In connection with the detection of this mutation in the Krasnodar region, it is necessary to control its distribution in the population.
Key words: haplotype HH1; mutation in the APAF1 gene; polymerase chain reaction; frequency of occurrence.
Недавние исследования показали, что одну из ключевых ролей в снижении воспроизводительных качеств скота играют генетические факторы. Это утверждение основано на наличии в геноме рецессивных мутаций в последовательности ДНК, которые в гомозиготном состоянии могут быть летальными и приводят к эмбриональной гибели (мутации, приводящие к утрате функций, LoF-мутации). Для обозначения LoF-мутаций, был предложен термин «гаплотипы фертильности».
Все эмбрионы, являющиеся гомозиготными по какому-либо гаплотипу, оказываются нежизнеспособны. Наиболее полную информацию обо всех генетических дефектах КРС содержит крупнейшая база данных OMIA Университета Сиднея (http: //omia.angis.org .au/home/).
Гаплотип HH1, связанный с эмбриональной смертностью на разных сроках стельности, картирован на 5-й хромосоме в области 58-66 Mb. Установлено, что причиной снижения фер-
тильности, ассоциированной с HH1, служит нонсенс-мутация C^T в гене фактора 1, который активирует апоптотическую протеазу (apoptotic peptidase-activating factor 1, APAF1). Мутация приводит к замене Gln^-Stop в позиции 579 аминокислотной последовательности и приводит к усечению примерно одной трети кодируемого геном белка APAF1. Функциональный пептид APAF1 инициирует апоптоз и необходим для нормального эмбрионального развития [1, 3].
Первые носители гаплотипа HH1 - быки-производители Pawnee Farm Arlinda CHIEF (1962 год рождения) и его сын Walkway Chief MARK (1978 год рождения), интенсивно вовлекались в воспроизводство. От последнего получено более 60 тыс. дочерей и сыновья, которые также стали активно использоваться как быки-производители. Установлено, что с каждым из двух этих быков связано около 7 % аллелофонда современной североамериканской популяции голштинов [2].
Этот недавно выявленный гаплотип стал причиной значительного числа самопроизвольных абортов у молочного гол-штинского скота на протяжении последних пятидесяти лет. Очевидна необходимость проведения масштабного исследования крупного рогатого скота каждого региона на наличие данного гаплотипа, что позволит уменьшить экономические потери, связанные с расходами на осеменение и гарантировать появление потомства. С использованием базы данных OMIA и возможностей Gene Bank нами разработана тест - система на основе AC-ПЦР, позволяющая выявлять носителей гаплотипа (носителей LoF-мутации) НН1 голштинского скота.
Цель работы - разработать тест-систему для выявления гаплотипа HH1, доступную для исследовательских лабораторий животноводческого профиля, и определить актуальность подобного тестирования для региональной популяции скота.
Методика. Исследования были проведены на базе лаборатории биотехнологии ФГБНУ КНЦЗВ. Объектом исследования являлись образцы спермы 27 быков-производителей голштин-ской породы и образцы крови от 40 высокопродуктивных коров голштинской породы, принадлежащих ОАО «Нива Кубани» и ОАО «ПЗ «Воля» Краснодарского края.
Для выделения ДНК из образцов использовали наборы реагентов Diatom™ DNA Prep 100 (ООО «Лаборатория Изоген» г. Москва). Тест-систему, для выявления описанной выше точечной мутации, разрабатывали, используя следующий принцип: один из праймеров (HH1.5) подбирался нами для консервативной области, не затронутой мутацией, а два других имели идентичную последовательность и различались лишь последним нуклеотидом на 3' - конце. Один из этих двух праймеров содержал нуклеотид идентичный нормальному аллелю (HH1.3), а другой праймер - нуклеотид идентичный мутантному аллелю (HH1.4). Последовательность праймеров, представленных ниже, была подобрана с использованием программы Primer Premier. Для контроля прохождения реакции и оценки качества и концентрации ПЦР - продуктов проводили электрофорез в 2-% ага-розном геле.
