CC BY
14
DOI: 10.17650/1726-9784-2021-22-2-66-77
CAG-полиморфизм гена андрогенового рецептора и сперматологические показатели у пациентов с патозооспермией с наличием или отсутствием микроделеций Y-хромосомы и у мужчин с нормозооспермией
Л.П. Меликян, Е.А. Близнец, М.И. Штаут, А.О. Седова, Т.М. Сорокина, Л.Ф. Курило, А.В. Поляков, В.Б. Черных
ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова»; Россия, 115522 Москва, ул. Москворечье, 1
Е га Е
Контакты: Вячеслав Борисович Черных chernykh@med-gen.ru
Введение. Влияние полиморфных вариантов гена андрогенового рецептора (ЛЙ) на сперматогенез и показатели семенной жидкости у мужчин с различным генотипом по другим локусам недостаточно изучено. Цель работы - исследование влияния (САв)п-полиморфизма гена ЛЙ на сперматологические параметры у мужчин с нарушением фертильности с наличием и отсутствием частичных делеций региона А2Рс У-хромосомы. Материалы и методы. В исследование были включены 988 неродственных российских пациентов с патозооспермией, из них 591 пациент без микроделеций У-хромосомы и 397 пациентов с частичными делециями региона А2Ре У-хромосомы. Контрольную группу составил 131 мужчина с нормозооспермией. Всем мужчинам, участвовавшим в исследовании, был выполнен спермиологический анализ и проведено генетическое исследование. Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической венозной крови и эякулята. Анализ полиморфизма (вАв)п-повтора в экзоне 1 гена ЛЙ выполняли с помощью полимеразной цепной реакции методом полиморфизма длин амплифицированных фрагментов.
Результаты. Сформированы 3 группы: пациенты с патозооспермией с наличием (п = 32) и отсутствием (п = 451) микроделеций У-хромосомы и мужчины с нормозооспермией (контроль, п = 131). Медиана и квартили количества САв-повторов в группах составили 22 и 20-25 соответственно. По числу тринуклеотидных повторов гена ЛЙ все пациенты были разделены на подгруппы: носители коротких ((САв)п <18), средних ((САв)п = 19-25) и длинных ((САв)п >26) аллелей. Средние аллели преобладали во всех группах, у мужчин без А2Ре-делеций и с микроделециями их частота составила 79,3 и 81,4 % соответственно, в контрольной группе - 81,7 %. Заключение. Не выявлено корреляции сперматологических показателей (концентрации и общего количества сперматозоидов, количества живых, прогрессивно подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов) с числом тринуклеотидных повторов. Обнаружены статистически значимые различия (р <0,045) по концентрации и общему количеству, количеству живых, прогрессивно подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов между мужчинами с нормозооспермией (контроль) и пациентами с патозоо-спермией с наличием и отсутствием микроделеций У-хромосомы в подгруппах носителей коротких, средних и длинных аллелей.
Ключевые слова: андрогеновый рецептор, мужское бесплодие, патозооспермия, сперматогенез, тринуклео-тидные повторы, фертильность
Для цитирования: Меликян Л.П., Близнец Е.А., Штаут М.И. и др. САв-полиморфизм гена андрогенового рецептора и сперматологические показатели у пациентов с патозооспермией с наличием или отсутствием микроделеций У-хромосомы, и у мужчин с нормозооспермией. Андрология и генитальная хирургия 2021;22(2):66-77. РО!: 10.17650/1726-9784-2021-22-2-66-77.
BY 4.0
CAG polymorphism of the Androgen Receptor gene and semen parameters in pathozoospermic patients with and without Y chromosome microdeletions, and in normozoospermic men
L.P. Melikyan, E.A. Bliznetz, M.I. Shtaut, A.O. Sedova, T.M. Sorokina, L.F. Kurilo, A.V. Polyakov, V.B. Chernykh
N.P. Bochkov Research Centre for Medical Genetics; 1 Moskvorech'e St., Moscow 115522, Russia
Contacts: Vyacheslav Borisovich Chernykh chernykh@med-gen.ru
Introduction. The effect of polymorphic variants of the androgen receptor gene (AR) on spermatogenesis and semen parameters in men with different genotypes for other loci has not been sufficiently studied. The aim of this work was to study the effect of the (CAG)n polymorphism of the AR gene on semen parameters in men with impaired fertility, with and without partial deletions of the AZFc region from the Y chromosome. Materials and methods. The study included 988 unrelated Russian patients with pathozoospermia, including 591 patients without Y chromosome microdeletions and 397 patients with partial deletions of the AZFc region of the Y chromosome. The control group consisted of 131 normozoospermic men. All men who participated in the study underwent semen analysis and genetic testing. Genomic DNA was isolated from peripheral venous blood lymphocytes and ejaculate. The analysis of the polymorphism of (GAG)n repeat in exon 1 of the AR gene was performed using a polymerase chain reaction by the amplified fragment length polymorphism method.
Results. Three groups were studied: patients with pathozoospermia with (n = 32) and without (n = 541) Y chromosome microdeletions, and normozoospermic men (control, n = 131). The median and quartiles of the number of CAG repeats in the groups were 22 and 20-25, respectively. According to the number of trinucleotide repeats of the AR gene, all patients were divided into subgroups: carriers of short ((GAG)n <18), medium ((GAG)n = 19-25) and long ((GAG)n >26) alleles. Medium alleles prevailed in all groups; in men without AZFc deletions and with microdeletions, their frequency was 79.3 and 81.4 %, respectively, in controls - 81.7 %.
Conclusion. No correlation was found in examined cohort for semen parameters (sperm concentration and total number, number of live, progressively motile and morphologically normal spermatozoa) from the number of trinucleotide repeats. However, a statistically significant difference (p <0.045; FDR correction) was found in concentration and total number, number of live, progressively motile and morphologically normal spermatozoa when comparing men with nomrozoospermia (control) with patients with pathozoospermia with and without partial AZFc deletions in subgroups of carriers of short, medium and long alleles.
Key words: androgen receptor, male infertility, pathozoospermia, spermatogenesis, trinucleotide repeats, male fertility
For citatation: Melikyan L.P., Bliznetz E.A., Shtaut M.I. et al. CAG polymorphism of the Androgen Receptor gene and semen parameters in pathozoospermic patients with and without Y chromosome microdeletions, and in normozoospermic men. Andrologiya i genital'naya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2021;22(2):66-77. (In Russ.). DOI: 10.17650/1726-9784-2021 -22-2-66-77.
