CC BY
106
АНДРОЛОГИЯ
И ГЕНИТАЛЬНАЯ ХИРУРГИЯ
Характеристика состояния сперматогенеза у мужчин с бесплодием, имеющих различные типы делеций AZFc-региона
В.Б. Черных, С.А. Руднева, Т.М. Сорокина, Л.В. Шилейко, Л.Ф. Курило, О.П. Рыжкова, А.Л. Чухрова, А.В. Поляков
ФГБУ«Медико-генетический научный центр» РАМН, Москва Контакты: Вячеслав Борисович Черных chernykh@med-gen.ru
Исследовано состояние сперматогенеза у 218 российских мужчин с бесплодием, имеющих различные делеции AZFc-региона У-хромосомы. Выявлено явное различие полных и частичных AZFc-делеций по структуре форм патозооспермии и концентрации сперматозоидов. Средние значения концентрации сперматозоидов для носителей делеций Ь2/Ь4, gr/gr и Ь2/Ь3 составили 0,37 ± 0,13; 12,2 ± 7,1 и 30,3 ± 5,3 млн/мл соответственно. Выраженное угнетение сперматогенеза, характеризующееся наличием секреторной азооспермии и олигозооспермии тяжелой степени, обнаружено у 93, 42 и 57 % мужчин с делециями Ь2/Ь4, Ь2/Ь3 и gr/gr соответственно. При количественном кариологическом анализе незрелых половых клеток из осадка эякулята выявлены признаки нарушения деления и созревания незрелых половых клеток: от частичного блока на допахитенных стадиях профазы Iмейоза и/или делений созревания вплоть до полного угнетения сперматогенеза. Более мягкие нарушения сперматогенеза, характеризующиеся наличием олигозооспермии среднетяжелой или легкой степени либо астенозооспермии и/или тератозооспермии, отмечены у 7; 20; 30 % и 0; 38; 10 % носителей делеций Ь2/Ь4, Ь2/Ь3 и gr/gr соответственно.
Ключевые слова: мужское бесплодие, сперматогенез, У-хромосома, локус AZF, микроделеции
Characteristics of spermatogenesis in infertile men with the AZFc region deletions
V.B. Chernykh, S.A. Rudneva, T.M. Sorokina, L.V. Shileyko, L.F. Kurilo, O.P. Ryzhkova, A.L. Chukhrova, A.V. Polyakov
Medical Genetics Research Centre, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Spermatogenetic defects were analyzed in the cohort of 218 russian infertile men with various AZFc region deletions of the Y chromosome. Clear differences were found in both the percentage of pathozoospermia forms and sperm concentration between infertile men with complete (b2/b4) and partial (b2/b3 and gr/gr) AZFc deletions. Sperm concentration in the carriers of b2/b4, gr/gr and b2/b3 deletions, were 0.37 ± 0.13, 12.2 ± 7.1 and 30.3 ± 5.3 mln/ml, respectively. Severe spermatogenesis defects were detected in 93, 42 and 57 % patients with b2/b4, b2/b3 and gr/gr deletions, respectively. Quantitative karyological analysis of immature germ cells from ejaculate sediment revealed from incomplete spermatogenesis arrest at prepachytene stages to complete spermatogenesis depletion. Moderate oli-gozoospemia and/or astheno-, teratozoospermia were found in 7; 20; 30 %; and 0; 38; 10 % of the carriers of b2/b4, b2/b3 and gr/gr deletions, respectively.
Key words: male infertility, spermatogenesis, Y chromosome, AZF locus, microdeletions
E
W
E
Введение
Сперматогенез представляет собой сложный многоэтапный процесс, который завершается образованием зрелых мужских половых клеток — сперматозоидов. Он контролируется и реализуется комплексным каскадом включений/выключений генов, которые запускают процесс пролиферации сперматогониев, инициации и завершения делений мейоза, а также дифференцировку сперматид в сперматозоиды (спер-миогенез). Различные хромосомные аномалии, а также мутации примерно 2—3 тыс. генов могут оказывать негативное влияние на различные этапы развития и созревания половых клеток, приводя к выраженному угнетению или блоку сперматогенеза, увеличению морфологических нарушений в гаметах, снижению
подвижности и других параметров фертильности сперматозоидов [1—3].
