ДЕТЕКЦИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА LISTERIA МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 579.62:579.672:636.03 DOI: 10.36718/1819-4036-2020-12-117-125

Елена Васильевна Соколова

Нижегородский научно-исследовательский ветеринарный институт - филиал Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии, аспирант, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии, Россия, Нижний Новгород E-mail: sokol.e1ena@yandex.ru Екатерина Константиновна Псарева

Нижегородский научно-исследовательский ветеринарный институт - филиал Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии, научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии, кандидат биологических наук, Россия, Нижний Новгород E-mail: ekaterinapsareva@gmail.com Ирина Юрьевна Егорова

Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии, заведующая лабораторией диагностики и мониторинга, заместитель директора по диагностическим исследованиям, доктор биологических наук, Россия, Владимирская обл., Петушинский р-н, пос. Вольгинский E-mail: iegorova@list.ru Павел Аркадьевич Журилов

Нижегородский научно-исследовательский ветеринарный институт - филиал Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии, аспирант, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии, Россия, Нижний Новгород E-mail:_zhurilov95@bk.ru Евгений Андреевич Потемкин

Нижегородский научно-исследовательский ветеринарный институт - филиал Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии, аспирант, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии, Россия, Нижний Новгород E-mail: jeka892904622952@gmail.com Светлана Александровна Ермолаева

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения РФ, заведующая лабораторией экологии возбудителей инфекций, доктор биологических наук, Россия, Москва E-mail: drermolaeva@mail.ru Светлана Сергеевна Мешкова

Красноярский государственный аграрный университет, профессор кафедры экологии человека, доктор биологических наук, доцент, Россия, Красноярск E-mail: dixi1972@yandex.ru

ДЕТЕКЦИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА LISTERIA МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ

ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

Листериоз - инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое бактериями рода Listeria. В настоящее время различные производители ПЦР тест-систем предлагают наборы реактивов для качественного и количественного методов детекции в биологическом материале исключительно L. monocytogenes. В настоящей статье описан универсальный протокол для идентификации этиологических агентов листериоза - L. monocytogenes и L. ivanovii. Метод позволяет детектировать непосредственно микроорганизмы рода Listeria с помощью полимераз-ной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на основе амплификации фрагментов генов, кодирующих факторы патогенности бактерий перечисленных видов. При скрининге коллекционных штаммов были выбраны уникальные фрагменты генов-мишеней inlA и smcL, кодирующих интерналин А L. monocytogenes и сфингомиелиназу С L. ivanovii соответственно. На основании подобранных нуклеотидных последовательностей праймеров были подобраны опти-

© Соколова Е.В., Псарева Е.К., Егорова И.Ю., Журилов П.А., Потемкин Е.А., Ермолаева С.А., Мешкова С.С., 2020. Вестник КрасГАУ. 2020. № 12. С. 117-125.

мальные условия для детекции возбудителей листериоза с помощью ПЦР-РВ. Установлен порог чувствительности обнаружения патогенных бактерий рода Listeria. Для L. monocytogenes он составил 3*102, а для L. ivanovii 3*103 бактериальных клеток в 1 мл. Определена специфичность ПЦР-РВ для детекции L. ivanovii и L. monocytogenes на основе генов smcL и inlA. Для этого помимо штаммов L. ivanovii и L. monocytogenes были использованы штаммы нескольких видов листе-рий (L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri), а также изоляты других родов бактерий. Описанный протокол является родоспецифичным для выявления штаммов рода Listeria, в том 4u^L. monocytogenes, а также позволяет обнаруживать непосредственно L. ivanovk помощью видос-пецифичной мишени.

Ключевые слова: ПЦР-РВ, листериоз, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, интерналин А, сфингомиелиназа С.

