CC BY
90
Методика
95
УДК 579.869.1:57.083.1:577.2.08
способ быстрой идентификации бактерий рода listeria и патогенного вида listeria monocytogenes с помощью мультиплексной пцр
С.М. Стародумова1, Е.А. Зайцева1, 2
1 НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова СО РАМН (690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1),
2 Тихоокеанский государственный медицинский университет (690950, г. Владивосток, пр-т Острякова, 2)
Ключевые слова: листерии, лабораторная диагностика, молекулярно-генетический метод, праймеры.
the way OF A QUICK IDENTIFICATION OF BACTERIA genus listeria and pathogenic species of listeria monocytogenes by means of the multiplex polymerase chain reaction
S.M. Starodumova1, E.A. Zaitseva1 2
1 G.P. Somov Institute of Epidemiology and Microbiology of the SB of the Russian Academy of Medical Sciences (1 Selskaya St. Vladivostok 690087 Russian Federation), 2 Pacific State Medical University (2 Ostryakova Ave. Vladivostok 690950 Russian Federation) Background. The wide polymorphism of the Listeria microbes and impermanence of their biochemical and biological characteristics inherent to the freshly isolated cultures of Listeria requires the development of quite new approaches to their typing. Methods. Investigated possibility of the use of the multiplex polymerase chain reaction (PCR) with primers limiting the sequences of genes of Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase (prs) and Phos-phatidylinositol-specific phospholipase (plcA) for a quick identification of bacteria genus Listeria along with a quick differentiation of the pathogenic species of Listeria monocytogenes. Assessment of efficacy of the PCR tested on 117 Listeria cultures isolated from the different foodstaff and organs of the murine rodents. Results. The use of the multiplex PCR enabled to relate 38 of Listeria cultures to genus L. monocytogenes while the rest to genus Listeria spp. that coincided with the results of microbiological typing and testing by means of LISTER System.
Conclusions. The proposed multiplex PCR system enables to relatively quickly (within 3 hours) to screen for the Listeria-suspected colonies and to simultaneously identify L. monocytogenes in the samples under research and can be used for nmonitoring Listeria infection during microbiological and biological research. Keywords: Listeria, laboratory diagnostics, molecular genetic method, primers.
Pacific Medical Journal, 2014, No. 1, p. 95-97.
Многочисленные вспышки листериоза в ряде стран мира, связанные с употреблением в пищу инфицированных продуктов питания, а также частота носитель-ства возбудителя у людей и его широкое распространение в окружающей среде требуют разработки новых подходов к типированию листерий с целью выявления наиболее значимых, вирулентных штаммов [1, 3, 4, 7, 8, 10-12].
В современной лабораторной диагностике листе-риоза широко используются молекулярно-генетичес-кие методы, которые значительно ускоряют процесс идентификации Listeria monocytogenes по сравнению с длительным бактериологическим исследованием. Особое место среди этих методов занимает полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее варианты - гнездная ПЦР, мультиплексная ПЦР и др. [8, 14]. Мультиплексная
Зайцева Елена Александровна - д-р мед. наук, профессор кафедры микробиологии и вирусологии ТГМУ; е-mail: [email protected]
ПЦР позволяет одновременно амплифицировать несколько генов-мишеней, что существенно расширяет возможности традиционного метода.
Для выявления бактерий рода Listeria и идентификации патогенного вида L. monocytogenes в настоящее время в качестве мишеней для ПЦР используют различные гены - 16S и 23S рРНК, prs, gyrB, rpoB, hly, inlA и inlB, plcA, iap и др. [2-7, 10-13]. Важно отметить, что выпускаемые в настоящее время коммерческие тест-системы определяют только один вид листерий - L. mo-nocytogenes. В это же время существует объективная необходимость в создании тест-систем, позволяющих на начальных этапах исследования выявлять другие виды этого рода c одновременной идентификацией патогенной L. monocytogenes. Особенно важным представляется обнаружение в продуктах питания L. innocua, которая, часто встречаясь одновременно с L. monocytogenes, рассматривается как индикатор возможного присутствия последней [4]. Поэтому для исследователей, занимающихся лабораторной диагностикой листериоза, важно иметь в своем арсенале метод, позволяющий быстро и эффективно проводить мониторинг листериоза, выявляя не только L. monocytogenes, но и другие виды этого микроорганизма.
Цель работы - отработать тест-систему в формате «мультиплекс» для выявления бактерий рода Listeria и патогенного вида L. monocytogenes в одной реакции.