Введение
Нарушение фертильности отмечают у 7 % мужчин репродуктивного возраста из общей популяции. Генетические факторы, связанные с нарушением фертильности, выявляют у 15—30 % мужчин с бесплодием, обусловленным тяжелыми формами патозооспермии [1, 2]. Однако их вклад в этиологию и патогенез нарушений репродукции остается недостаточно изученным.
Одними из значимых гормональных факторов, влияющих на сперматогенез, являются андрогены. Чувствительность к мужским половым гормонам зависит от количества и функциональной активности рецепторов к андрогенам, регулирующим экспрессию соответствующих генов-мишеней. Андрогеновый рецептор (АР) опосредует действие андрогенов, определяющее половую дифференцировку и формирование по мужскому типу, развитие мужских половых органов и маскулинизацию, инициацию и созревание мужских
половых клеток, в значительной мере влияя на сперматогенез и мужскую фертильность [3—5].
Рецептор андрогенов кодируется геном AR/HUMARA, расположенным в локусе Xq12, принадлежит к суперсемейству стероидных ядерных рецепторов, и состоит из 4 основных функциональных доменов [6]. Дефекты взаимодействия АР с андрогенами, транспортировки комплекса АР—андроген в ядро и дальнейших этапов реализации внутриклеточной регуляции могут привести к аномалиям формирования пола, нарушению сперматогенеза и мужскому бесплодию [2—5]. Кроме патогенных вариантов (мутаций) гена AR на функцию АР могут оказывать влияние полиморфные варианты в данном гене и другие генетические факторы. Одним из них является полиморфный локус в экзоне 1 гена AR, содержащий различное количество (от 5 до 70) тринуклеотидных CAG-повторов. Данный участок кодирует в белке АР полиглутаминовый тракт, длина которого у здоровых
Е га Е
Е га Е
индивидуумов, как правило, не превышает 40 повторов [7, 8]. Короткие и длинные по CAG-полиморфизму аллельные варианты гена AR ассоциированы с мужским бесплодием. Их повышенную частоту отмечают у мужчин с нарушением фертильности, связанным с пато-зооспермией [3, 4, 7—14].
Микроделеции Y-хромосомы в локусе AZF (azoospermia factor, фактор азооспермии) являются одними из частых генетических причин или факторов нарушения мужской фертильности [15—17]. Частичные (неполные) делеции региона AZFc (например, такие как делеции b2/b3, b1/b3 и gr/gr) являются микроделеционными полиморфизмами (вариантами числа копий — CNV), которые могут быть «нейтральными» или оказывать некоторое негативное влияние на сперматогенез и мужскую фер-тильность в зависимости от наличия других патогенных генетических и негенетических факторов, связанных с нарушением репродуктивной функции у мужчин [18—20]. У пациентов с данными типами микроделеций Y-хромосомы отмечают различные сперматологиче-ские диагнозы — от нормозооспермии до азооспермии [20—22]. На сегодняшний день известно множество генов, связанных с мужским бесплодием [1, 2], однако модифицирующее влияние генетического фона (генотипа) на эффекты микроделеций Y-хромосомы, различных генных вариантов и сперматологические показатели недостаточно исследовано.
Цель работы — исследование CAG-полиморфизма гена AR и его влияния на сперматологические показатели у мужчин с нормозооспермией и патозоосперми-ей с наличием и отсутствием частичных делеций региона AZFc Y-хромосомы.
Материалы и методы
В группу пациентов с нарушением фертильности отобраны 988 неродственных российских пациентов с патозооспермией, из них 591 пациент без микроделеций Y-хромосомы и 397 пациентов с частичными делециями региона AZFc Y-хромосомы. Критерием включения в выборку являлось бесплодие в браке, связанное с патозооспермией неясного генеза. Все обследованные мужчины были репродуктивного возраста, большинство являлось русскими по национальности. Пациентов с установленными генетическими причинами бесплодия, в том числе аномалиями кариотипа, клинически значимыми микроделециями Y-хромосо-мы, муковисцидозом и синдромом CBAVD, а также с негенетическими причинами бесплодия (вазэктомия, орхит/эпидидимит, травмы половых органов и др.) не включали в исследование. Контрольную группу составил 131 неродственный соматически здоровый российский мужчина с нормозооспермией.
Исследование одобрено этическим комитетом при ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова». От каждого пациента получено
письменное добровольное информированное согласие на участие в исследовании.
Всем мужчинам, участвовавшим в исследовании, выполняли спермиологический анализ согласно рекомендациям руководства Всемирной организации здравоохранения по исследованию эякулята (ВОЗ, 2010) [23].
Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической венозной крови и эякулята с помощью набора реактивов Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, США) по протоколу производителя. Анализ полиморфизма (GAG)n-повтора в экзоне 1 гена AR выполняли с помощью полимеразной цепной реакции методом ПДАФ (полиморфизм длин амплифицированных фрагментов) в соответствии с утвержденной и апробированной медицинской технологией ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова» [24].
Статистический анализ данных проводили, используя различные статистические методы: критерии Манна— Уитни, Колмогорова—Смирнова, Спирмена и поправку на множественное сравнение Бенджамини—Хохберга (false discovery rate, FDR), с помощью компьютерных программ Statistica, версия 10 (Dell Inc., США) и GraphPad Prism, версия 7 (GraphPad Software Inc., США). Пациентов с азооспермией не включали в группу пациентов с патозооспермией при расчете качественных показателей сперматозоидов (количества живых, подвижных и морфологически нормальных гамет). Наличие статистически значимых различий между группами и подгруппами определяли при значениир <0,05.
Результаты
По результатам сперматологического и генетического исследования сформированы 3 группы: пациенты c нарушением фертильности с патозооспермией без микроделеций Y-хромосомы (n = 451), пациенты с патозооспермией и частичными делециями региона AZFc Y-хромосомы (n = 32) и мужчины с нормозоо-спермией (контроль, n = 131) (табл. 1).