Одной из частых генетических причин нарушения сперматогенеза и бесплодия у мужчин являются делеции (утраты фрагмента) длинного плеча Y-хромосомы, захватывающие локус AZF (azoospermia factor, фактор азооспермии) [4—6]. Делеции в данном локусе могут быть полными, т. е. целиком удаляющими один, два или все три из трех его регионов (AZFа, AZFb и AZFc), и частичными, т. е. не полностью захватывающими какой-либо регион [5]. Практически все полные AZF-делеции являются мутациями de novo и приводят к мужскому бесплодию вследствие секреторной азооспермии или олигозооспермии тяжелой степени [5, 6]. При этом прослеживается довольно четкая зависи-
Рис. 1. Регион Л2Ре, его структура, гены и различные типы делеций. А — схематичное изображение У-хромосомы человека с указанием положения ее Л2¥-регионов. На выноске внизу более детально показан Л2¥с-регион и его палиндромы (Р1—3), ампликоны — протяженные повторы (показанные разноцветными стрелками) (В), гены этого региона (С), а также полные (Ъ2/Ъ4) (Б) и различные частичные Л2¥с-делеции (Е, ¥, О)
мость степени нарушения сперматогенеза от размера и локализации, т. е. от типа делеции [4—6]. Это имеет важное прогностическое значение в отношении возможности репродукции и получения сперматозоидов, пригодных для искусственного оплодотворения. У мужчин с отсутствием всего локуса Л/Б, например у 46,ХХ-мужчин, а также у пациентов с полными де-лециями Л/Ба, Л/БЬ или Л/БЬ+е обнаруживают тяжелые нарушения сперматогенеза вплоть до Сертоли-клеточного синдрома, что указывает на невозможность получения сперматозоидов [4—6]. Менее тяжелыми в отношении репродукции являются делеции, целиком захватывающие регион Л/Бе, которые составляют 75—80 % всех полных Л/Б-делеций [4—6].
Регион Л/Бе локализован в дистальной части эухроматина длинного плеча У-хромосомы и содержит несколько генов и генных семейств, представленных многими копиями, которые экспрессируются только или преимущественно в яичках (рис. 1) [6—8]. В этом участке У-хромосомы локализованы в среднем 4 копии гена БЛ2 (основной ген-кандидат на «фактор азооспермии» в регионе Л/Бе), а также копии ЯВМ, СБУ и других генов [7, 8]. В регионе Л/Бе располагаются 3 из 8 крупных инвертированных повторяющихся участков У-хро-мосомы (палиндромы Р1, Р2 и Р3), первый из которых является наиболее протяженным из известных палиндромов в геноме человека и содержит ряд ампликонов (менее крупных повторяющихся участков), рекомбинация между которыми может приводить к образованию делеций, дупликаций или инверсий [7—10]. Описано большое число различных типов частичных Л/Бе-деле-ций ^г^г, Ь1/Ь3, Ь2/Ь3, Ь3/Ь4 и др.), а также их подти-
пов [9—15]. В отличие от полных, частичные Л/Б-деле-ции характеризуются различной степенью влияния на сперматогенез и фертильность — от азооспермии до нор-мозооспермии [5, 10, 14—19]. Патогенетическая и клиническая значимость влияния частичных Л/Бе-делеций и других перестроек У-хромосомы на репродуктивную функцию у мужчин является одной из наиболее актуальных и активно исследующихся областей в молекулярной андрологии, которая, однако, остается фрагментарно изученной. Поэтому целью нашего исследования являлось изучение состояния сперматогенеза у мужчин с бесплодием, имеющих различные типы делеций региона Л/Бе У-хромосомы.