Материал и методы. В работе использовали 117 культур листерий, выделенных из различных объектов окружающей среды (продукты питания, органы мышевидных грызунов), и референтные штаммы лис-терий из коллекции лаборатории экологии патогенных бактерий НИИЭМ СО РАМН: L. monocytogenes EGD, L. ivanovii NCTC 11846, L. innocua SLCC 3379, L. seeligeri SLCC 5921, L. welshimeri SLCC 5334 и L. grayi 17.
Микробиологические исследования проводили на средах с использованием методов, рекомендованных ГОСТ Р 51921-2002 и МУК 4.2.1122-02 для выявления листерий.
Молекулярно-генетические методы. В работе использовались олигонуклеотидные праймеры, синтезированные фирмой «Евроген», г. Москва (табл.). Праймеры, ограничивающие фрагменты изучаемых генов, были выбраны в 5'- и 3'-областях открытых рамок считывания с помощью программы Oligo38.
Определение принадлежности выделенных культур к бактериям рода Listeria проводили методом
96
Тихоокеанский медицинский журнал, 2014, № 1
10 11 12
13
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Рис. 1. Электрофорез продуктов амплификации ДНК референтных штаммов листерий с одной парой праймеров prsj-prs2 (1-6 - 211 п.н.) и двумя парами праймеров prst-prs2 i2 plcj-plc2 (8-12 - 211 п.н., 13 - 211 и 476 п.н.):
1,13 - L. monocytogenes EGD; 2,8 - L. ivanovii NCTC11846; 3,9 - L. innocua SLCC 3379; 4, 10 - L. seeligeri SLCC 5921; 5, 11 - L. welshimeri SLCC 5334; 6, 12 - L. grayi 17; 7 - ДНК-маркер (100 bp Ladder, Axygene, США).
амплификации ДНК бактерий при помощи ПЦР с праймерами prs1-prs2 для определения гена prs, кодирующего родоспецифический белок общего метаболизма - фосфорибозилпирофосфатсинтазу, нуклеотидная последовательность которого была получена из базы данных ListiList (http://www.pasteur.fr), содержащей последовательность генома штамма L. monocytogenes EGDe (табл.1), как описано [2].
Идентификацию выделенных культур листерий до вида L. monocytogenes проводили при помощи тест-системы «ЛИСТЕР» («Интерлабсервис», Россия) согласно рекомендациям производителя, а также с помощью видоспецифических для L.monocytogenes праймеров plc1-plc2 по программе, описанной Е.А. Зайцевой [2].
Типирование культур листерий с помощью мультиплексной ПЦР проводили с использованием бактериальных лизатов, приготовленных из суточных культур листерий по методике, описанной Е.А. Зайцевой [1]. Реакционная смесь (25 мкл) содержала 1-кратный ПЦР-буфер: 75 мМ Tris-HCl (pH 8,8), 20 мМ (NH4)2SO4 (Fermentas, Литва), 2мМ MgSO4 («Интерлабсервис», Россия), по 20 пМ каждого праймера, 0,25 мМ смеси дНТФ (Fermentas, Литва), 5 ед. Taq-полимеразы («Би-онем», Россия) и 1 мкл бактериального лизата. ПЦР проводили в амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) по программе быстрого регулирования: 1 цикл при температуре 94 °С - 2 мин, затем 35 циклов при температуре 94 °С - 5 с, 60 °С - 5 с, 72 °С - 5 с.
Электрофорез продуктов амплификации осуществляли в 1,7 % агарозном геле в сравнении со стандартным маркером (100 bp DNA Ladder, Axygene, США). Гель проявляли и фотографировали при помощи гель-документирующей системы Gel Doc XR (BioRad, США).
Результаты исследования. Первоначально все исследуемые культуры листерий были дифференцированы микробиологическим методом, который показал, что 38 культур принадлежали к виду L. monocytogenes, а 79 культур относились к другим видам рода Listeria. При помощи ПЦР, используя каждую пару праймеров (prs1-prs2 и plc1-plc2) в отдельности, а также тест-систему «ЛИСТЕР» («Интерлабсервис», Россия), мы подтвердили результаты, полученные микробиологическим методом. Поэтому в качестве основы для
Рис. 2. Электрофорез продуктов мультиплексной ПЦР с ДНК различных культур листерий:
1 - ДНК-маркер (100 bp Ladder, Axygene, США), 2 - L. monocytogenes EGD (положительный контроль, 211 и 476 п.н.), 3 - L. innocua SLCC 3379 (положительный контроль, 211 п.н.), 4-10 - продукты амплификации ДНК культур листерий, выделенных из продуктов питания.