Количество CAG-повторов в общей выборке мужчин с патозооспермией, в которую входили как пациенты без микроделеций, так и с микроделециями Y-хромосомы, варьировало от 7 до 37 и от 14 до 32 соответственно, в контроле — от 18 до 31 (рис. 1, см. табл. 1). Распределение количества повторов в исследуемой выборке пациентов не относилось к нормальному, поэтому среднее значение в группах представлено медианой (Me), а стандартное отклонение — в виде квартилей (25—75 %) (см. рис. 1). Так как выборка не относилась к нормальному распределению, для статистического анализа выборки использовали критерий Манна—Уитни, для обнаружения статистически значимых различий при количестве значений вероятности p более 8 использовали поправку на множественное сравнение Бенджамини—Хохберга (FDR).
Медиана и квартили количества тринуклеотид-ных повторов в группах не отличались и составляли
Таблица 1. Количество CAG-повторов в экзоне 1 гена AR у российских мужчин с нормозооспермией и патозооспермией с наличием и отсутствием частичных делеций региона AZFс Y-хромосомы
Table 1. The number of CAG repeats in exon 1 of the AR gene in normozoospermic andpathozoospermic Russian men with and without of partial deletions of the AZF region of the Y chromosome
Группа, подгруппа пациентов
Group, subgroups of patients
Мужчины с нормозооспермией (контроль, n = 131) Normozoospermic men (control, n = 131)
Количество CAG-пов-
торов (min—max)
18-31
Медиана, Me (квартили 25-75 %)
Встречаемость CAG-аллелей гена AR, n (%)
Occurrence of CAG alleles of the AR gene, n (%)
Короткие (CAG)n <18
Средние (CAG)n = 19-25
Длинные (CAG)n >26
Аллель (CAG)n = 25
22 (21-24)
3 (2,3)
107 (81,7)
21 (16,0)
11 (8,4)
Пациенты с патозооспермией без ми-кроделеций Y-хромосомы (n = 451) Pathozoospermic patients without Y chromosome microdeletions (n = 451)
7-37
22 (20-24)
50 (8,5)
469 (79,3)
72 (12,2) 51 (8,6)
Пациенты с патозооспермией с частичными делециями региона AZFc (n = 397)
Pathozoospermic patients with partial deletions of the AZFc region (n = 397)
22
14-32 (20-24) 37 (^3)
323 (81,4)
37 (9,3) 50 (12,6)
Пациенты с патозооспермией с делецией b2/b3 (n = 276) Pathozoospermic patients with b2/b3 deletion (n = 276)
22
14-32 (20-24) 24 (8,7>
231 (83,7)
21 (7,6)
30 (10,9)
Пациенты с патозооспермией с делецией gr/gr (n = 111) Pathozoospermic patients with gr/gr deletion (n = 111)
22
15-32 (20-25) 12 (10,8)
84 (75,7)
15 (13,5) 18 (16,2)
22 и 20—25 соответственно. Согласно количеству CAG-повторов все обследованные разделены на подгруппы, имеющие короткие ((CAG)n <18), средние ((CAG)n = 19—25) и длинные ((CAG)n >26) варианты полиглута-минового тракта. Аллели с количеством CAG-повторов от 19 до 25 преобладали во всех группах: у мужчин без микроделеций (79,3 %) и пациентов с микроделе-циями Y-хромосомы (81,4 %), а также в контрольной группе — у мужчин с нормозооспермией (81,7 %). Короткие CAG-аллели обнаружены у мужчин с патозооспермией, как с наличием, так и с отсутствием частичных делеций региона AZFc — 8,5 и 10,8 % соответственно, в группе контроля отмечены значительно реже — 2,3 %. Длинные CAG-аллели несколько чаще встречали в контрольной группе (16,0 %), чем в группе с патозооспермией без микроделеций Y-хромосомы (12,2 %) и в группе с патозооспермией и делецией gr/gr (13,5 %). В общей группе с патозооспермией и частичными делециями AZFc и в группе с патозооспермией и делецией Ь2/Ь3 длинные аллели встречали реже — 9,3 и 7,6 % соответственно (см. табл. 1).
В группе мужчин с частичными AZFc-делециями выявлена более высокая частота аллеля (CAG)n = 25 (12,6 %) по сравнению с пациентами с патозооспермией без микроделеций Y-хромосомы (8,6 %) и с группой контроля — мужчинами с нормозооспермией (8,4 %). Среди мужчин с патозооспермией и наличием делеции gr/gr частота данного аллельного варианта гена AR составила 16,2 %, а у мужчин с делецией b2/b3 — 10,9 % (см. табл. 1, см. рис. 1).
При сравнении сперматологических показателей у пациентов с патозооспермией и мужчин с нормозоо-спермией с использованием ^-критерия Манна—Уитни и поправки на множественное сравнение (FDR) выявлено статистически значимое (р <0,003—0,045) различие между группами с наличием и отсутствием микроделе-ций Y-хромосомы. Среди носителей коротких CAG-ал-лелей при сравнении пациентов с патозооспермией без микроделеций Y-хромосомы и с их наличием выявлено статистически значимое различие по количеству (в процентах) прогрессивно подвижных (p = 0,0006) и морфологически нормальных сперматозоидов (p = 0,008). Среди
Е га Е
70
S -a
60
50
; й= S 40
30
g 20
70
60
-.850
й40
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Число CAG-повторов в экзоне 1 гена AR / The number of CAG repeats in exon 1 of the AR gene
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Число CAG-повторов в экзоне 1 гена AR / The number of CAG repeats in exon 1 of the AR gene
в
1 §•£
2,7 %
0,9 % 0,9 %
, 1 ,
i4 15 16 17
Число CAG-повторов в экзоне 1 гена AR / The number of CAG repeats in exon 1 of the AR gene
Рис. 1. Распределение CAG-аллелей в экзоне 1 гена AR по частоте встречаемости у российских мужчин с частичными делециями региона AZFc Y-хромосомы: а — выборка пациентов с частичными AZFc-делециями (n = 397); б — группа пациентов с делецией b2/b3 (n = 276); в — группа пациентов с делецией gr/gr (n = 111)
Fig. 1. Distribution of frequency of CAG alleles in exon 1 of the AR gene in Russian men with partial deletion of the AZFc region of Y chromosome: a — a sample ofpatients with partial AZFc deletions (n = 397); б — a group ofpatients with b2/b3 deletion (n = 276); в — group ofpatients with gr/gr deletion (n = 111)
б
а
s-§ë30
10
10
0
0
E га E
носителей средних по числу CAG-повторов обнаружено статистически значимое (p <0,0001) различие между данными группами по всем анализированным сперматоло-гическим показателям (концентрации и общему количеству сперматозоидов, количеству живых, прогрессивно подвижных и морфологически нормальных гамет). Среди носителей длинных CAG-аллелей обнаружено статистически значимое различие между данными группами по концентрации и общему количеству, количеству живых, прогрессивно подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов — p <0,0001 и p = 0,0004 соответственно (табл. 2, 3).
