CC BY
62
K M АХ
www.cmac-journal.ru
КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И АНТИМИКРОБНАЯ ХИМИОТЕРАПИЯ
ЙЯОИД 1Ш
2019
DOI: 10.36488/cmac.2019.4.261-273
Оригинальная статья
Листериоз: генотипирование как ключ к выявлению возможного источника заражения
Воронина О.Л.1, Кунда М.С.1, Рыжова Н.Н.1, Кутузова А.В.1, Аксенова Е.И.1, Карпова Т.И.1, Тартаковский И.С.1, Ющук Н.Д.2, Климова Е.А.2, Кареткина Г.Н.2, Чемерис О.Ю.2, Груздева О.А. 3, Мелкумян А.Р.4, Орлова О.Е.5 , Бурмистрова Е.Н.6
1 ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Россия
2 ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, Москва, Россия
3 ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия
4 Городская клиническая больница им. Ф.И. Иноземцева, Москва, Россия
5 Городская клиническая больница им. Л.А. Ворохобова, Москва, Россия
6 Городская клиническая больница им. С.С. Юдина, Москва, Россия
Контактный адрес: Ольга Львовна Воронина Эл. почта: [email protected]
Ключевые слова: листериоз, Listeria monocytogenes, генотипирование, пищевая инфекция.
Цель. Провести сравнительный анализ клинических и пищевых изолятов Listeria monocytogenes, выделенных на территории европейской части России в 2018-2019 гг.
Материалы и методы. В работе использовали мультилокусное секвенирование (MLST), дополненное локусами вирулентности, включающими фрагменты генов интерналинов (MvLST), с последующим филогенетическим анализом.
Результаты. Основными диагнозами при выделении клинических изолятов L. monocytogenes были перинатальный и неонатальный листериоз и менингит. Клинические изоляты относились преимущественно к филогенетической линии II c преобладанием ST7, который также был наиболее многочисленным у изолятов из продуктов питания. Вторым по частоте встречаемости у пищевых изо-лятов был ST121, широко распространенный в Европе. Клинические изоляты филогенетической линии I в трех случаях были представлены ST6, обнаруженным при вспышках листериоза в Европе в 2015-2018 гг. и в Южной Африке в 2017-2018 гг. Принадлежность к филогенетической линии I отмечена только у одного изолята из продуктов питания. В целом разнообразие генотипов пищевых изолятов было существенно выше, чем клинических изолятов. Анализ локусов вирулентности выявил новый аллель интерналина А и новый профиль генов интерналинов у изолята ST7 из продуктов питания.
Выводы. L. monocytogenes наиболее распространенного ST7 является аутохтонной для России; случаи листериоза, вызванного изолятами ST6, скорее всего, относятся к завозным. На основании анализа разнообразия ST и профилей генов интерналинов L. monocytogenes, выявленных на территории России, предложена схема экспресс-диагностики при эпидемических расследованиях.
Original Article
Listeriosis: genotyping as a key for identification a possible source of infection
Voronina O.L.1, Kunda M.S.1, Ryzhova N.N.1, Kutuzova A.V.1, Aksenova E.I.1, Karpova T.I.1, Tartakovskij I.S.1, Yushchuk N.D.2, Klimova E.A.2, Karetkina G.N.2, Chemeris O.Yu.2, Gruzdeva O.A.3, Melkumyan A.R.4, Orlova O.E.5, Burmistrova E.N.6
1 N.F. Gamaleya National Research Center of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia
2 A.I. Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry, Moscow, Russia
3 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, Russia
4 City Clinical Hospital named after F.I. Inosemtsev, Moscow, Russia
5 City Clinical Hospital named after L.A. Vorokhobov, Moscow, Russia
6 City Clinical Hospital named after S.S. Yudin, Moscow, Russia
Contacts:
Olga L. Voronina
E-mail: [email protected]
Key words: listeriosis, Listeria monocytogenes, genotyping, food-borne infection.
Objective. To perform a comparative analysis of clinical and food isolates of Listeria monocytogenes collected in the European part of Russia in 2018-2019.
Materials and methods. We used multilocus sequencing (MLST), supplemented by virulence loci, including fragments of internalin genes (MvLST, Multi-virulent-locus sequence typing), followed by phylogenetic analysis.
Воронина О.Л. и соавт.
Results. The main diagnoses for clinical isolates were prenatal and neonatal listeriosis and meningitis. Clinical isolates predominantly belonged to phylogenetic line II with the predominance of ST7, which was also the most abundant in food isolates. The second most common occurrence in food isolates was ST121, widely distributed in Europe. Isolates of phylogenetic line I in the group of clinical cultures in three cases were represented by ST6, detected during outbreaks of listeriosis in Europe 2015-2018 and South Africa in 2017-2018. Only in one isolate from food belonged to the phylogenetic lineage I. In general, the diversity of food isolate genotypes was significantly higher than clinical isolates. The analysis of virulence loci revealed a new internalin A allele and a new internalin genes profile (IP) in isolate ST7 from food. Conclusions. L. monocytogenes of the most common ST7 is autochthonous in Russia; cases of listeriosis caused by the ST6 bacterium are most likely imported. Based on the analysis of the diversity of ST and IP of L. monocytogenes identified in Russia, a rapid diagnosis scheme for epidemiological investigation is proposed.
Введение
Листериоз, по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), является одним из наиболее серьезных и тяжелых заболеваний пищевого происхождения. Количество зарегистрированных случаев в год составляет 0,1-10 на 1 млн человек в зависимости от страны [1]. Если неинвазивный листериоз, имеющий короткий инкубационный период и характеризующийся лихорадкой, диареей, головной болью и миалгией, чаще не сопровождается выявлением возбудителя, то инвазивные случаи с инкубационным периодом длительностью до 90 дней приводят к госпитализации, обнаружению Listeria monocytogenes в биологических жидкостях и тканях пациента и смертельным исходам в 20-30% случаев [1]. Первая изученная вспышка листе-риоза с пищевым путем передачи, зарегистрированная в 1979-1981 гг. в Канаде (41 случай), показала, что при инвазивном заболевании преобладают две группы диагнозов: перинатальный листериоз (83%) и менингит у взрослых (15%). Один случай сопровождался пневмонией и сепсисом [2]. Следует отметить, что при поражении центральной нервной системы в результате ин-вазивного листериоза лечение не приводит к полному восстановлению здоровья, что отражает фактор «вес нетрудоспособности» (DW: 0 - здоровье, 1 - смерть), составляющий 0,426 [3].
Способность L. monocytogenes расти в широком диапазоне температур (от 1 до 45°С) позволяет достигать скоростей накопления биомассы 0,0350,556 logi0 КОЕ/день при температуре хранения готовых продуктов (5-8°С) [4], поэтому даже незначительная контаминация зоны производства может привести к существенному количеству L. monocytogenes в потребляемых продуктах с учетом разрешенных сроков хранения.