мультиплексной ПЦР-системы, позволяющей одновременно амплифицировать фрагменты генов prs и plcA, использовали праймеры prs:-prs2 и plc1-plc2. На первом этапе работы в серии экспериментов были оптимизированы условия реакции: концентрация ионов магния, концентрация праймеров, температурно-вре-менные режимы ПЦР.
Возможность одновременного применения праймеров prs1-prs2 и plc1-plc2 в мультиплексной ПЦР проверили на референтных штаммах листерий. Было установлено, что мультиплексная ПЦР с этими праймерами приводит к образованию специфических продуктов амплификации (фрагмент длиной 211 п.н. специфичен для всех видов листерий и два фрагмента - длиной 211 п.н. и 476 п.н. - для L. monocytogenes), соответствующих теоретически рассчитанным для данных пар прайме-ров (рис. 1).
Анализ результатов мультиплексной ПЦР на основе разработанной тест-системы, как и микробиологический метод и тест-система «ЛИСТЕР», показал, что 38 культур принадлежали L. monocytogenes, а остальные 79 - другим видам листерий (рис. 2).
Обсуждение полученных данных. Разработанные к настоящему времени различные коммерческие тест-системы на основе ПЦР специфичны в отношении L. monocytogenes, и не позволяют определить присутствие других Listeria spp. Ген prs, кодирующий ро-доспецифический белок общего метаболизма бактерий рода Listeria фосфорибозилпирофосфатсинтазу, и ген plcA, кодирующий видоспецифический белок L. monocytogenes - фосфатидилинозитол-специфичную фосфолипазу, давно используются в качестве мишеней для молекулярно-генетического типирования листе-рий [2, 3, 6, 11].
В ходе эксперимента было установлено, что амплификация ДНК штамма L. monocytogenes EGD с двумя парами праймеров (prs:-prs2 и plc1-plc2) приводит к образованию двух продуктов - фрагментов длиной 211 и 476 п.н. Эти длины фрагментов соответствуют длинам, теоретически рассчитанным для амплифи-цируемых участков генов prs и plcA, соответственно. Амплификация ДНК штаммов других видов листерий (L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi)
Наблюдения из практики
97
с теми же парами праймеров приводит к образованию лишь одного продукта - фрагмента длиной 211 п.н., соответствующего участку гена prs. Таким образом, сочетание этих праймеров в одной реакции не приводит к образованию неспецифических продуктов амплификации и может быть использовано в мультиплексной ПЦР.
Предлагаемая мультиплексная ПЦР-система позволяет сравнительно быстро (за 3 часа от начала исследования) провести скрининг подозрительных на листерии колоний и одновременно идентифицировать L. monocytogenes в исследуемых образцах. Литература
1. Зайцева Е.А., Пуховская Н.М., Мусатов Ю.С. [и др.] Моле-кулярно-генетические особенности и эпидемиологическая значимость штаммов Listeria monocytogenes, выделенных от беременных женщин и из абортного материала в дальневосточном регионе России // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2007. Т. 9, № 1. С. 81-89.
2. Зайцева Е.А. Система анализа микробиологических и мо-лекулярно-генетических маркеров для выявления высоковирулентных штаммов Listeria monocytogenes: дис. д-ра мед. наук. М., 2010. 299 с.
3. Карпова Т.И., Ермолаева С.А., Лопырев И.В. [и др.] Новые методы идентификации Listeria monocytogenes // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2001. Т.3. С. 266-273.
4. Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. М.: Медицина для всех, 2002. 200 с.
5. Bubert A., Hein I., Rauch M. [et al.] Detection and differentiation of Listeria spp. by a single reaction based on multiplex PCR // Appl. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 65, No.10. P. 4688-4692.
6. Doumith M., Buchrieser C., Glaser P. [et al.] Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR // J. Clin. Microbiol. 2004. Vol. 42. P. 3819-3822.
7. Lehner A., Loncarevic S., Wagner M. [et al.] A rapid differentiation of Listeria monocytogenes by use of PCR-SSCP in the listeriolysin O (hlyA) locus // J. Microbiol. Methods. 1999. Vol. 34, No. 3. P. 165-171.