При сравнении носителей коротких CAG-аллелей из групп с патозооспермией, имеющих частичные AZFc-делеции, и контрольной группы выявлено статистически значимое (p = 0,03) различие по количеству
прогрессивно подвижных сперматозоидов; среди носителей средних CAG-повторов выявлено статистически значимое (р <0,0001) различие по концентрации и общему количеству, количеству живых, прогрессивно подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов; среди носителей длинных CAG-аллелей выявлено статистически значимое (р = 0,01) различие по концентрации сперматозоидов, общему количеству сперматозоидов в эякуляте (р = 0,02), доле живых сперматозоидов (р = 0,007) и прогрессивно подвижных гамет (р = 0,002) (см. табл. 2, 3).
С помощью критерия Спирмена проводили оценку корреляции сперматологических показателей с числом повторов в исследуемых группах, применив поправку Бенджамини—Хохберга. Однако статистически значимой корреляции (г>0,3) прир <0,05 не выявлено (табл. 4, 5).
Таблица 2. Статистическая значимость различий (р) при сравнении сперматологических показателей между группами с нормозооспермией и патозооспермией с частичными делециями и без делеций региона AZFс, имеющих различные CAG-аллели
Table 2. Statistical significance of differences (p) when comparing semen parameters in groups with normozoospermia and pathozoospermia with partial deletions and without deletions of the AZFc region having different CAG alleles
Normozoospermic group (control, n = 131)
Группа с нарушением фертильности Варианты (CAG)n-аллеля* Variants of (CAG)n allele* Концентрация сперматозоидов в 1 мл эякулята Sperm count per 1 ml of ejaculate Общее количество сперматозоидов в эякуляте Total sperm count Количество живых Количество прогрессивно Количество морфологически нормальных сперма-
Group of infertile patients сперматозоидов подвижных
Пациенты с патозооспермией без частичных делеций AZFс (n = 451) Pathozoospermic patients without partial AZFc deletions (n = 451) Короткие: (CAG)n <18 Short: (CAG)n <18 (38/451; 3/131) 0,04 0,06 0,1 0,0006 0,008
Средние: (CAG)n = 19-25 Medium: (CAG)n = 19-25 (356/451; 107/131) <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001
Длинные: (CAG)n >26 Long: (CAG)n >26 (57/451; 21/131) <0,0001 <0,0001 0,0004 <0,0001 <0,0001
Пациенты с патозоо-спермией с частичными делециями AZFc (n = 32) Pathozoospermic patients with partial AZFc deletions (n = 32) Короткие: (CAG)n <18 Short: (CAG)n <18 (5/32; 3/131) 0,2 0,3 0,3 0,03 0,05
Средние: (CAG)n = 19-25 Medium: (CAG)n = 19-25 (24/32; 107/131) <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001
Длинные: (CAG)n >26 Long: (CAG)n >26 (3/32; 21/131) 0,01 0,02 0,007 0,002 0,09
*В скобках указано: в числителе — число носителей коротких, средних и длинных аллелей в каждой из сравниваемых групп, в знаменателе — общее число человек в данной группе.
*In parentheses, the numerator indicates the number of carriers of short, medium and long alleles in each of the compared groups, in the denominator — the total number of people in this group.
I
Таблица 3. Распределение значимых различий с помощью поправки Бенджамини—Хохберга (FDR) при расчете U-критерия Манна—Уитни Table 3. Distribution of significant differences using the Benjamini—Hochberg correction (FDR) when calculating the Mann—Whitney U-test
FDR, р Сравнение групп с патозооспермией без частичных делеций региона AZFс и нормозооспермией, р Сравнение групп с патозооспермией с частичными делециями региона AZFс и нормозооспермией, р
Comparison of groups with pathozoospermia without partial AZFc deletions and normozoospermia, p Comparison of groups with pathozoospermia with partial AZFc deletions and normozoospermia, p
0,003 <0,0001 <0,0001
0,006 <0,0001 <0,0001
0,009 <0,0001 <0,0001
0,012 <0,0001 <0,0001
0,015 <0,0001 <0,0001
0,018 <0,0001 0,002
0,021 <0,0001 0,007
E
W
E
Окончание табл. 3 End of table 3
FDR, р Сравнение групп с патозооспермией без частичных делеций региона AZFс и нормозооспермией, р Сравнение групп с патозооспермией с частичными делециями региона AZFс и нормозооспермией, р
Comparison of groups with pathozoospermia without partial AZFc deletions and normozoospermia, p Comparison of groups with pathozoospermia with partial AZFc deletions and normozoospermia, p
0,024 <0,0001 0,01
0,027 <0,0001 0,02
0,030 0,0004 0,03
0,033 0,0006 0,05
0,036 0,008 0,09
0,039 0,04 0,3
0,042 0,06 0,3
0,045 0,1 0,2
Примечание. Полужирным шрифтом выделены значения, указывающие на статистически значимое различие между сравниваемыми группами. Здесь и в табл. 5: FDR — false discovery rate (частота ложноположительныхрезультатов). Note. The values indicating a statistically significant difference between the compared groups are highlighted in bold. Here and in table 5: FDR — false discovery rate.