Для контроля L. monocytogenes в готовых к употреблению продуктах специалисты ВОЗ и FAO (Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН) разработали руководство по применению общих принципов гигиены пищевых продуктов [5]. Международная сеть органов по безопасности пищевых продуктов (INFOSAN), которая связывает национальные органы государств-членов, отвечающих за управление мероприятиями по продовольственной безопасности, позволяет ВОЗ и FAO оказывать помощь в
эпидемиологическом надзоре, координации и реагировании на вспышки.
Центры США по контролю и профилактике заболеваний (CDC) на национальном уровне осуществляют координацию действий по контролю листериозной инфекции. CDC была создана PulseNet - сеть национальных лабораторий, собирающих данные о листерии в виде профилей, полученных методом гель-электрофореза в пульсирующем поле, и результатов геномного секвени-рования. GenomeTrakr - еще одна сеть, позволяющая взаимодействовать организациям здравоохранения и лабораториям университетов, способным провести полногеномное секвенирование микроорганизмов. The Listeria Initiative - национальная эпидемиологическая система, которая собирает информацию о лабораторно подтвержденных случаях листериоза.
Европейские CDC (ECDC), в свою очередь, способствуют изучению возбудителя, координируя разработку и оптимизацию протоколов сборки геномов, поскольку собранные геномы позволяют проводить мультилокусное сравнение (wg/cgMLST) выделенных при вспышках бактерий для обнаружения источника инфекции. Референтной лабораторией Евросоюза для L. monocytogenes с 2006 г. является Французское агентство по безопасности пищевых продуктов, окружающей среды и гигиене труда (ANSES). Базой лаборатории служит Институт Пастера в Париже, который поддерживает и развивает базу данных мультилокусного и полногеномного секвенирования L. monocytogenes (https:// bigsdb.pasteur.fr/listeria/) [6].
Несмотря на все перечисленные меры и инициативы, вспышки листериозной инфекции не оставляют человечество. Если на североамериканском континенте в последние годы не зарегистрировано масштабных вспышек (24 случая в США в 2017-2019 гг., 2 смертельных исхода [7], 7 случаев в Канаде [8]), то в Европе ситуация гораздо сложнее. Вспышка 2014-2019 гг., вызванная L. monocytogenes ST1247 (CC8) в рыбе холодного копчения, затронула 5 европейских стран. Подтверждено 22 случая листериоза (23% смертельных исходов) [9]. В 2015-2018 гг. L. monocytogenes ST6 в замороженных овощах привела к 47 случаям заболевания (19% смертельных исходов) в пяти странах [10]. Самой масштабной стала вспышка в августе-сентябре 2019 г.
в Испании, когда L. monocytogenes ST388 в свиной корейке вызвала 222 случая листериоза (3 смертельных исхода, 7 абортов) [11, 12]. Однако беспрецедентное количество заболеваний листериозной инфекцией было отмечено в Южной Африке в 2017-2018 гг.: 1060 заболевших, 216 умерших (20%), 42% случаев составил неонатальный листериоз [13, 14]; 91% изолятов относился к ST6 [14].
В России заболеваемость листериозом официально регистрируют с 1992 г., до 2016 г. ежегодно выявляли до 100 заболевших листериозом [15]. В 2017 г. было зарегистрировано 205 случаев листериоза, т.е. 1% от 20,5 тыс. случаев природно-очаговых и зооно-зных болезней, среди которых учитывают листериоз в Роспотребнадзоре [16]. Вместе с тем листериоз относят к группе инфекций, которые передаются с пищей [15], и контролируют согласно санитарно-эпидемиологическим правилам СП 3.1.7.2817-10 «Профилактика листериоза у людей». В НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи ли-стерии изучали как возбудителя и природно-очаговых, и пищевых инфекций, уделяя внимание, прежде всего, лабораторной диагностике [17], что позволило сотрудникам центра принять участие в разработке Методических указаний МУК 4.2.1122-02 «Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах», принятых в 2002 г. С 2014 г. в России действует ГОСТ 32031-2012, являющийся межгосударственным стандартом для стран Евразийского экономического союза [18]. Основное внимание в этом документе уделено методам идентификации вида ли-стерий: культуральным, морфологическим, биохимическим. Для ускоренной идентификации разрешено использование тестов и тест-систем, валидирован-ных и сертифицированных по ГОСТ ISO 16140-2011, к которым относят системы ПЦР в реальном времени (Thermo Fisher Scientific, США) и визуальной иммуно-хроматографии (Merck, США). Отечественный набор «АмплиСенс® Listeria monocytogenes-скрин/монитор-FL» (ИнтерЛабСервис, Россия) зарегистрирован в 2015 г.
Методы серо- и генотипирования, позволяющие идентифицировать клоны и штаммы, ГОСТ 32031-2012 не регламентирует. Тем не менее эти методы получили свое развитие в специализированных лабораториях российских исследовательских центров.
В НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи активно используют метод MLST Listeria monocytogenes; кроме того, Ермолаевой С. и соавт. разработан подход для типирования локу-сов вирулентности, включающих фрагменты генов ин-терналинов, - MvLST (Multi-virulent-locus sequence typing) [19-22]. Дальнейшие исследования изолятов листерий [21-24] пополнили список аллелей интерналинов (Inl) A, B, C, E и интерналиновых профилей (IP). Широта исследования, охват изолятов европейской части России и Дальневосточного федерального округа (ДФО) стали возможны благодаря многоцентровому сотрудничеству (НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, НИИЭМ им. Г.П. Сомова, ФИЦВиМ, а теперь и филиалы ФИЦВиМ в ПФО). В ходе работы для сравнения клинического изолята и штамма из природного очага ДФО был применен метод полногеномного секвенирования (GenBank Accession Numbers: CP018148, CP018149).
Накопленный методический опыт позволил сотрудникам НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи включиться в новое исследование циркулирующих в России штаммов Listeria monocytogenes с целью поиска возможных источников инвазивного листериоза, выявляемого в медицинских организациях.