Материалы и методы
Частота и спектр делеционных перестроек длинного плеча У-хромосомы изучены в ходе крупнокогор-тного исследования, включавшего 6 тыс. российских мужчин, обратившихся для медико-генетического обследования и консультирования в МГНЦ РАМН по поводу бесплодия в браке. Генетическое обследование включало клинико-генетическое, цитогенетичес-кое (анализ кариотипа) и молекулярно-генетическое исследование (молекулярный анализ на наличие полных и частичных делеций Л/Б-региона).
Для обнаружения микроделеций У-хромосомы применяли мультиплексную полимеразную цепную реакцию (мПЦР) согласно рекомендациям общепринятого руководства [20] с использованием диагностического набора «Л/Б» (Центр молекулярной генетики, Москва). Детекцию полных Л/Б-делеций проводили, анализируя наличие следующих локусов длинного плеча У-хромо-
т а т
Е га Е
сомы: sY84 (AZFa), sY615 (AZFa), sY86 (AZFa), sY134 (AZFb), sY127 (AZFb), sY254 (AZFc), sY255 (AZFc). Для поиска частичных делеций региона AZFc с использованием мПЦР исследовали следующие Y-специфич-ные локусы: sY1291, sY1192, sY1197, sY1206, sY1125 и sY142. Детально методика анализа микроделеций Y-хромосомы была описана нами ранее [4].
По результатам ДНК-исследования была отобрана группа из 218 пациентов, имеющих различные типы AZFc-делеций. Возраст обследованных мужчин варьировал от 20 до 67 лет. Критериями отбора для дальнейшего обследования являлись:
1) наличие полной или частичной делеции региона AZFc Y-хромосомы;
2) отсутствие аномалий кариотипа, пороков развития половой системы, непроходимости семявынося-щих протоков и других явных причин мужского бесплодия.
Дальнейшее обследование отобранной группы пациентов включало стандартное спермиологическое исследование и количественный кариологический анализ (ККА) незрелых половых клеток (НПК) из осадка эякулята.
Спермиологический анализ эякулята выполняли по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ (2010) [21]. Оценивали объем эякулята, цвет, консистенцию, рН, концентрацию сперматозоидов и их общее количество, степень подвижности, также проводили количественный анализ патологических форм сперматозоидов.
ККА состава НПК по стадиям их развития проводили по методу, предложенному проф. Л.Ф. Курило и принятому в лаборатории генетики нарушений репродукции МГНЦ РАМН (патент на изобретение № 2328736 от 01.02.2007) [22]. Анализ включает в себя дифференцирование клеток сперматогенного эпителия по стадиям их развития: сперматогонии (общий пул), сперматоциты I на стадиях предпахитены (пре-лептотены, лептотены, зиготены), пахитены, диплоте-ны профазы I мейоза, метафазы, анафазы и телофазы I мейоза, сперматоциты II на стадиях метафазы, анафазы и телофазы II мейоза, сперматиды (в процентах относительно общего числа подсчитанных НПК) и сперматозоиды (в процентах от общего числа всех подсчитанных половых клеток).
Для анализа полученных данных использовали методы описательной статистики. Для описания всего массива данных производили расчет средних величин и стандартных отклонений. Математическую обработку результатов проводили с использованием программного продукта Microsoft Office Excel 2007.
Результаты
Делеции длинного плеча Y-хромосомы, располагающиеся в регионе AZFc, обнаружены у 16 % обсле-
дованных мужчин с бесплодием. Частота полных (b2/b4) и частичных делеций AZFc-региона составила 3,9 и 12,1 % соответственно. Наиболее частыми среди частичных являлись делеции b2/b3 (7,9 %) и gr/gr (3,5 %). Редкие частичные делеции региона AZFc обнаружены у 0,7 % пациентов.