I
Таблица 4. Статистическая значимость различий (p) и коэффициент корреляции Спирмена (r) при сравнении сперматологических показателей у носителей разньа CAG-аллелей между различными группами
Table 4. Statistical significance of differences (p) and Spearman correlation coefficient (r) when comparing semen parameters in carriers of different CAG alleles between different groups
Group
Варианты (САС)п-аллеля
Концентрация сперматозоидов в 1 мл эякулята
Общее количество сперматозоидов в эякуляте
Total sperm coun
Количество живых сперматозоидов
Количество прогрессивно подвижных сперматозоидов
Progressively motile sperm
Количество морфологически нормальных спермато-
Мужчины с нормозооспермией (контроль, n = 131) Normozoospermie men (control, n = 131) Короткие: (CAG)n <18 Short: (CAG)n <18 (n = 3) - - - - -
к •a Средние: (CAG)n = 19-25 Medium: (CAG)n = 19-25 (n = 107) p = r = = 0,8 -0,02 p r = = 0,5 -0,06 p r = = 0,8 -0,03 p r = = 0,1 = -0,1 p r = 0,2 = 0,1
E ra E u Длинные: (CAG)n >26 Long: (CAG)n >26 (n = 21) p = r = = 0,4 -0,2 p r = = 0,4 -0,2 p r = 0,6 = 0,1 p r = = 0,3 = -0,2 p = r = 0,06 = 0,4
к ra M Пациенты с патозооспермией без частичных делеций AZFс (n = 451) Pathozoospermic patients without partial Короткие: (CAG)n <18 Short: (CAG)n <18 (n = 38) p = r = = 0,7 0,06 p r = = 0,8 0,05) p r = 0,2 = 0,2 p r = = 0,9 0,007 p r = = 0,9 = 0,03
Ч ra ^ Средние: (CAG)n = 19-25 Medium: (CAG)n = 19-25 (n = 356) p = r = = 0,1 0,09 p r = = 0,1 0,08) p r = = 0,7 = 0,02 p = r = 0,01 = 0,1 p r = = 0,2 = 0,07
s AZFc deletions (n = 451) Длинные: (CAG)n >26 Long: (CAG)n >26 (n = 57) p = r = = 0,1 -0,2 p r = = 0,3 = -0,1 p r = = 0,6 -0,06 p r = = 0,3 = -0,1 p r = = 0,4 = -0,1
Окончание табл. 4 End of table 4
Группа Group Варианты (CAG)n-аллеля Variants of the Концентрация сперматозоидов в 1 мл эякулята per 1 ml of ejaculate Общее количество сперматозоидов в эякуляте Количество живых сперматозоидов Количество прогрессивно подвижных сперматозоидов Количество морфологически нормальных сперматозоидов
Total sperm count Progressively motile sperm Morphologically normal sperm
Пациенты с пато-зооспермией с частичными делециями AZFc (n = 32) Pathozoospermic patients with partial Короткие: (CAG)n <18 p = 0,8 p = 0,8 p = 0,6 p = 0,8 p >0,9 Short: (CAG)n <18 r = 0,4 r = 0,4 r = -0,5 r = 0,4 r = 0,0 (n = 5)
Средние: (CAG)n = 19-25 p = 0,6 p = 0,7 p = 0,2 p = 0,4 p = 0,03 r = 0,1 r = 0,1 r = -0,3 r = 0,2 r = 0,4 (CAG)n = 19-25 (n = 24)
AZFc deletions (n = 32) Длинные: (CAG)n >26 p >0,9 p >0,9 p >0,9 p = 0,3 p >0,9 Long: (CAG)n >26 r = 0,5 r = 0,5 r = 0,5 r = 1,0 r = 0,5 (n = 3)
Таблица 5. Значения FDR и уровни статистической значимости для групп мужчин с нормозооспермией (контроль) и пациентов с патозоосперми-ей без AZFc делеций и с частичными AZFc делециями, рассчитанные при помощи критерия Спирмена и поправки Бенджамини—Хохберга Table 5. FDR values and the significance levels for groups of normozoospermic men (control) and pathozoospermw patients without AZFc deletions and with partial AZFc deletions, calculated using the Spearman criterion and the Benjamini—Hochberg correction
Мужчины с нормозооспермией Пациенты с патозооспермией
Normozoospermic men Pathozoospermic patie nts
FDR, р р FDR, р Without partial AZFc deletions, p With partial AZFc deletions, p
G,GG5 G,GG6 G,GG3 G,G1 G,G3
G,G1 G,1 G,GG6 G,1 G,2
G,G15 G,2 G,GG9 G,1 G,3
G,G2 G,3 G,G12 G,1 G,4
G,G25 G,4 G,G15 G,2 G,6
G,G3 G,4 G,G18 G,2 G,6
G,G35 G,5 G,G21 G,3 G,7
G,G4 G,6 G,G24 G,3 G,8
G,G45 G,8 G,G27 G,4 G,8
G,G5 G,8 G,G3G G,6 G,8
- - G,G33 G,7 >G,9
- - G,G36 G,7 >G,9
- - G,G39 G,8 >G,9
- - G,G42 G,9 >G,9
- - G,G45 G,9 >G,9
E ra E
Обсуждение
В настоящей работе исследован CAG-полиморфный локус в экзоне 1 гена ЛЯ у российских мужчин с патозо-оспермией с наличием и отсутствием микроделеций Y-хромосомы в регионе AZFc и мужчин с нормозооспер-мией, а также влияние данных генетических факторов и их сочетания на сперматологические показатели. Влияние САй-полиморфизма гена ЛЯ на мужскую фертиль-ность и сперматогенез исследовано на различных выборках мужчин различных популяций и этнических групп [7—14]. Ряд авторов также указывают на повышенную частоту коротких и длинных аллельных вариантов по числу САй-повторов гена ЛЯ у пациентов с мужским бесплодием, связанным с патозооспермией, по сравнению со здоровыми (фертильными) мужчинами и мужчинами с нормозооспермией [10, 25—29].