Результаты исследований и их обсуждение. Последовательность праймеров, размеры ПЦР-продуктов и условия реакции представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Последовательность праймеров, размер ПЦР-продукта и условия реакции для выявления носительства гапло-типа HH1
Последовательность праймеров Зазмер ПЦР ■ продукта Условия реакции
HH1.3 (5 'AACTTCAGAGGTTTATCGGC3 ') HH1.4 (5 'AACTTCAGAGGTTTATCGGT3 ') HH1.5 (5'AAAGTTCCAGCCCTTTCTAG3') 198 пн 94°С - 4 минуты; (94°С 30 секунд, 61°С 30 секунд, 72°С 30 секунд) -28 циклов; 72°С - 3 минуты
Условия реакций подбирали эмпирически. Генотипирова-ние одного животного проводили в двух пробирках. Гомозиготных нормальных животных выявляли по результативной амплификации в пробирке с праймерами Н1.3 и Н1.5; гетерозиготных -по результативной амплификации в обеих пробирках (с праймерами Н1.3 и Н1.5; Н1.4 и Н1.5).
Для контроля прохождения реакции и оценки качества и концентрации ПЦР - продуктов проводили горизонтальный электрофорез в 2 % агарозном геле. Фрагмент мутантного алле-ля в 198 п.н. визуализировался у гетерозиготных носителей гап-лотипа.
Апробация тест-системы была проведена с использованием ДНК шести быков - производителей, три из которых являлись гетерозиготными носителями мутации, а три - нормальными гомозиготами (сравнительное генотипирование проведено в ООО «Мой Ген» методом секвенирования ПЦР - продукта).
С использованием разработанной тест - системы было проведено генотипирование голштинских быков - производителей (n=27), интенсивно используемых или планируемых к использованию в системе искусственного осеменения Краснодарского края. Результаты тестирования показали, что среди 27 быков 1 (4 %) являлся носителем гаплотипа НН1. Результаты подобных исследований в выборке коров двух племенных хозяйств оказался отрицательным. Все животные оказались носителями нормальных гаплотипов.
Выводы. Таким образом, разработанная тест-система позволяет с минимальными затратами эффективно выявлять носителей мутаций в локусе APAF1 и может успешно использоваться для мониторинга данной аномалии голштинского скота. Очевидна его необходимость в связи с обнаружением быка-производителя, являющегося носителем мутации. Это позволит выявить новых возможных носителей и предотвратить распространение мутации в поголовье КРС Краснодарского края, которая неизбежно повлечет за собой снижение эффективности сельскохозяйственного производства.
Список литературы
1. Cole, J. B. et al. Haplotype tests for recessive disorders that affect fertility and other traits. AIP // Research Report Genomic3, 02. Feb.2016. Режим доступа: https://aipl.arsusda.gov/reference/recessive_haplotypes_ARR-G3.html Дата обращения: 23.05.17
2. Larkin, D. M. et al. Whole-genome resequencing of two elite sires for the detection of haplotypes under selection in dairy cat-
tle Supporting Information // Proceedings of the National Academy of Sciences.- 2012. - №109. - Р. 7693-7698
3. Zio, D. De, Maiani, E., Cecconi, F. Apaf1 in embryonic development - shaping life by death, and more // Journal of Developmental Biology. - 2015. - № 59. - Р. 33 - 39
УДК 636.22/.28.082.2
РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА В ЛОКУСЕ IGF-I КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА DEVELOPMENT OF THE TEST SYSTEM FOR DETECTING POLYMORPHISM IN THE IGF-I LOCUS IN CATTLE
Ковалюк Наталья Викторовна, д-р биол. наук, Сацук Владимир Федорович, канд. биол. наук, Мачульская Елена Витальевна, канд. биол. наук, Шахназарова Юлия Юрьевна,
ФГБНУ КНЦЗВ, Российская Федерация, г. Краснодар Kovalyuk Natalia Viktorovna, Dr. Biol. Sci. Satsuk V.F., Cand. Biol. Sci., Machulskaya Elena Vitalievna, Cand. Biol. Sci. Shakhnazarova Yulia Yurievna,
Krasnodar Research Centre for Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Krasnodar, Russian Federation
Аннотация: разработана функциональная тест - система на основе ПЦР/ПДРФ для выявления полиморфизма локуса IGF1r10 в гене IGF-1. Планируется использовать тест-систему для генотипирования животных с целью выявления связи между определенными полиморфными вариантами и хозяйственно-полезными признаками.
Ключевые слова: локус IGF1r10; ген IGF-1; тест-система; частота встречаемости.
Abstract: a functional test system was developed based on PCR / RFLP to identify the polymorphism of the IGF1r10 locus in the IGF-1 gene. It is planned to use a test system for genotyping ani-