Elena V. Sokolova

Nizhny Novgorod Research Veterinary Institute - Branch of Federal Research Center of Virology and Microbiology, post-graduate student, junior staff scientist of the laboratory of molecular biology, Russia, Nizhny Novgorod E-mail: sokol.e1ena@yandex.ru Ekaterina K. Psareva

Nizhny Novgorod Research Veterinary Institute - Branch of Federal Research Center of Virology and Microbiology, staff scientist of the laboratory of molecular biology, candidate of biological sciences, Russia, Nizhny Novgorod

E-mail: ekaterinapsareva@gmail.com Irina Yu. Egorova

Federal Research Center of Virology and Microbiology, head of the laboratory of diagnostics and monitoring, deputy-director for diagnostic testings, doctor of biological sciences, Russia, Vladimir Region, Petushinsky district, s. Volginsky E-mail: iegorova@list.ru

Pavel A. Zhurilov

Nizhny Novgorod Research Veterinary Institute - Branch of Federal Research Center of Virology and Microbiology, post-graduate student, junior staff scientist of the laboratory of molecular biology, Russia, Nizhny Novgorod E-mail: zhurilov95@bk.ru Evgeny A. Potemkin

Nizhny Novgorod Research Veterinary Institute - Branch of Federal Research Center of Virology and Microbiology, post-graduate student, junior staff scientist of the laboratory of molecular biology, Russia, Nizhny Novgorod

E-mail: jeka892904622952@gmail.com Svetlana A. Ermolaeva

Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after N. F. Gamalei of the Ministry of Health of the Russian Federation, the head of the laboratory of ecology of causative agents of infections, doctor of biological sciences Russia, Moscow E-mail: drermolaeva@mail.ru Svetlana S. Meshkova

Krasnoyarsk State Agrarian University, professor of the chair of ecology of the man, doctor of biological sciences, associate professor, Russia, Krasnoyarsk E-mail: dixi1972@yandex.ru

THE DETECTION OF THE GENUS LISTERIA PATHOGENIC BACTERIA BY REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION

Listeriosis is an infectious disease in humans and animals caused by bacteria of the genus Listeria. Currently, different PCR test systems manufacturers offer reagent kits for the qualitative and quantitative

detection methods exclusively of L. monocytogenes in biological material. In the study a universal protocol for the identification of bacterial strains, etiological agents of listeriosis - L. monocytogenes, and L. ivanovii is described. The method allows finding microorganisms of the genus Listeria using real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) based on the genes fragments amplification encoding the pathogenicity factors of these species bacteria. Screening for collection strains selected unique fragments of the inlA and smcL target genes encoding L. monocytogenes internalin A and L. ivanovii sphingomyelinase C, respectively. The optimal conditions for the listeriosis pathogen detection using Real-time PCR were established based on the primers selected nucleotide sequences. The sensitivity of the genus Listeria pathogenic bacteria Real-time PCR was established. For L. monocytogenes, it made 3 * 102, and for L. ivanovii 3 * 103 bacterial cells in 1 ml. The specificity of Real-time pCr for L. ivanovii and L. monocytogenes strains detection was defined on the basis of genes of smcL and inlA. For this purpose besides the strains of L. ivanovii and L. monocytogenes the strains of several types of Listeriya (L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri), and also isolates of other genus of bacteria were used. The described protocol is genus specific for the identification of the genus Listeria strains, including monocytogenes, and also allows finding L. ivanoviic with the help of genus specific target directly.

Keywords: Real-time PCR, listeriosis, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, internalinA, sphingomyelinase C.

Введение. Листериоз - инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое грампо-ложительными факультативно-анаэробными бактериями рода Listeria. Проявляется в форме феб-рильного гастроэнтерита, поражает ЦНС (менингит, менингоэнцефалит), может привести к септицемии, выкидышу или мертворождению. Несмотря на низкий уровень заболеваемости, количество летальных исходов среди заболевших достигает 20-30 % [1-3]. Современная классификация рода Listeria основана на полногеномном секвенирова-нии и филогенетическом анализе нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК, и включает в себя 20 признанных видов [4-5]. Этиологическими агентами листериоза признаны L. monocytogenes и L. ivanovii, так как они обладают выраженными факторами патоген-ности, способствующими развитию заболевания. Наиболее опасным возбудителем считается L. monocytogenes, поскольку представляет угрозу для жизни как человека, так и животных, в то время как L. ivanovii выделяют не так часто. Данный вид инфицирует животных, в редких случаях человека. В организм бактерии проникают в основном через кишечник и поражают внутренние органы (печень, головной мозг, селезенку и др.) благодаря наличию в кровотоке [6-9].