Возможно, отдельные аллельные варианты гена ЛЯ (кроме полной мутации — количества САй-повторов 42 и более у пациентов с болезнью Кеннеди) также могут иметь выраженное негативное влияние на сперматогенез. Однако влияние отдельных САй-аллельных вариантов гена ЛЯ на сперматогенез, показатели эякулята и мужскую фертильность недостаточно исследовано. В данном исследовании тмечена более высокая частота аллеля с 25 тринуклеотидными повторами у мужчин с азооспермией и пациентов с нарушением фертильности с наличием делеции gr/gr. В некоторых исследованиях также выявлена повышенная частота данного аллеля гена ЛЯ в группе с патозооспермией, однако авторы не обратили на это внимание, возможно в связи с небольшим размером исследованных выборок [8, 30]. Ранее нами было отмечено различие по частоте аллеля (САй)п = 25 гена ЛЯ у пациентов с патозооспермией и мужчин с нормозооспермией [11, 14]. Частота данного аллеля наиболее высока у пациентов с азооспермией (18,1 %) и выше по сравнению с пациентами с нормозооспермией (8,4 %), а также с общей выборкой пациентов с патозооспермией (2,6—9,5 %). В исследованной нами выборке у пациентов с патозооспер-_а мией и наличием делеции gr/gr аллель (САй)п = 25 Е обнаружен также с повышенной по сравнению с контр-га олем частотой (16,2 %), что, возможно, обусловлено £ высокой долей пациентов с азооспермией среди носи" телей данных микроделеций Y-хромосомы. к Очевидно, что полиморфизм числа САй-повторов
я гена ЛЯ является только одним из многочисленных = генетических факторов, влияющих на сперматогенез и мужскую фертильность, однако его вклад в генети-га ческий контроль сперматогенеза и мужской фертиль-= ности в целом невелик. Влияние других генетических факторов на мужскую фертильность в их сочетании = с данным полиморфизмом исследовано в небольшом числе работ. Так, О. Ва^а и соавт. исследовали САй-в полиморфизм гена ЛЯ и микроделеции локуса AZF Y-хромосомы у мужчин с бесплодием и фертильных
мужчин [13]. Выборку составляли 142 пациента с не-обструктивной формой азооспермии, а контрольную группу — 145 мужчин с нормозооспермией. Среднее количество САй-повторов у мужчин с азооспермией и нормозооспермией статистически значимо не различалось. Микроделеции Y-хромосомы детектированы у 4,93 % пациентов с азооспермией и не обнаружены в контрольной группе. Авторы не выявили связи между длиной полиглутаминового тракта в АР и наличием азооспермии. Следует учесть, что авторы не исследовали частичные AZF-делеции, а только клинически значимые (полные) типы микроделеций Y-хромосомы, которые не встречаются у пациентов с нормозооспер-мией [15-17, 20, 22].
Н.Ю. Сафиной и соавт. исследованы различные генетические нарушения и факторы мужского бесплодия (хромосомные аномалии, микроделеции Y-хромо-сомы, в том числе частичные делеции региона AZFc, патогенные варианты гена С1ТЯ и САй-повторов гена ЛЯ), а также их влияние на выраженность патозооспермии у мужчин с бесплодием в браке [31]. Авторами исследована встречаемость сочетания (двух и более) генетических факторов нарушения мужской фертильности, в том числе длинных САй-аллелей гена ЛЯ и микроделеций Y-хромосомы. У 1 из 200 пациентов с патозо-оспермией обнаружено совместное наличие делеции Ь2/Ь3 и длинного аллеля гена ЛЯ ((САй)п = 30). Следует отметить, что авторы не оценивали влияние на спер-матологические показатели различных аллелей гена ЛЯ, в том числе в зависимости от наличия/отсутствия микроделеций Y-хромосомы.
Микроделеции длинного плеча Y-хромосомы, частично захватывающие регион AZFс (Ь1/Ь3, Ь2/Ь3, gr/gr и др.), приводят к потере части генов данной области. AZFc-регион имеет размер 3,5 млн пар нуклео-тидов и содержит 12 генов/транскрипционных единиц, включая БЛЖ, СБП, ВРУ2, аОШ421У, С8Р04Р1Уи ТТУ4 [16, 18-20]. Частичные делеции региона AZFc могут иметь различное влияние на сперматогенез, эффект которого варьирует от нормального количества сперматозоидов до их отсутствия, в отличие от полной делеции региона AZFc (делеции Ь2/Ь4), приводящей к необ-структивной азооспермии и олигозооспермии тяжелой степени [15, 16, 20-22]. Делеции Ь2/Ь3 и gr/gr являются наиболее распространенными типами частичных деле-ций региона AZFc, их частота у российских мужчин с бесплодием составляет 7,95 и 3,5 % соответственно [11]. Делеция Ь2/Ь3 характерна для ^гаплогруппы Y-хромосомы, встречающейся с более высокой частотой у мужчин северной части Евразии [19]. Вследствие мультикопийности генов региона AZFc потеря части их копий может не оказывать патогенного эффекта на сперматогенез и мужскую фертильность [16, 20]. Поэтому данные полиморфные микроделеционные варианты Y-хромосомы не являются патогенными,
несмотря на то что частичные делеции региона AZFc, в частности делеции Ь2/Ь3 и gr/gr, удаляют 1,8 и 1,6 млн пар нуклеотидов соответственно, т. е. около половины всех генов региона AZFc [21, 22]. Однако их наличие несколько увеличивает риск нарушения сперматогенеза и сперматологических показателей, в частности снижения общего количества сперматозоидов и доли прогрессивно подвижных сперматозоидов [21].
Заключение
Результаты данного исследования свидетельствуют о наличии повышенной частоты встречаемости коротких CAG-аллелей гена ЛЯ у пациентов с патозооспер-мией. Частота встречаемости коротких аллелей в группе с нарушением фертильности независимо от наличия или отсутствия в генотипе частичной делеции AZFc выше, чем в группе контроля (нормозооспермия). Полученные данные также свидетельствуют, что у мужчин с нарушением фертильности наличие некоторых CAG-аллелей гена ЛЯ сопровождается более выраженными
сперматологическими нарушениями как в отношении количественных, так и качественных показателей сперматозоидов. У мужчин с азооспермией, а также у пациентов с различными формами патозооспермии с наличием делеции gr/gr выявлена повышенная частота аллеля (CAG)n = 25 по сравнению с нормозоо-спермией и с общей выборкой с пациентов патозоо-спермией. Однако не обнаружено статистически значимой корреляции между количеством CAG-алле-лей и сперматологическими показателями как в группе без микроделеций, так и в группе с микроделеци-ями Y-хромосомы. Возможно, отсутствие корреляции связано с относительно небольшой выборкой сперма-тологически обследованных пациентов с наличием частичных делеций региона AZFc. Для оценки вклада CAGn-полиморфного локуса гена ЛЯ в фертильность необходимы дальнейшие исследования взаимодействия различных генетических факторов, вовлеченных в этиологию нарушения сперматогенеза и мужского бесплодия.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Krausz C., Riera-Escamilla A. Genetics of male infertility. Nat Rev Urol 2018;15(6):369-84.