Материалы и методы
Было проанализировано две группы изолятов L. monocytogenes: 1) клинические (ноябрь 2018 г. -апрель 2019 г.), выделенные в лечебных учреждениях Москвы и Сызрани (Таблица 1); 2) из продуктов питания (январь 2018 г. - май 2019 г.), переданные лабораториями по исследованию объектов окружающей среды (Таблица 2). Вторая группа была дополнена изолятами из среды приготовления пищи (раковина ресторана),
Таблица 1. Характеристика клинических изолятов L. monocytogenes
Изолят Филогенетическая линия ST ID MLST Database IP Дата выделения Пациент Пол Возраст Диагноз МКБ 10 Город
GIMC2014:LmcSH3 II 14 42983 27 09.11.2018 1 Ж - Листериоз; вторичный менингит G03.9 Сызрань
GIMC2005:LmcIH1_1f I 241 42973 43 01.02.2019 2 Ж 80 Менингит G03.9 Москва
GIMC2008:LmcUH14 II 7 42976 15 18.04.2019 3_1 М 59 Менингит G03.9 Москва
GIMC2007:LmcIH1_3 II 7 42975 15 25.04.2019 3_2 М 59 Менингит G03.9 Москва
GIMC2011:LmcUH12 II 7 42979 15 30.11.2018 4 Ж 0 Неонатальный диссеминированный листериоз P37.2 Москва
GIMC2009:LmcUH4 II 7 42977 15 13.02.2019 5 Ж 23 Преждевременные роды 060.0 Москва
GIMC2010:LmcUH8 II 7 42978 15 13.02.2019 6 М 0 Врожденная пневмония неуточненная P23.9 Москва
GIMC2012:LmcUH1 I 6 42981 44 06.03.2019 7 Ж 0 Неонатальный диссеминированный листериоз P37.2 Москва
БОЛЕЗНИ И ВОЗБУДИТЕЛИ
КМАХ . 2019 . Том 21. №4 Продолжение табл. 1
Изолят Филогенетическая линия ST ID MLST Database IP Дата выделения Пациент Пол Возраст Диагноз МКБ 10 Город
GIMC2006:LmcIH1_2 II 7 42974 15 07.03.2019 8 Ж 30 Листериозный сепсис, вызвавший самопроизвольный аборт на 18-й неделе А32.7; 003 Москва
GIMC2002:LmcH67_1 I 6 42980 44 16.03.2019 9 Ж 0 Неонатальный диссеминированный листериоз P37.2 Москва
GIMC2013:LmcUH16 I 6 42982 44 25.04.2019 10 М 65 Перенесенный инфаркт миокарда I25.2 Москва
выделенными в июле 2019 г. (Таблица 2). Изоляты из окружающей среды, полученные из коллекции ФГБНУ ФИЦВиМ и использованные в группе сравнения, были проанализированы нами ранее [21, 24] и зарегистрированы в базе данных Institut Pasteur MLST and whole genome MLST (https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/) [6] под ID 5799-5801, 5803-5816.
Выделение культур L. monocytogenes из продуктов питания проводили согласно ГОСТ 32031-2012 [18], клинические изоляты выделяли в соответствии с Методическими указаниями по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) ме-
тодов исследования в клинико-диагностических лабораториях (Приложение 1 к Приказу Минздрава СССР № 535 от 22.04.1985).
Для получения препарата ДНК изолятов одну колонию микроорганизма переносили в 20 мкл лизирующего буфера, содержащего 0,25% SDS и 0,05 М №ОН, прогревали 15 мин. при 95°С и добавляли 180 мкл биди-стиллированной воды. Полученный лизат хранили при температуре 4°С.
Праймеры, использованные для MLST, представлены в Таблице 3. В программе амплификации для локусов MLST: 95°С - 3 мин.; (95°С - 30 сек., Т°С - 40 сек.,
Изолят Фило-генетическая линия ST ID MLST Database IP Дата выделения Наименование продукта Наименование продукции согласно [25] Сокращение названия для рисунка Город
GIMC2015:Lmc22 II 7 42984 15 14.05.2018 Мясо, охлажденное в тушах 1.1.1. Мясо убойных животных мясо (M) Самара
GIMC2017:Lmc921 II 9 42987 46 25.04.2018 Хинкали грузинские замороженные 1.1.3. Полуфабрикаты мясные мясо (M) Самара
GIMC2021:Lmc431 II 121 42992 48 12.02.2019 Оленина, котлетное мясо замороженное 1.1.3. Полуфабрикаты мясные мясо (M) Москва
GIMC2019:Lmc309 II 121 42990 48 15.02.2018 Полуфабрикат мясной мелкокусковой охлажденный 1.1.3. Полуфабрикаты мясные мясо (M) Самара
GIMC2018:Lmc2433 II 9 42988 46 07.11.2018 Жир-сырец говяжий 1.3. Жир-сырец говяжий жир (Fat) Самара
GIMC2025:Lmc82_19 II 7 42986 15 27.05.2019 Мясо птицы замороженное, цыплята 1.9.1. Мясо птицы птица (P) Самара
GIMC2016:Lmc547 II 7 42985 45 14.02.2019 Филе бедра цыпленка замороженное 1.9.2. Полуфабрикаты из мяса птицы птица (P) Москва
GIMC2001:Lmc156 II 504 42996 47 25.01.2018 Филе куриное по-шанхайски 1.11.9. Готовые быстрозамороженные блюда из мяса птицы птица (P) Самара
GIMC2003:Lmc171 II 31 42989 49 07.11.2018 Сельдь атлантическая филе 3.3.4.Рыба соленая, пряная рыба (F) Самара
Таблица 2. Характеристика изолятов L. monocytogenes, выделенных из продуктов питания
Продолжение табл. 2
Изолят Филогенетическая линия ST ID MLST Database IP Дата выделения Наименование продукта Наименование продукции согласно [25] Сокращение названия для рисунка Город
GIMC2020:Lmc630 II 121 42991 48 20.02.2019 Форель радужная, филе, ломтики «Русское море» 3.3.3. Рыба разделанная малосоленая рыба (F) Москва
GIMC2022:Lmc2052 II 121 42993 48 16.04.2019 Форель, филе, кусочек с кожей, слабосоленая, охлажденная «Меридиан» 3.3.3. Рыба разделанная малосоленая рыба (F) Москва
GIMC2024:Lmc2689 II 155 42994 50 29.04.2019 Семга соленая, ломтики в вакуумной упаковке, «Пеликан» 3.3.3. Рыба разделанная малосоленая рыба (F) Москва
GIMC2004:Lmc76_19 I 288 42995 51 20.05.2019 Молоко пастеризованное 2.2.1. Питьевое молоко пастеризованное молоко (Milk) Самара
GIMC2026:LmcBD14 II 37 42997 28 29.07.2019 Моечная раковина, ресторан мойка (Sink) Москва
GIMC2027:LmcBD15 II 37 42998 28 29.07.2019 Моечный слив раковины, ресторан слив (Sink) Москва
72°С - 1 мин.) х 35; 72°С - 5 мин.; 4°С - хранение, в зависимости от мишени изменяли только температуру отжига (Т°С), значения которой внесены в Таблицу 3.
Локусы вирулентности включали 4 гена интернали-нов (Ы), предложенных для анализа Adgamov R и со-авт. [20]. Последовательность 1п1А, 1п1Б, 1п1С, InlE формирует профиль генов интерналинов (1Р). Праймеры, использованные для амплификации локусов MvLST, а также значения температуры отжига представлены в Таблице 3.