Для детекции возбудителей листериоза в РФ преимущественно применяют бактериологические и серологические методы. Для более точ-

ного и быстрого установления диагноза наиболее эффективно использование метода поли-меразной цепной реакции (ПЦР) [10]. В настоящее время различные производители ПЦР тест-систем предлагают наборы реактивов и оборудование для обнаружения в биологическом материале исключительно L. monocytogenes, что не нацелено на определение L. ivanovii.

Цель работы. Описание протокола для идентификации штаммов L. monocytogenes и L. ivanovii, а также иных видов с помощью полиме-разной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на основе генов, кодирующих основные факторы патогенности бактерий рода Listeria.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы. В настоящей работе исследовано 29 штаммов бактерий рода Listeria, 1 референс-штамм рода Bacillus из фондов «Государственной коллекции микроорганизмов, вызывающих опасные, особо опасные, в том числе зооантропонозные и не встречающиеся на территории страны болезни животных» ФГБНУ ФИЦВиМ, выделенных в период с 1964 по 2005 г. от разных источников, преимущественно сельскохозяйственных животных и человека, а также ге-терологичные микроорганизмы родов Escherichia, Citrobacter, Salmonella - изолированные от насекомых и холоднокровных животных (табл.1).

* - Т.Ш. - типовой штамм, передан профессором Jose Antonio Vazquez-Boland.

Таблица 1

Использованные коллекционные штаммы бактерий

Штамм Источник выделения Регион выделения Год

Listeria monocytogenes К-23 Человек Москва 1988

Listeria monocytogenes 57 Человек Москва 1971

Listeria monocytogenes 24618 Человек Москва 1971

Listeria monocytogenes 5 ch Человек Тульская область 1975

Listeria monocytogenes 29 ch Человек Тульская область 1999

Listeria monocytogenes 1-67 Овца Алтайская область 1972

Listeria monocytogenes 14Р Овца Алтайская область 1969

Listeria monocytogenes 4-G Овца Казахстан 1970

Listeria monocytogenes 33 Овца Читинская область 1975

Listeria monocytogenes 170 Корова Хабаровская область 1974

Listeria monocytogenes 257 Корова Новгородская область 1971

Listeria monocytogenes 1-САХ Корова Сахалинская область 1971

Listeria monocytogenes 3453 Свинья Москва 1965

Listeria monocytogenes 406 Свинья Казань 1964

Listeria monocytogenes 324 Свинья Москва 1965

Listeria monocytogenes 4-40 Лошадь Москва 1947

Listeria monocytogenes 3501 Коза Москва 1965

Listeria monocytogenes 944 Мышь Московская область 1958

Listeria monocytogenes 134/3 Продукты питания Тульская область 2005

Listeria monocytogenes 1300 Продукты питания Тульская область 2005

Listeria monocytogenes ATCC 19115 Т.Ш.* 2000

Listeria ivanovii ATCC 19119 Т.Ш. 2000

Listeria ivanovii NCTC 11846 Т.Ш. 2000

Listeria ivanovii 7842 Референс-штамм 1985

Listeria innocua 6A Референс-штамм 1981

Listeria innocua NCTC 11288 Т.Ш. 2000

Listeria innocua SLCC 3379 Т.Ш. 2000

Listeria seeligeri SLCC 5921 Т.Ш. 2000

Listeria welshimeri Т.Ш. 2000

Escherichia blattae Таракан Нижегородская область 2019

Citrobacter freundii Ящерица Нижегородская область 2019

Salmonella enterica Змея Нижегородская область 2019

Bacillus subtilis ATCC 6633 Референс-штамм

Культивирование бактерий и выделение ДНК для постановки ПЦР-РВ. Культуры микроорганизмов выращивали в дрожжевом триптон-соевом бульоне (ДТСБ) (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., Индия) в течение суток при температуре 37 °С. После этого осуществляли пересев на плотную питательную среду, содержащую агар