DOI: 10.1038/s41585-018-0003-3.
2. Tahmasbpour E., Balasubramanian D., Agarwal A. A multifaceted approach to understanding male infertility: Gene mutations, molecular defects and assisted reproductive techniques (ART). J Assist Reprod Genet 2014;31(9):1115-37. DOI: 10.1007/s10815-014-0280-6.
3. Loy C.J., Yong E.L. Sex, infertility and the molecular biology of the androgen receptor. Curr Opin Obstet Gynecol 2001;13(3):315-21.
DOI: 10.1097/00001703-200106000-00012.
4. Yong E.L., Loy C.J., Sim K.S. Androgen receptor gene and male infertility. Hum Reprod Update 2003;9(1):1-7. DOI: 10.1093/humupd/dmg003.
5. Holdcraft R.W., Braun R.E. Androgen receptor function is required in Sertoli cells for the terminal differentiation of haploid spermatids. Development 2004;131(2):459-67.
DOI: 10.1242/dev.00957.
6. Hasani N., Meybodi A.M., Rafaee A. et al. Spermatogenesis disorder is associated with mutations in the ligand-binding domain of an androgen receptor. Andrologia 2019;51(10):e13376.
DOI: 10.1111/and.13376.
7. Lubahn D.B., Joseph D.R., Sar M. et al. The human androgen receptor: complementary deoxyribonucleic acid cloning, sequence analysis and gene expression in prostate. Mol Endocr
1988;2(12):1265-75.
DOI: 10.1210/mend-2-12-1265.
8. Tse J.Y.M., Liu V.W.S., Yeung W.S.B.
et al. Molecular analysis of the androgen receptor gene in Hong Kong Chinese infertile men. J Assist Reprod Genet 2003;20(6):227-33. DOI: 10.1023/a:1024107528283.
9. Milatiner D., Halle D., Huerta M. et al. Associations between androgen receptor CAG repeat length and sperm morphology. Hum Reprod 2004;19(6):1426-30.
DOI: 10.1093/humrep/deh251.
10. Nenonen H.A., Giwercman A., Hallengren E. et al. Non-linear association between androgen receptor CAG repeat length and risk of male subfertility a meta-analysis.
Int J Androl 2011;34(4):327-32. DOI: 10.1111/j.1365-2605.2010.01084.x.
11. Черных В.Б., Руднева С.А., Сорокина Т.М. и др. Влияние CAG-полиморфизма гена андрогенового рецептора (AR) на сперматогенез у мужчин с бесплодием. Андрология и гени-тальная хирургия 2015;16(4):55—61. [Chernykh V.B., Rudneva S.A., Sorokina T.M. An influence of androgen receptor (AR) gene CAG-polymorphism on spermatogenesis in infertile men. Andrologiya i genital'naya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2015;16(4):55-61. (In Russ.)].
DOI: 10.17650/2070-9781-2015-16-4-55-61.
12. Pan B., Li R., Chen Y. et al. Androgen receptor (AR)-CAG trinucleotide repeat
length and idiopathic male infertility: a case-control trial and a meta-analysis. Medicine (Baltimore) 2016;95(10):e2878. DOI: 10.1097/MD.0000000000002878.
13. Batiha O., Haifawi S., Al-Smadi M. et al. Molecular analysis of CAG repeat length of the androgen receptor gene and
Y chromosome microdeletions among Jordanian azoospermic infertile males. Andrologia 2018;50(4):e12979. DOI: 10.1111/and.12979.
14. Меликян Л.П., Близнец Е.А., Поляков А.В. и др. Полиморфизм CAG-повторов в экзоне 1 гена андрогенового рецептора у российских мужчин с нормозооспермией и патозоо-спермией. Генетика 2020;56(8):974-80. [Melikyan L.P., Bliznetz EA., Polyakov A.V. et al. Polymorphism of CAG repeats
in exon 1 of the androgen receptor gene in Russian men with various forms of pathozoospermia. Genetika = Russian Journal of Genetics 2020;56(8):974-80. (In Russ.)]. DOI: 10.31857/S001667582008010X.
15. Vogt P.H., Edelmann A., Kirsch S. et al. Human Y chromosome azoospermia factors (AZF) mapped to different subregions in Yq11. Hum Mol
Genet 1996;5(7):933-43. DOI: 10.1093/hmg/5.7.933.
16. Kuroda-Kawaguchi T., Skaletsky H., Brown L.G. et al. The AZFc region of the Y chromosome features massive palindromes and uniform recurrent deletions in infertile men. Nat Genet 2001;29(3):279-86. DOI: 10.1038/ng757.
E
W
E
17. Krausz C., Hoefsloot L., Simoni M. et al. EAA/EMQN best practice guidelines
for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions: state-of-the-art 2013. Andrology 2014;2(1):5-19. DOI: 10.1111/j.2047-2927.2013.00173.x.
18. Repping S., Skaletsky H., Brown L. et al. Polymorphism for a 1.6-Mb deletion
of the human Y chromosome persists through balance between recurrent mutation and haploid selection. Nat Genet 2003;35(3):247-51. DOI: 10.1038/ng1250.
19. Repping S., van Daalen S.K., Korver C.M. et al. A family of human
Y chromosomes has dispersed throughout northern Eurasia despite a 1.8-Mb deletion in the azoospermia factor c region. Genomics 2004;83(6):1046-52. DOI: 10.1016/j.ygeno.2003.12.018.
20. Navarro-Costa P., Gonjalves J., Plancha C.E. The AZFc region of the Y chromosome: at the crossroads between genetic diversity and male infertility. Hum Reprod Update 2010;16(5):525-42.
DOI: 10.1093/humupd/dmq005.
21. Rozen S.G., Marszalek J.D., Irenze K. et al. AZFc deletions and spermatogenic failure: a population-based survey
of 20,000 Y chromosomes.
Am J Hum Genet 2012;91(5):890-96.
DOI: 10.1016/j.ajhg.2012.09.003.
22. Черных В.Б., Руднева С.А., Сорокина Т.М. и др. Характеристика состояния сперматогенеза у мужчин с с бесплодием, имеющих различные типы делеций AZFc-региона. Андрология и генитальная хирургия 2014;15(2):48-57. [Characteristics
of spermatogenesis in infertile men with the AZFc region deletions. Andrologiya i genital'naya khirurgiya = Andrology
and Genital Surgery 2014;15(2): 48-57. (In Russ.)].