Таблица 3. Праймеры для амплификации локусов М1^Т и MvLST
Секвенирование продуктов амплификации проводили согласно протоколу к набору BigDye Terminator 3.1 Cycle Sequencing kit на геномном анализаторе Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems/Hitachi, США). Электрофоретическое разделение продуктов реакции выполняли в капиллярах длиной 50 см с использованием полимера POP7.
Анализ аллелей MLST и аллельных профилей проводили с помощью ресурсов сайта Institut Pasteur MLST and whole genome MLST (https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/)
№ Локус Название праймера Последовательность праймера T° отжига Авторы
1 abcZ abcZF TCGCTGCTGCCACTTTTATCCA 55 [26]
abcZR TCAAGGTCGCCGTTTAGAG
2 bglA bglA38F GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGCCGACIIIIIATGGGGTGGAG 65 [27]
bglA591R TTGTGAGCGGATAACAATTTCCGATTAAATACGGTGCGGACATA
3 cat catF ATTGGCGCATTTTGATAGAGA 55 [26]
catR AGATTGACGATTCCTGCTTTTG
4 dap dapEF CGACTAATGGGCATGAAGAACAAG 59 [26]
dapER ATCGAACTATGGGCAIIIIIACC
5 dat datF GAAAGAGAAGATGCCACAGTTGA 55 [26]
datR TGCGTCCATAATACACCATCTTT
6 ldh ldhF GTATGATTGACATAGATAAAGA 50 [21]
ldhR TATAAATGTCGTTCATACCAT
7 lhkA lhkA_F2 TGAACACGTATCAGCGAATT 58 Данное
lhkA_R2 TGAGGCCACTAATCGTTGT исследование
8 Секвенирование PrSeqF GTTTTCCCAGTCACGACGTTGT [27]
PrSeqR TTGTGAGCGGATAACAATTTC
БОЛЕЗНИ И ВОЗБУДИТЕЛИ
КМАХ . 2019 . Том 21. №4 Продолжение табл. 3
№ Локус Название праймера Последовательность праймера T° отжига Авторы
9 InlA InlAF TAACGGGACAAATGCTCAGGC 63 [20]
InlAR TGTTAAACTCGCCAATGTGCC
10 InlB InlB-146F CAGATGATGCTTTTGCAGAA 54 [24]
InlB-1229R GCATTCCCGCGAATATATTT
InlB590F AAATTAGTGATATTGTGCCAC
InlB-610R GTGGCACAATATCACTAATTT
11 InlC InlCF TTTCCAGATCCCGGCCTAGC 63 [20]
InlCR ATAGCCTCAGTCTCCCCAACG
12 InlE InlEF AAGCGGATGTAACAGACGAAG 55 [24]
InlER GATAAAATACGGGTTGGTTGG
[6]. Проанализированные изоляты депонировали в базе данных сайта: ID 42973-42998 (Таблицы 1 и 2).
Аллели MvLST определяли, используя в качестве эталона опубликованные последовательности [20, 24]. Новые варианты аллелей регистрировали в GenBank (InlA MN580484 - MN580486; InlB MN580487 -MN580488; InlC MN580489 - MN580492; InlE MN580493 - MN580496). IP определяли в соответствии с ранее опубликованными данными [20, 24].
Филогенетический анализ в программе MEGA 6.0 [28] выполняли для двух групп последовательностей: сцепленных последовательностей локусов MLST (2808 п.н.) и сцепленных последовательностей локусов IP (1176 п.н.). Для выравнивания использовали сервис MUSCLE [29]. Построение дендрограмм, отражающих филогенетическое родство ST/IP, проводили с помощью метода максимального правдоподобия (ML). Для оценки эволюционных различий по локусам MLST использовали модель Tamura - Nei [30], по IP локусам - модель General Time Reversible (GTR) [31]. Выбор модели основывался на результатах Modeltest и критерия Akaike [32]. Для оценки надежности филогенетического дерева проводили Bootstrap тест с числом реплик 1000.
Результаты
Характеристика клинических изолятов L. monocyto-genes
В нашей выборке клинические изоляты были представлены 11 культурами L. monocytogenes (Таблица 1). Более половины из них (6) было связано со случаями перинатальной и неонатальной патологии: самопроизвольный аборт у беременной с листериозным сепсисом, преждевременные роды и рождение ребенка с пневмонией, неонатальный диссеминированный листериоз (3). Следующая по численности группа включала пациентов с менингитом (4). Один изолят был выделен от пациента с инфарктом миокарда. Последние два диагноза наблюдали у пациентов обоих полов старшей возрастной группы (59-80 лет).
Генотипирование изолятов показало, что 4 случая заболеваний были вызваны L. monocytogenes филогенетической линии I. Два пациента с неонатальным
листериозом и пациент с инфарктом миокарда были инфицированы L. monocytogenes ST6, пациент с менингитом - ST241. Как видно из Рисунка 1, эти генотипы относятся к разным ветвям дендрогаммы в пределах клада филогенетической линии I (Bootstrap-показатель 87).
6 изолятов относились к филогенетической линии II: 2 выделены от пациентов с менингитом, 4 - при перинатальной и неонатальной патологии. 5 изолятов принадлежали ST7, 1 изолят - ST14. Указанные генотипы расположены в разных кладах филогенетической линии II (Bootstrap-показатель 99).
Таким образом, в группе клинических изолятов большинство (6) относилось к филогенетической линии II, ST7. Количество выявленных генотипов L. monocytogenes составило 4.
Характеристика изолятов из продуктов питания
Из 15 изолятов L. monocytogenes 8 были выделены из продукции мясного и молочного животноводства, 4 -из рыбной продукции, 2 - из среды приготовления пищи (Таблица 2). 8 культур получены из образцов продуктов в Самарской области, 5 - из продуктов в Москве.
В проанализированной выборке только 1 изолят L. monocytogenes относился к филогенетической линии I (ST288) и был выделен из пастеризованного молока. Из данных, представленных на Рисунке 1, следует, что этот генотип формирует отдельную (базальную) ветвь в кладе филогенетической линии I.
Остальные изоляты представляли филогенетическую линию II и относились к 7 генотипам. Наиболее часто встречались ST7 и ST121, дважды - ST9 и ST37, по одному разу - ST155, 288, 504. Изоляты ST7 и ST121 выделяли как в Москве, так и в Самаре. ST7 был характерен для изолятов из мяса и птицы, ST121 - из мяса и рыбы.
Сопоставление клинических изолятов и изолятов из пищевых продуктов с изолятами из окружающей среды
Проведенный анализ двух групп изолятов показал, что общим генотипом в обеих группах является только ST7. Следует отметить, что все изоляты были выделены из образцов, полученных в европейской части России. Клинические изоляты, за исключением одного, представляли Центральный федеральный округ (ЦФО), а
изоляты из пищевых продуктов были в равной степени представлены образцами ЦФО и Приволжского федерального округа (ПФО). Для поиска возможного источника L. monocytogenes в окружающей среде мы сопоставили полученные данные с ранее типированными изолятами из коллекции, собранной сотрудниками ФГБНУ ФИЦВиМ в ЦФО во время экологического мониторинга трех национальных парков и Иваньковского водохранилища в 2006-2013 гг. [21, 24]. Таким образом, мы учли географические и временные параметры при сопоставлении данных.