ДТСА, инкубировали 24 часа при 37 °С. Полученная культура была использована в дальнейшем для получения бактериальной ДНК с помощью лизоцима, который служит для разрушения бактериальной стенки, и протеиназы К, которая отделяет ДНК от разрушенных бактериальных стенок. Затем пробы кипятили при

100 °С 10 минут для полной инактивации ферментов. Для постановки ПЦР-РВ использовали 1 мкл полученного лизата. Для оценки чувствительности готовили пробы штаммов с разной концентрацией. С этой целью при помощи денситометра ОЕЫ-1 (ВюЭап, Латвия) установили оптическую плотность, равную 1 единице по стандарту мутности МакФарланда, что соответствует 3*108 бактериальных клеток в 1 мл. Для постановки реакции использовали серию разведений от 3*108 до ЗхЮ1 м.т. в 1 мл.

Конструирование праймеров. Для идентификации патогенных листерий были определены 2 видоспецифичных гена-мишени: для L ivanovii -ген smcL, который кодирует фермент сфингомие-

линазу С, а для L. monocytogenes - ген inlA, кодирующий белок интерналин А. Полные нуклеотид-ные последовательности были найдены через базу данных GenBank (Y09477.2; M67471.1). Рабочие последовательности праймеров сконструированы с помощью сервиса GenScript (https://www.genscript.com), их соответствие для разных клональных групп внутри вида было проверено с помощью программы BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) (табл. 2). Проверка самокомплементарности и вероятности образования шпилек осуществлялась через программу LaserGene Primer Select (DNAstar, https://www.dnastar.com/software/lasergene).

Таблица 2

Последовательности олигонуклеотидов для детекции L. monocytogenes и L. ivanovii методом ПЦР-РВ

Ген-мишень Последовательность

inlA F 5'-AACCAAAGGCACCAACGAAA-3'

R 5' -TTGTTGTAGGCGGTGTGTTC-3'

smcL F 5' -TGCACAAGCGGACTATATGA-3'

R 5'-TCCCAATTACGGGTGTTTGA-3'

Проведение ПЦР-РВ. Постановку ПЦР-РВ проводили с использованием 5xqPCRmix - HS SYBR (ООО «Евроген», Москва). Реакционную смесь готовили согласно инструкции производителя. Для отрицательного контроля использовали бидистиллированную воду. В качестве положительного контроля применяли ДНК штамма L. monocytogenes «EGDe», содержащего четко выраженную последовательность ин-терналина А, а также референтные штаммы L. monocytogenes «ATCC 19115» и L. ivanovii «ATCC 19119». Подготовленные пробы ампли-фицировали в приборе «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) по следующей программе: 94 °C - 2 мин, (92 °С - 30 с; 58 °C - 30 с; 72 °C - 30 с) х 45 циклов; 72 °С - 2 мин. Оценку результатов проводили по значению порогового цикла (Ct), при котором кривая флуоресценции пересекала базовую линию [11]. Для подтверждения достоверности результатов постановку реакций повторяли 3 раза.

Результаты исследования и их обсуждение. Скрининг штаммов L. monocytogenes на наличие гена, кодирующего белок интерналин А.

Возбудители листериоза имеют характерные факторы патогенности, способствующие проникновению бактерий в эукариотические клетки высокой выживаемости и межклеточному распространению. Среди них важную роль играют белки семейства интерналинов. Гены, кодирующие эти токсины, содержат лейцин-богатые повторы (LRR), облегчающие адгезию и инвазию [9, 12]. Выбор гена inlA в качестве мишени для L. monocytogenes обусловлен данными о его принципиальной роли в вирулентности данного вида. Ген inlA кодирует белок интерналин А, который опосредует инвазию эпителиальных клеточных линий кишечника за счет взаимодействия с рецептором Е-кадгерина на базолатеральной поверхности клеток [13].