8. Liu D. [ed.] Handbook of Listeria monocytogenes // USA: CRC Press, 2008. 552 p.
9. Marranzano M., Pitrolo S., Vicari O. [et al.] Presence of Listeria
spp. in vegetables // Ann. Ig: Med. Rev. e communita. 1996. Vol.8, No. 5. P. 531-535.
10. Meinersmann R., Phillips R., Wiedmann M. [et al.] Multilocus sequence typing of Listeria monocytogenes by use of hypervariable genes reveals clonal and recombination histories of three lineages // Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol. 70, No. 4. P. 2193-2203.
11. Nightingale K., Windham K., Wiedmann M. Evolution and molecular phylogeny of Listeria monocytogenes isolated from human and animal listeriosis cases and foods // J. Bacteriol. 2005. Vol. 187, No. 16. P. 5537-5551.
12. Sallen B., Rajoharison A., Desvarenne S. [et al.] Comparative analysis of 16S and 23S rRNA sequences of Listeria species // Int. J. Syst. Evol. Bacteriol. 1996. Vol. 46. P. 669-674.
13. Sue D., Fink, D., Wiedmann, M. [et al.] SigmaB-dependent gene induction and expression in Listeria monocytogenes during osmotic and acid stress conditions simulating the intestinal environment // Microbiology. 2004. Vol. 150. P. 3843-3855.
14. Vazquez-Boland J.A., Kuhn M., Berche P. [et al.] Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants // Clin. Microbiol. Rev. 2001. Vol. 14, No. 3. P. 584-640.
Поступила в редакцию 12.04.2012.
Способ быстрой идентификации бактерий рода Listeria и патогенного вида listeria monocytogenes с помощью мультиплексной ПЦР
С.М. Стародумова1, Е.А. Зайцева1 2
1 НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова СО РАМН (690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1),
2 Тихоокеанский государственный медицинский университет (690950, г. Владивосток, пр-т Острякова, 2)
Резюме. Исследована возможность применения мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, ограничивающими участки генов фосфорибозилпирофосфатсин-тазы (prs) и фосфатидилинозитол-специфичной фосфолипазы (plcA), для быстрой идентификации бактерий рода Listeria с одновременной дифференциацией патогенного вида Listeria monocytogenes. Оценка эффективности метода проведена на 117 культурах листерий, выделенных из разнообразных продуктов питания и органов мышевидных грызунов. В соответствии с результатами мультиплексной ПЦР 38 культур листерий были отнесены к виду L. monocytogenes, а остальные 79 - к Listeria spp. Данный способ можно использовать для мониторинга листери-озной инфекции в работе микробиологов и бактериологов. Ключевые слова: листерии, лабораторная диагностика, моле-кулярно-генетический метод, праймеры.
УДК 616.34-009.11
0 некоторых компенсаторных особенностях толстого кишечника
В.Г. Раповка1, А.Ф. Пономарев1, С.Е. Гаврина2, Л.С. Денисенко2, Е.С. Рогаткина2, О.К. Шкуратова2, С.П. Иванов2, О.А. Соболевская1
1 Тихоокеанский государственный медицинский университет (690950, г. Владивосток, пр-т Острякова, 2),
2 Приморская краевая клиническая больница № 1 (690091, г. Владивосток, ул. Алеутская 57) Ключевые слова: запор, каловый камень, сигмовидная кишка.
on the issue of some compensatory features
OF COLON
V.G. Rapovka1, A.F. Ponomarev1, S.E. Gavrina2, L.S. Denisenko2, E.S. Rogatkina2, O.K. Shkuratova2, S.P. Ivanov2, O.A. Sobolevskaya1 1 Pacific State Medical University (2 Ostryakova Ave. Vladivostok 690950 Russian Federation), 2 Primorsky Krai Regional Clinical Hospital No. 1 (57 Aleutskaya St. Vladivostok 690091 Russian Federation)
Соболевская Ольга Анатольевна - канд. мед. наук, ассистент кафедры госпитальной хирургии ТГМУ; e-mail: [email protected]
summary. Constipation is one of the most widespread human diseases. Women amount at least 70-80 % of all patients having constipation, and for the first time the disease develops during pregnancy more than in 50 % of cases while at the age of 18-20 it develops in 20 % of cases. Men often have constipation in their 40-50th. Submitted to consideration are three unique clinical observations of constipation resulted in solid fecaliths that led to two cases of the surgical judgment.
Keywords: constipation, fecaloma, sigmoid colon.
Pacific Medical Journal, 2014, No. 1, p. 97-98.