На Рисунке 1 образцы из окружающей среды помечены знаком деревьев. Согласно рисунку, в кластерах ST7 и ST14 находятся как образцы из окружающей среды, так и из двух проанализированных групп. В группе клонального комплекса 7 (CC7) образцы из окружаю-
щей среды относились к двум генотипам: ST7 и ST111. Последний является SLV (вариант по одному локусу ал-лельного профиля), ST7 по локусу и выделен из подстилки в зоне кормления животных заповедника, тогда как изоляты ST7 получены из фекалий оленей и кабанов.
В кластере ST14 в данной выборке был только один клинический образец, однако в окружающей среде этот генотип представлен широко и был обнаружен как у изо-лятов из речной рыбы, так и из фекалий кабана [21, 24].
Сопоставление полученных данных со сведениями по вспышкам пищевой листериозной инфекции
Поиск данных по вспышкам листериозной инфекции за последние годы также проводился преимущественно по странам Европы. Как видно из Рисунка 1, к кластеру СС7 относится вспышка 2019 г. в Великобритании, кото-
ST6 Австрия, Дания, Финляндия,
Швеция, Англия 2014-2018 (заморож. овощи)
ST224 СС224 Люксембург 2019
ST1247CC8 Дания, Эстония, Финляндия,Франция, Швеция 2014-2019 (рыба)
ST20 Норвегия 2019 (рыба)
Рисунок 1. Филогенетическое древо сцепленных последовательностей фрагментов генов MLST (рамкой обведены профили изолятов филогенетической линии I)
Воронина О.Л. и соавт.
рую вызвала L. monocytogenes ST297 (ID MLST database 39930-39932), SLV ST7 по локусу bglA.
В кластерах филогенетической линии II находятся еще две вспышки, связанные с рыбопродуктами: 1) 20142018 гг., затронувшая 5 стран и вызванная L. monocytogenes ST1247 (CC8) [9] и 2) 2019 г. в Норвегии, вызванная L. monocytogenes ST20 (ID MLST database 39834). На Рисунке 1 видно, что L. monocytogenes CC8 и ST20 обнаружены в окружающей среде при мониторинге природных объектов ЦФО.
К филогенетической линии I относятся L. monocytogenes трех европейских вспышек: 1) в 2015-2018 гг. в 5 странах Европы, причиной которой послужили L. monocytogenes ST6 в замороженных овощах [10]; 2) в 2019 г. в Люксембурге, вызванная L. monocytogenes ST224 (ID MLST database 39755-39757), и 3) в 2019 г. в Испании - L. monocytogenes ST388, охватившая 5 регионов страны [11, 12]. В нашем исследовании из перечисленных генотипов обнаружен только ST6 у трех клинических изолятов. Учитывая, что эпидемия L. monocytogenes ST6 затронула не только страны Европы, но и Южную Африку в 2017-2018 гг. [13, 14], перечень зараженных продуктов питания, а также широкую географию поставок, нельзя исключить завозные случаи листериоза, вызванного L. monocytogenes ST6 в нашей стране.
Генотип ST224 из вспышки в Люксембурге ближе всего генотипу L. monocytogenes ST241, выделенной у пациента с менингитом, но сходен только по трем локу-сам аллельного профиля. Генотип ST338, обнаруженный у возбудителя листериоза в Испании, также по трем ло-кусам сходен с ST1, ранее преобладавшим наряду с ST2 в случаях листериозного менингита в Нидерландах, но, начиная с 2010 г., потесненным ST6 и другими ST [33]. Возвращаясь к ST338, стремительно распространившемуся по Испании в августе-сентябре 2019 г., следует отметить, что первый случай инфекции L. monocytogenes этого генотипа, зарегистрированный в MLST database (ID 4319), относится к 2002 г. (Канада). В настоящее время в MLST database содержится информация о 148 изолятах ST338, исключая пока не внесенную в базу испанскую вспышку.
Таким образом, мы проанализировали разнообразие L. monocytogenes, выделенных в текущем году. Как же изменился спектр генотипов бактерии за последнее время? Для ответа на этот вопрос мы рассмотрели все российские изоляты L. monocytogenes, депонированные в MLST database.
Анализ российских изолятов L. monocytogenes, представленных в MLST database
В базе данных Institut Pasteur MLST and whole genome MLST (https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/) представлено 152 российских изолята, в том числе депонированных нами. Исследования, начатые сотрудниками НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи и НИИЭМ им. Г.П. Сомова на дальневосточных штаммах L. monocytogenes [20], были продолжены в работах НИЦЭМ им Н.Ф. Гамалеи с ФИЦВиМ на штаммах коллекции ФИЦВиМ XXI века [21, 24], также XX века [22]. Сотрудниками ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск, Россия) были исследо-
ваны клинические изоляты 2015-2017 гг., два изолята из окружающей среды 2018 г., а также изоляты из продуктов питания 2017 г. (один изолят 2018 г.) (ID 3767537702; 40075-4079; 41055-41069; 41071;41075, 41516; 41522-41526; 42264-42275). Информация о 5 изолятах 1948-1956 гг. (ID 4313, 4881, 5098, 5322, 5423) добавлена в 2011 г. Haase J. (Environmental Research Institute, Ирландия). Таким образом, данные нашего исследования дополнили базу данных сведениями о штаммах 2018-2019 гг.
Представленные изоляты были неравномерно распределены по трем группам (Таблица 4). Преобладали изоляты из окружающей среды, к которым отнесены и изоляты от сельскохозяйственных животных. Несколько меньше клинических изолятов от людей. Изоляты из продуктов питания начали генотипировать в России с 2017 г., поэтому их почти в 2 раза меньше, чем изолятов предыдущих групп. Следует отметить, что первый изолят из продуктов, полученный в 1948 г., был геноти-пирован Haase J. в 2011 г.
При оценке количества генотипов в каждой группе изолятов мы обратили внимание на более высокое разнообразие ST изолятов из продуктов (0,6 ST/изолят vs. 0,4 ST/изолят в двух других группах).
В группе клинических изолятов изоляты филогенетической линии II составляли 61%, по количеству лидировал ST7 (20%). Изоляты СС7 составили 24%. Поскольку изоляты, собранные в европейской части России, представляли 70% группы, мы провели расчет отдельно для этой подгруппы. В ней изоляты филогенетической линии II составили 76%, ST7 - 29%, СС7 - 34%.
В группе изолятов из окружающей среды изоляты филогенетической линии II составляли 67%, по количеству лидировал ST7 (23%). Изоляты СС7 составили 30%. В данной группе было 56% европейских изолятов, среди которых только один принадлежал филогенетической линии I, изоляты ST7 - 32%, CC7 - 44%.