Ранее анализ выявленных генов, кодирующих белки класса интерналинов, в том числе inlA, показал, что среди 59 исследованных штаммов, выделенных преимущественно от сельскохозяйственных животных на территории бывшего СССР, превалирующим является аллель 4 гена inlA [14]. В настоящем исследовании при скрининге 20 штаммов L. monocytogenes выявлены четыре аллельных варианта гена

т1А. Доминирующим являлся аллель 4, который обнаружен у 70 % изолятов (рис.). В связи с этим подбор праймеров для представления

протокола в настоящем исследовании производился на основе аллеля 4 участка гена, кодирующего интерналин А.

Распространение аллелей участка гена inlA исследованных штаммов L. monocytogenes

Оценка специфичности разработанного протокола по детекции патогенных видов бактерий рода Listeria. С помощью программы ClustalX2 было проведено сравнение участка гена inlA для амплификации в системе ПЦР-РВ с другими аллельными вариантами. Фрагмент, ограниченный выбранными праймерами, включал в себя 149 пар нуклеотидов и являлся консервативным для всех аллельных вариантов гена ин-терналина А у штаммов L. monocytogenes. Уникальный для L. ivanovii фрагмент гена smcL имел длину 128 пар нуклеотидов (табл. 2).

Для оценки специфичности на основе генов smcL и inlA использовали штаммы нескольких видов листерий (L. ivanovii и L. monocytogenes,

L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri), а также изоляты других родов бактерий (табл. 3). При амплификации в системе ПЦР-РВ с участком гена smcL реакция прошла положительно со всеми исследуемыми штаммами L. ivanovii (табл. 3). Полученные данные позволяют сделать вывод, что разработанный протокол по детекции L. ivanovii является видоспецифич-ным. При постановке аналогичной реакции с участком гена inlA реакция прошла положительно как у L. monocytogenes, так и у других видов листерий. Однако отрицательный результат у бактерий других родов подтверждает высокий уровень специфичности детекции генома лис-терий.

Таблица 3

Специфичность подобраных праймеров для детекции L. monocytogenes и L. ivanovii

Штамм Праймеры Праймеры

для inlA для smcL

1 2 3

Listeria monocytogenes ATCC 19115 + -

Listeria monocytogenes К-23 + -

Listeria monocytogenes 3453 + -

Listeria ivanovii NCTC 11846 + +

Listeria ivanovii ATCC 19119 + +

Listeria ivanovii 7842 + +

Listeria innocua 6A + -

Listeria innocua NCTC 11288 + -

Listeria innocua SLCC 3379 + -

Окончание табл. 3

1 2 3

Listeria seeligeri SLCC 5921 + -

Listeria welshimeri + -

Escherichia blattae - -

Citrobacter freundii - -

Salmonella enterica - -

Bacillus subtilis ATCC 3366 - -

Низкий уровень видоспецифичности при постановке амплификации с геном inlA подтверждает данные Rossi F. [15], что фактор вирулентности L. monocytogenes inlA может присутствовать также у штаммов L. ivanovii, L. innocua, L. welshimeri и L. seeligeri. Кроме того, консервативные области inlA, выбранные в качестве мишени, могут отражать консерватизм белков семейства интерналинов у рода Listeria, таким образом, представленные результаты могут быть связаны с особенностями нуклеотидных последовательностей лейцин-богатых повторов, которые характеризуют семейство интерналинов [13].

Определение чувствительности. Для определения аналитической чувствительности выявления генов smcL и inlA методом ПЦР-РВ на основе подобранных условий использовали серию разведений референтных штаммов L. ivanovii «ATCC 19119» и L. monocytogenes «ATCC 19115». В результате установлено, что при максимальной концентрации образцов L. ivanovii (3*108 м.т/мл) фрагмент гена smcL детектировался на 24-м цикле, а минимальный порог обнаружения наблюдался на 39-м цикле при 3*103 м.т/мл. При содержании в образце от 3*102 и ЗхЮ1 м.т/мл накопления продукта амплификации не происходило. Таким образом, чувствительность детекции L. ivanovii составила 3*103 м.т/мл. Применительно к L. ivanovii представленный метод является уникальным, поскольку в настоящее время не представлено ПЦР наборов для идентификации этого вида микроорганизмов.