DOI: 10.17650/2070-9781-2014-2-48-57.
23. Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека.
5-е изд. Пер. с англ. Н.П. Макарова, научн. ред. Л.Ф. Курило. М.: Капитал Принт, 2012. 291с. [WHO instruction on studies and processing of human ejaculate. 5th edn. Transl. from English by N.P. Makarov, ed. by L.F. Kurilo. Moscow: Kapital Print, 2012. 291p. (In Russ.)].
24. Щагина О.А., Миронович О.Л., Забненкова В.В. и др. Экспансия CAG-повтора в экзоне 1 гена AR
у больных спинальной амиотрофией. Медицинская генетика 2017;16(9):31—6. [Shchagina O.A., Mironovich O.L., Zabnenkova V.V. et al. CAG expansion in exon 1 of the AR gene in Russian spinal atrophy patients. Meditsinskaya genetika = Medical Genetics 2017;16(9):31—6 (In Russ.)].
25. von Eckardstein S., Syska A., Gromoll J. et al. Inverse correlation between sperm concentration and number of androgen receptor CAG repeats in normal men.
J Clin Endocrinol Metab 2001;86(6):2585— 90. DOI: 10.1210/jcem.86.6.7608.
26. Komori S., Kasumi H., Kanazawa R. et al. CAG repeat length in the androgen receptor gene of infertile Japanese males with oligozoospermia. Mol Hum Reprod 1999;5(1):14—6.
DOI: 10.1093/molehr/5.1.14.
27. Mifsud A., Sim C.K., Boettger-Tong H. et al. Trinucleotide (CAG) repeat polymorphisms in the androgen receptor gene: molecular markers of risk for male infertility. Fertil Steril 2001;75(2):275—81. DOI: 10.1016/S0015-0282(00)01693-9.
28. Boroujeni P.B., Firouzi V., Moradi S.Z. et al. Study of trinucleotide expansions and expression of androgen receptor in infertile men with abnormal spermogram referred to Royan institute. Andrologia 2018;50(10):e13121.
DOI: 10.1111/and.13121.
29. Giagulli V.A, Carbone M.D., De Pergola G. et al. Could androgen receptor gene CAG tract polymorphism affect spermatogenesis in men with idiopathic infertility?
J Assist Reprod Genet 2014;31(6):689—97. DOI: 10.1007/s10815-014-0221-4.
30. Фесай О.А., Кравченко С.А., Тыркус М.Я. и др. CAG-полиморфизм гена андрогенового рецептора у мужчин с азооспермией и олигозооспер-мией из Украины. Цитология и генетика 2009;43(6):45—51. [Fesai O.A., Kravchenko S.A., Tyrkus M.Ya. et al. Androgen receptor CAG gene polymorphism among azoospermic and oli-gozoospermic men from Ukraine. Tsitologiya i genetika = Cytology
and Genetics 2009;43(6):45—51. (In Russ.)].
31. Сафина Н.Ю., Яманди Т.А., Черных В.Б. и др. Генетические факторы мужского бесплодия,
их сочетания и спермиологическая характеристика мужчин с нарушением фертильности. Андрология и гени-тальная хирургия 2018;19(2):40—51. [Safina N.Yu., Yamandi T.A., Chernykh V.B. Genetic factors of male infertility, their combinations and the sperma-tolo-gical characteristics of men with fertility failures. Andrologiya i genital'naya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2018;19(2):40—51. (In Russ.)].
DOI: 10.17650/2070-9781-2018-19-2-40-51.
Вклад авторов
Л.П. Меликян: формирование выборки пациентов, выполнение молекулярно-генетического исследования, сбор и анализ полученных £ данных; анализ научной литературы; написание текста рукописи;
я Е.А. Близнец: выполнение молекулярно-генетического исследования, анализ его результатов; £ М.И. Штаут: спермиологическое исследование, анализ данных; и А.О. Седова: спермиологическое исследование;
Т.М. Сорокина: клиническое обследование и отбор пациентов для исследования; и Л.Ф. Курило: анализ данных спермиологического исследования, редактирование текста рукописи;
я А.В. Поляков: разработка методики и руководство молекулярно-генетическим исследованием, редактирование текста рукописи; В.Б. Черных: разработка дизайна исследования, анализ научной литературы, написание и редактирование текста рукописи. Authors' contributions
4 L.P. Melikyan: forming a sample of patients, performing molecular genetic research, collecting and analyzing the data obtained; analyzing scientific я literature; writing the text of the manuscript;
= E.A. Bliznetz: performing a molecular genetic study, analyzing its results; = M.I. Shtaut: spermiological research, data analysis; "" A.O. Sedova: spermiological research;
T.M. Sorokina: clinical examination and selection of patients for research; L.F. Kurilo: analysis of spermiological research data, editing of the manuscript text; e A.V. Polyakov: development of methodology and guidance of molecular genetic research, editing of the text of the manuscript; V.B. Chernykh: development of research design, analysis of scientific literature, writing and editing of the manuscript text.
ORCID авторов / ORCID of authors
Л.П. Меликян / L.P. Melikyan: https://orcid.org/0000-0003-2029-9890 М.И. Штаут / M.I. Shtaut: https://orcid.org/0000-0002-0580-5575 А.О. Седова / A.O. Sedova: https://orcid.org/0000-0002-7032-0793 Т.М. Сорокина / T.M. Sorokina: https://orcid.org/0000-0002-4618-2466 Л.Ф. Курило / L.F. Kurilo: https://orcid.org/0000-0003-3603-4838
A.В. Поляков / A.V. Polyakov: https://orcid.org/0000-0002-0105-1833
B.Б. Черных / V.B. Chernykh: https://orcid.org/0000-0002-7615-8512
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства образования и науки России для ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова».
Finansing. The study was carried out within the framework of the state task of the Ministry of Education and Science of Russia for N.P. Bochkov Research Centre for Medical Genetics.
Информированное согласие. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Informed consent. All patients gave written informed consent to participate in the study.
E
W
E
Статья поступила: 21.03.2021. Принята к публикации: 03.06.2020. Article submitted: 21.03.2021. Accepted for publication: 03.06.2020.