В группе изолятов из пищевых продуктов доминировала филогенетическая линия II (92% изолятов), лидировал ST121 (24%), а ST7 занимал третье место по численности - 8%; СС7 - 11%.
Рассмотрим отдельно превалирующий в европейской части России CC7 (Таблица 5). В комплекс входит 9 генотипов, среди которых ST7 - абсолютный лидер, а оставшиеся 8 ST встречались однократно. Большинство генотипов отличаются от ST7 по одному локусу аллельного профиля - ldh, только ST126 дополнительно отличается по гену lhkA. Следует отметить, что в MLST database
Таблица 4. Российские изоляты в MLST database
Изоляты
Характеристики клинические из окружающей среды из продуктов питания
Количество 54 60 38
изолятов
Количество ST 21 24 21
Преобладающие ST 7 (20%); 1 (13%); 2 (13%); 6 (6%) 7 (23%); 315 (20%); 145 (10%) 121 (24%), 9 (13%); 7 (8%); 37 (8%)
Таблица 5. Разнообразие изолятов CC7 на территории России
ST abcZ bglA cat dapE dat ldh lhkA клинические из окружающей среды из продуктов питания MLST Database (4136)
7 5 8 5 7 6 2 1 11 14 3 1053 (25%)
12 5 8 5 7 6 22 1 1 0 0 44 (1%)
23 5 8 5 7 6 25 1 0 1 0 7 (0,2%)
85 5 8 5 7 6 38 1 0 1 0 7 (0,2%)
98 5 8 5 7 6 45 1 0 1 0 14 (0,34%)
106 5 8 5 7 6 50 1 0 1 0 2 (0,05%)
111 5 8 5 7 6 53 1 0 1 0 7 (0,2%)
126 5 8 5 7 6 65 15 0 0 1 2 (0,05%)
1539 5 8 5 7 6 398 1 1 0 0 1(0,02%)
из генотипов CC7 также чаще всего встречается ST7. Изоляты этого генотипа составляют 25% от депонированных образцов.
Как давно изолируют L. monocytogenes СС7 в нашей стране? Согласно MLST database, первый изолят из окружающей среды датируется 1947 г., из продуктов - 1948 г., клинический - 1960 г. (Таблица 6). Скорее всего, ST7 и представители CC7 являются аутохтонными для территории России.
Анализ локусов вирулентности у изолятов выборки
С целью поверить степень гетерогенности изолятов одного генотипа (ST) по факторам вирулентности мы провели анализ локусов интерналинов, определив IP. Как видно из Таблицы 7, одинаковые IP15 имеют как клинические, так и большинство изолятов из пищевых продуктов с генотипом ST7. Такой IP у изолятов этого генотипа отмечали и ранее [20, 21, 24]. Однако у одного изолята ST7, выделенного из мяса птицы (GIMC2016:Lmc547, Таблица 2), был определен новый аллель InlA и новый IP45. Разные IP, также отличавшиеся аллелем InlA, ранее были обнаружены нами у изолятов ST14, выделенных из окружающей среды [21, 24].
Следует отметить, что аллель 11 (IP27), обнаруженная в нашем исследовании у клинического изолята GIMC2014:LmcSH3 (Таблица 1), у изолята из окружающей среды коррелировал с более высокой вирулентностью, проявлявшейся в опытах на мышах, чем у изолятов с аллелем 12 (IP36) [21, 24].
Таблица 6. Время выделения изолятов CC7 на территории России
ST Год выделения изолята
Клинические Окружающая Продукты образцы среда питания
7 1960 1952 2018
12 1975
23 1965
85 1965
98 1955
106 1947
111 2008
126 1948
1539 1971
Для изолятов ST37, выделенных из среды приготовления пищи, мы определили IP28. Ранее для изолята ST37, выделенного из фекалий кабана, был определен такой же IP [20].
Для изолятов других генотипов определение IP было проведено впервые, поэтому аллельные профили 43-51 являются новыми.
Сопоставление филогенетического древа последовательностей IP (Рисунок 2) c древом последовательностей MLST (Рисунок 1) показывает, что кластеры генотипов совпадают с кластерами IP, подтверждая достоверность различий изолятов двух филогенетических линий, а также генетических групп внутри каждой филогенетической линии.
Заметим, что анализ всех известных IP российских изолятов L. monocytogenes показал различия между изолятами филогенетических линий I и II по разнообразию аллелей для каждого из четырех локусов IP. Разнообразие оценивали по отношению количества вы-
Таблица 7. Профили аллелей интерналинов
Источник изолятов Фило-генетическая линия ST InlA InlB InlC InlE IP
Клинические образцы II 7 4 14 6 8 15
II 14 11 14 11 11 27
I 241 17 22 14 3 43
I 6 16 1 4 13 44
Продукты II 7 4 14 6 8 15
питания II 37 9 11 7 8 28
II 7 18 14 6 8 45
II 9 7 13 18 9 46
II 504 9 17 7 12 47
II 121 9 17 7 2 48
II 31 9 21 7 14 49
II 155 10 14 19 2 50
I 288 3 8 20 15 51
Полужирным шрифтом выделены новые аллели и IP.
/ / ©
Рисунок 2. Филогенетическое древо сцепленных последовательностей локусов интерналинов (рамкой обведены профили изолятов филогенетической линии I)
явленных аллелей к количеству профилей, зарегистрированных для изолятов филогенетической линии. Для филогенетической линии II такой показатель был выше в 2 раза для локуса 1п1А (0,4 vs. 0,2) и на 13% для ло-куса 1п1С (0,4 vs. 0,3), а для филогенетической линии I превышение в 2 раза отмечено для локуса 1п1В (0,6 vs. 0,3). Разнообразие аллелей 1п1Е (0,3) было одинаковым в филогенетических линиях. Существенное превышение аллельного разнообразия по локусу 1п1В для филогенетической линии I объясняется тем, что в 50% !Р филогенетической линии II выявлен аллель 14. Широкая представленность аллеля ЫВ14 сделала именно его объектом сравнительного исследования с П1В9 филогенетической линии I в работе СЬш1епко Т и соавт. [34].
Оценивая разнообразие аллелей фрагментов генов 1п1, следует отметить, что больше всего аллелей (22) выявлено для ЫВ, 21 из которых имеет несинонимичные замены, т.е. для 1п1В подавляющему большинству обнаруженных нуклеотидных последовательностей соответствуют уникальные аминокислотные. У 1п1С и ЫЕ половина аллелей имеет несинонимичные замены, тогда как у 1п1А количество уникальных аминокислотных последовательностей в 3 раза меньше выявленных аллелей. Построение филогенетических деревьев для аминокислотных последовательностей каждого из локусов Ы показало, что аллели 1п1В и 1п1Е четко распределены между филогенетическими линиями (Bootstrap-показатель 99 и 100 соответственно), несколько ниже Bootstrap-
показатель (87) для InlC, тогда как для InlA ряд аллелей филогенетической линии II кластеризуется с аллелями филогенетической линии I, и только аллели 7-11 и 15 филогенетической линии II формируют отдельную группу (Bootstrap-показатель 88).