Для бактерий вида L. monocytogenes промежуток детекции находился в пределах 22-35-х циклов амплификации при различных концентрациях от 3^108 до 3 * 102 м.т/мл. Установленное значение для L. monocytogenes не уступает заявленным в ПЦР наборах для выявления данной патогенной бактерии, представленных на российском рынке.

Выводы

1. Установлены участки генов-мишеней для амплификации специфическими праймерами гена smcL, кодирующего фермент сфингомие-линазу С L. ivanovii и гена inlA, кодирующего белок интерналин А L. monocytogenes.

2. Подобраны оптимальные условия для проведения ПЦР в реальном времени при детекции участков генов-мишеней. Рабочая концентрация праймеров составила 7 пмоль/мкл, а температура отжига 58 °С.

3. Определен порог чувствительности выявления возбудителей листериоза при помощи ПЦР в реальном времени. Для L. ivanovii минимальная концентрация при детекции составила 3^103 , а для L. monocytogenes - 3*102 бактериальных клеток в 1 мл.

4. Определена специфичность подобранных праймеров для обнаружения бактерий рода Listeria методом ПЦР в режиме реального времени. Установлено, что родовая специфичность праймеров для гена inlA составляет 100 % среди исследованных микроорганизмов, видовая специфичность праймеров для гена smcL также составила 100 % для вида L. ivanovii.

Литература

1. Herrador Z., Gherasim A., Löpez-Velez R. et al. Listeriosis in Spain based on hospitalisation records, 1997 to 2015: need for greater awareness // Euro Surveill. 2019. Vol. 24, № 21. P. 1-10.

2. Dreyer M.; Thomann A.; Böttcher S. et al. Outbreak investigation identifies a single Listeria monocytogenes strain in sheep with different clinical manifestations, soil and water // Vet. Microbiol. 2015. Vol. 179. P. 69-75.

3. Choi M. H., Park Y. J., Kim M. et al. Increasing Incidence of Listeriosis and Infection-associated

Clinical Outcomes // Annals of laboratory medicine. 2018. Vol. 38, № 2. P. 102-109.

4. Orsi R.H.; Wiedmann M. Characteristics and distribution of Listeria spp., including Listeria species newly described since 2009 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016. Vol. 100 № 12. Р. 5273-87.

5. Sanschagrin S., Yergeau E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons // J Vis Exp. 2014. № 90.

6. Liu D. Molecular approaches to the identification of pathogenic and nonpathogenic listeriae // Microbiol Insights. 2013. Vol. 6. P. 59-69.

7. Camejo A., Carvalho F., Reis O. et al. The arsenal of virulence factors deployed by Listeria monocytogenes to promote its cell infection cycle // Virulence. 2011. Vol. 2 № 5. P. 379-394.

8. Guillet C., Join-Lambert O., Le Monnier A., Leclercq A., Mechai F., Mamzer-Bruneel M. et al. Human Listeriosis Caused by Listeria ivanovii // Emerging Infectious Diseases. 2010. Vol. 16 № 1: Р. 136-138.

9. Vazquez-Boland J. A., Kuhn M, Berche P. et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants // Clin. Microbiol. 2001. Vol. 14 № 3. Р. 584-640.

10. Бакулов И.А., Васильев Д.А., Ковалева Е.Н. [и др.]. Листерии и листериоз: монография. 2-е изд. Ульяновск: НИИЦМиБ, 2016. 334 с.

11. Kralik P, Ricchi M. A Basic Guide to Real-Time PCR in Microbial Diagnostics: Definitions, Parameters, and Everything // Front Microbiol. 2017. Vol. 8 P. 108.

12. Marino M., Braun L, Cossart P. et al. A framework for interpreting the leucine-rich repeats of the Listeria internalins // Proc Natl Acad Sci U S A. 2000. Vol. 97 № 16. Р. 8784-8.