Возможно, выявленное различие аллелей InlA связано с особенностью фрагмента, выбранного для амплификации. Если для локусов InlB, InlC, InlE фрагмент, отвечающий возможностям секвенирования по Сэнгеру (700-800 п.н.), включал всю область богатых лейцином повторов (LRR), то для InlA только 9 из 15 повторов вошло в анализ [35].
Предложение локусов для экспресс-схемы идентификации изолятов L. monocytogenes
Представленные данные дают возможность выбрать локусы для экспресс-схемы идентификации, позволяющей, прежде всего, определить принадлежность изолята к филогенетической линии и CC. Для первоначальной идентификации достаточно трех локусов: cat, dat (MLST) и InlE (IP). Далее они могут быть дополнены наиболее вариабельными локусами для определенной филогенетической линии и CC. Такой подход позволит сэкономить время и ресурсы при расследовании вспышек.
Однако оптимальным для полной характеристики изолятов, ставших причиной листериоза, является полногеномное секвенирование с последующей сборкой геномов и оценкой cgMLST [6].
Заключение
Проведенное исследование показало, что большинство клинических изолятов L. monocytogenes 20182019 гг. выделяли при перинатальном и неонатальном листериозе. Изоляты филогенетической линии I встречались реже, чем изоляты филогенетической линии II. L. monocytogenes ST6, выявленная у трех пациентов, ско-
рее всего, является завозной, поскольку ни в окружающей среде, ни в продуктах питания на территории России листерии такого генотипа не обнаружено.
Среди клинических изолятов филогенетической линии II преобладала L. monocytogenes ST7, широко распространенная в окружающей среде и обнаруженная в продуктах питания в двух регионах.
Изоляты из продуктов питания отличались большим разнообразием выявленных генотипов преимущественно филогенетической линии II. Преобладали изо-ляты L. monocytogenes ST7. Большинство изолятов L. monocytogenes ST7 из продуктов питания были идентичны клиническим изолятам по IP, однако изолят из мяса птицы имел новый аллель InlA и новый IP45, что свидетельствует о большей изменчивости L. monocytogenes, размножающихся в продуктах.
Вторым по численности в нашей выборке изолятов из пищевых продуктов и первым среди всех изолятов из России, представленных в базе данных MLST, был ST121. Изменчивость пищевых штаммов этого генотипа была прослежена в международном исследовании 70 геномов одного из распространенных в Европе ST121. Все геномы показали 99,7% идентичность нуклеотидной последовательности. Различия между двумя российскими изолятами, вошедшими в анализ, заключались в следующем: в геноме изолята 2012 г. отсутствовал транспозон Tn6188 и стоп-кодон в гене InlA, в то время как изолят 2013 г. уже имел вставку мобильного элемента и тран-кированный InlA, как и большинство пищевых и клинических изолятов выборки [36].
Таким образом, для эпидемиологического контроля пищевых продуктов и производств оптимальным является метод полногеномного секвенирования и сопоставления cgMLST выделенных культур L. monocytogenes. Для экспресс-диагностики L. monocytogenes при расследовании случаев инвазивного листериоза мы предлагаем амплификацию и секвенирование трех локусов: cat, dat (MLST) и InlE (IP).
Литература
1. WHO. Listeriosis. Available at: www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/listeriosis.
2. Schlech W.F. 3rd, Lavigne P.M., Bortolussi R.A., Allen A.C., Haldane E.V., Wort A.J., et al. Epidemic listeriosis - evidence for transmission by food. N Engl J Med. 1983;308(4):203-206. DOI: 10.1056/NEJM198301273080407
3. WHO estimates of the global burden of foodborne diseases. Foodborne disease burden epidemiology reference group 20072015. Available at: https://apps.who.int/iris/bitstream/han dle/10665/199350/9789241565165_eng.pdf?sequence=1.
4. Listeria monocytogenes risk assessment. Appendix 8: Growth of Listeria monocytogenes in foods. FDA. Available at: https:// www.fda.gov/media/77930/download.
5. Guidelines on the application of general principles of food hygiene to the control of Listeria monocytogenes in ready-to-eat
foods. CAC/GL 61 - 2007. Available at: www.fao.org/input/ download/standards/10740/CXG_061e.pdf.
6. Moura A., Criscuolo A., Pouseele H., Maury M.M., Leclercq A., Tarr C., et al. Whole genome-based population biology and epidemiological surveillance of Listeria monocytogenes. Nat Microbiol. 2016;2:16185. DOI: 10.1038/nmicrobiol.2016.185
7. Outbreak of Listeria Infections. Timeline of Reported Cases. Posted August 23, 2019. Available at: www.cdc.gov/listeria/ outbreaks/monocytogenes-08-19/epi.html.
8. Public Health Notice - Outbreak of Listeria infections linked to Rosemount brand cooked diced chicken. October 2, 2019. Available at: www.canada.ca/en/public-health/services/public-health-notices/2019/outbreak-listeria-infections-cooked-diced-chicken.html.
9. Joint ECDC-EFSA rapid outbreak assessment: Multi-country
outbreak of Listeria monocytogenes serogroup IVb, multi-locus sequence type 6, infections linked to frozen corn and possibly to other frozen vegetables - first update. 3 July 2018. Available at: www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-multi-country-outbreak-listeria-monocytogenes-serogroup-ivb.
10. Rapid risk assessment: Multi-country outbreak of Listeria monocytogenes PCR serogroup IVb, MLST ST6. 8 December
2017. Available at: www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-multi-country-outbreak-listeria-monocytogenes-pcr-serogroup.
11. Centro de Coordinación de Alertas y Emergencias Sanitarias. Informe de fin de seguimiento del brote de listeriosis 27 de septiembre de 2019. Available at: www.mscbs.gob.es/ profesionales/saludPublica/ccayes/alertasActual/listeriosis/ docs/Informe_cierre_Listeriosis_20190927.pdf.
12. WHO. Disease outbreak news. Listeriosis - Spain. 16 September 2019. Available at: www.who.int/csr/don/16-september-2019-listeriosis-spain/en/.
13. WHO. Disease outbreak. Listeriosis - South Africa. 28 March
2018. Available at: www.afro.who.int/health-topics/listeriosis/ outbreak/28-march-2018-south-africa/.
14. Smith A.M., Tau N.P., Smouse S.L., Allam M., Ismail A., Ramalwa N.R., et al. Outbreak of Listeria monocytogenes in South Africa, 2017-2018: Laboratory Activities and Experiences Associated with Whole-Genome Sequencing Analysis of Isolates. Foodborne Pathog Dis. 2019;16(7):524-530. DOI: 10.1089/ fpd.2018.2586
15. Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing in the Primorsky Region. Dangerous disease listeriosis. Available at: http://25.rospotrebnadzor.ru/c/ journal/view_article_content?groupId=10156&articleId=3738 55&version=1.0. Russian. (Управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Опасное заболевание листериоз. Доступно по адресу: http://25.rospotrebnadzor. ru/c/journal/view_article_content?groupId=10156&articleId=3 73855&version=1.0.)
16. Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing. On the state of the sanitary-epidemiological well-being of the population in the Russian Federation in 2017. State report. Available at: https://rospotrebnadzor. ru/documents/details.php?ELEMENT_ID=10145. Russian. (Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2017 году. Государственный доклад. Доступно по адресу: https://rospotrebnadzor.ru/documents/details. php?ELEMENT_ID=10145.)
17. Tartakovski I.S. Listeriae: the role in infectious diseases and laboratory diagnostics. Klinicheskaja mikrobiologija i antimikrobnaja himioterapija. 2000;2(2):20-30. Russian. (Тартаковский И.С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000;2(2):20-30.)
18. GOST 32031-2012 Food products. Methods for the detection of bacteria Listeria monocytogenes (as amended by ИУС N 6-2019). Available at: http://docs.cntd.ru/document/1200105310. Russian. (ГОСТ 32031-2012 Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes (с Поправкой ИУС N 6-2019). Доступно по адресу: http://docs.cntd.ru/ document/1200105310.)
19. Zaytseva E., Ermolaeva S., Somov G.P. Low genetic diversity and epidemiological significance of Listeria monocytogenes isolated from wild animals in the Far East of Russia. Infect Genet Evol. 2007;7(6):736-742. DOI: 10.1016/j.meegid.2007.07.006
20. Adgamov R., Zaytseva E., Thiberge J.M., Brisse S., Ermolaeva S. Genetically related Listeria monocytogenes strains isolated from lethal human cases and wild animals. In: Genetic Diversity in Microorganisms, Caliskan M. ed., 2012. Chapter 9. ISBN: 978953-51-0064-5.
21. Voronina O.L., Kunda M.S., Ryzhova N.N., Aksenova E.I., Semenov A.N., Kurnaeva M.A., et al. Regularities of the Ubiquitous Polyhostal Microorganisms Selection by the Example of Three Taxa. Molekuljarnaja biologija. 2015;49(3):430-441. Russian. (Воронина О.Л., Кунда М.С., Рыжова Н.Н. Аксенова Е.И., Семенов А.Н., Курнаева M.A. и соавт. Закономерности селекции полигостальных убиквитарных микроорганизмов на примере представителей трех таксонов. Молекулярная биология. 2015;49(3):430-441.) DOI: 10.7868/S0026898415030179
22. Psareva E.K., Egorova I.Y., Liskova E.A., Razheva I.V., Gladkova N.A., Sokolova E.V., et al. Retrospective Study of Listeria monocytogenes isolated in the territory of inner Eurasia from 1947 to 1999. Pathogens. 2019;8(4). pii: E184. DOI: 10.3390/pathogens8040184
23. Zaitseva E.A., Ermolaeva S.A., Somov G.P. Genes, encoding invasion factors in Listeria monocytogenes strains isolated in the European part and the far east of Russia. Zhurnal mikrobiologii, jepidemiologii i immunobiologii. 2006;(4):42-45. Russian. (Зайцева Е.А., Ермолаева С.А., Сомов Г.П. Гены, кодирующие факторы инвазии у штаммов Listeria monocytogenes, изолированных в европейской части и Дальневосточном регионе России. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006;(4):42-45.)
24. Voronina O.L., Ryzhova N.N., Kunda M.S., Kurnaeva M.A., Semenov A.N., Aksenova E.I., et al. Diversity and pathogenic potential of Listeria monocytogenes isolated from environmental sources in the Russian Federation. UMER. 2015;5(3):5-15.
25. Unified sanitary and epidemiological and hygienic requirements for products (goods) subject to sanitary and epidemiological surveillance (control) (as amended on May 21, 2019). Available at http://docs.cntd.ru/document/902249109. Russian. (Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к продукции (товарам), подлежащей санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) (с изменениями на 21 мая 2019 г.). Доступно по адресу: http://docs.cntd.ru/ document/902249109.)
26. Salcedo C., Arreaza L., Alcala B., de la Fuente L., Vázquez J.A. Development of a multilocus sequence typing method for analysis of Listeria monocytogenes clones. J Clin Microbiol. 2003;41(2):757-762. DOI: 10.1128/jcm.41.2.757-762.2003
27. Ragon M., Wirth T., Hollandt F., Lavenir R., Lecuit M., Le Monnier A., et al. A new perspective on Listeria monocytogenes evolution. PLoS Pathog. 2008;4(9):e1000146. DOI: 10.1371/ journal.ppat.1000146
28. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 2013;30(12):2725-2729. DOI: 10.1093/molbev/ mst197
29. Madeira F., Park Y.M., Lee J., Buso N., Gur T., Madhusoodanan N., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Res. 2019;47(W1):W636-W641. DOI: 10.1093/nar/gkz268
Воронина О.Л. и соавт.
30. Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Mol Biol Evol. 1993;10(3):512-526. DOI: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a040023
31. Nei M., Kumar S. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York: Oxford University Press; 2000. 348 p. ISBN: 9780195135855.
32. Posada D., Crandall K.A. MODELTEST: testing the model of DNA substitution. Bioinformatics. 1998;14(9):817-818. DOI: 10.1093/bioinformatics/14.9.817
33. Kremer P.H., Lees J.A., Koopmans M.M., Ferwerda B., Arends A.W., Feller M.M., et al. Benzalkonium tolerance genes and outcome in Listeria monocytogenes meningitis. Clin Microbiol Infect. 2017;23(4):265.e1-265.e7. DOI: 10.1016/j.cmi.2016.12.008
34. Chalenko Y., Kalinin E., Marchenkov V., Sysolyatina E., Surin A., Sobyanin K., et al. Phylogenetically Defined Isoforms of Listeria monocytogenes Invasion Factor InlB Differently Activate Intracellular Signaling Pathways and Interact with the Receptor gC1q-R. Int J Mol Sci. 2019;20(17). pii: E4138. DOI: 10.3390/ ijms20174138
35. Bonazzi M., Lecuit M., Cossart P. Listeria monocytogenes internalin and E-cadherin: from bench to bedside. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2009;1(4):a003087. DOI: 10.1101/ cshperspect.a003087
36. Rychli K., Wagner E.M., Ciolacu L., Zaiser A., Tasara T., Wagner M., et al. Comparative genomics of human and non-human Listeria monocytogenes sequence type 121 strains. PLoS One. 2017;12(5):e0176857. DOI: 10.1371/journal.pone.0176857