13. Su X., Cao, G., Zhang, J. et al. Characterization of internalin genes in Listeria monocytogenes from food and humans, and their association with the invasion of Caco-2 cells. Gut Pathog. 2019; 11: 30.

14. Psareva E.K., Egorova I.Y., Liskova E.A. et al. Retrospective Study of Listeria Monocytogenes Isolated in the Territory of Inner Eurasia from 1947 to 1999 // Pathogens. 2019. Vol. 8. № 4. P. 1-16.

15. Rossi F., Amadoro C., Conficoni D. et al. Occurrence, Diversity of Listeria spp. Isolates

from Food and Food-Contact Surfaces and the Presence of Virulence Genes // Microorganisms. 2020. Vol. 8 № 2. P. 294.

Literatura

1. Herrador Z., Gherasim A., López-Vélez R. et al. Listeriosis in Spain based on hospitalisation records, 1997 to 2015: need for greater awareness // Euro Surveill. 2019. Vol. 24, № 21. P. 1-10.

2. Dreyer M.; Thomann A.; Böttcher S. et al. Outbreak investigation identifies a single Listeria monocytogenes strain in sheep with different clinical manifestations, soil and water // Vet. Microbiol. 2015. Vol. 179. P. 69-75.

3. Choi M. H., Park Y. J., Kim M. et al. Increasing Incidence of Listeriosis and Infection-associated Clinical Outcomes // Annals of laboratory medicine. 2018. Vol. 38, № 2. P. 102-109.

4. Orsi R.H.; Wiedmann M. Characteristics and distribution of Listeria spp., including Listeria species newly described since 2009 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016. Vol. 100 № 12. P. 5273-87.

5. Sanschagrin S., Yergeau E. Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons // J Vis Exp. 2014. № 90.

6. Liu D. Molecular approaches to the identification of pathogenic and nonpathogenic listeriae // Microbiol Insights. 2013. Vol. 6. P. 59-69.

7. Camejo A., Carvalho F., Reis O. et al. The arsenal of virulence factors deployed by Listeria monocytogenes to promote its cell infection cycle // Virulence. 2011. Vol. 2 № 5. P. 379-394.

8. Guillet C., Join-Lambert O., Le Monnier A., Leclercq A., Mechai F., Mamzer-Bruneel M. et al. Human Listeriosis Caused by Listeria ivanovii // Emerging Infectious Diseases. 2010. Vol. 16 № 1: R. 136-138.

9. Vazquez-Boland J. A., Kuhn M., Berche P. et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants // Clin. Microbiol. 2001. Vol. 14 № 3. R. 584-640.

10. Bakulov I.A., Vasil'ev D.A., Kovaleva E.N. [i dr.]. Listerii i listerioz: monografija. 2-e izd. Ul'janovsk: NIICMiB, 2016. 334 s.

11. Kralik P, Ricchi M. A Basic Guide to Real-Time PCR in Microbial Diagnostics: Definitions, Parameters, and Everything // Front Microbiol. 2017. Vol. 8 P. 108.

12. Marino M., Braun L, Cossart P. et al. A framework for interpreting the leucine-rich repeats of the Listeria internalins // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. Vol. 97 № 16. P. 8784-8.

13. Su X., Cao, G., Zhang, J. et al. Characterization of internalin genes in Listeria monocytogenes from food and humans, and

their association with the invasion of Caco-2 cells. Gut Pathog. 2019; 11: 30.

14. Psareva E.K., Egorova I.Y., Liskova E.A. et al. Retrospective Study of Listeria Monocytogenes Isolated in the Territory of Inner Eurasia from 1947 to 1999 // Pathogens. 2019. Vol. 8. № 4. P. 1-16.

15. Rossi F., Amadoro C., Conficoni D. et al. Occurrence, Diversity of Listeria spp. Isolates from Food and Food-Contact Surfaces and the Presence of Virulence Genes // Microorganisms. 2020. Vol. 8 № 2. P. 294.

Исследование производилось за счет бюджетных средств ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии» в рамках выполнения темы научно-исследовательской работы «Молекулярные основы полигостальности возбудителей болезней, общих для человека и животных» (0451-2019-0002).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.