Согласно указанным выше критериям нами была отобрана группа из 218 мужчин для комплексного спермиологического обследования. Численное распределение носителей различных типов делеций AZFc-региона в данной выборке в целом отражало структуру микроделеций данного участка Y-хромосо-мы у российских мужчин с бесплодием. Среди них также преобладали 3 типа делеций: полная (b2/b4) и частичные (b2/b3 и gr/gr), занимая соответственно 2-е, 1-е и 3-е место по частоте встречаемости. Число (доля) их носителей в отобранной для дальнейшего исследования выборке составило 89 (40,8 %), 93 (42,7 %) и 30 (13,8 %) соответственно. Редкие частичные AZFc-делеции выявлены у 6 пациентов, которые составили 2,8 % от всех отобранных носителей делеций AZFc-региона.
Всем мужчинам отобранной выборки выполнено исследование эякулята. По результатам заключений стандартного спермиологического анализа нами определена структура форм патозооспермии при трех наиболее частых делеционных перестройках региона AZFc: del b2/b4, del b2/b3 и del gr/gr (рис. 2-4). Носители полных AZFc-делеций (del b2/b4) характеризовались преобладанием тяжелых форм патозооспер-мии, таких как азооспермия, криптозооспермия и олигозооспермия тяжелой степени с концентрацией сперматозоидов от 0,1 до 1 млн/мл, выявленных у 93 % пациентов (табл. 1). У остальных 7 % мужчин данной подгруппы диагностировали олигозооспер-мию различной степени (умеренно тяжелой, средне-тяжелой, легкой), причем у большинства пациен-
1,2 %
2,3 % 3,6 %
62 %
31 %
OAT I
OAT II
OAT III
OAT IV
|азооспермия
Рис. 2. Структура патозооспермии у мужчин с бесплодием, имеющих полную AZFc (Ъ2/Ъ4) делецию. OAT - олигоастенотератозооспермия: ОАТI - 10-15млн/мл; OATII - 5-10млн/мл; OATIII - 1-5млн/мл; ОАТIV - 0,1-1 млн/мл
7,6 %
3% 3 %
19,3 %
30 %
„%
4,6 %
7 %
астенозооспермия
астенотератозооспермия
OAT I
OAT II
OAT III
OAT IV
азооспермия
2,1 %
13,9 %
20 %
33 %
OAT I OAT II OAT III OAT IV
азооспермия
астенотератозооспермия
нормозооспермия
Рис. 3. Структура патозооспермии у мужчин с бесплодием, имеющих делецию b2/b3. OAT — олигоастенотератозооспермия: ОАТI — 10-15 млн/мл; OAT II — 5—10 млн/мл; OAT III — 1—5 млн/мл; ОАТ IV— 0,1—1 млн/мл
тов концентрация сперматозоидов не превышала 5 млн/мл (только у 1 пациента с делецией Ь2/Ь4 концентрация сперматозоидов составила 10 млн/мл), при этом у всех выявлено снижение подвижности и увеличение доли морфологически аномальных сперматозоидов (астенотератозооспермия).
В отличие от полной, частичные делеции региона Л/Бе характеризовались значительно большей вариабельностью показателей эякулята. Среди носителей данных делеций помимо азооспермии и олигозоос-пермии различной степени тяжести встречали и другие, более мягкие формы патозооспермии и даже наличие нормозооспермии (у 1 пациента). В целом подгруппы мужчин с бесплодием, имеющих частые типы частичных делеций А/Бс-региона (Ь2/Ь3 и gr/gr), характеризовались большей гетерогенностью структуры форм патозооспермии. Однако следует отметить, что среди обследованных мужчин с бесплодием, имеющих частичные делеции А/Рс-региона, также преобладали тяжелые формы (азооспермия
Рис. 4. Структура патозооспермии у мужчин с бесплодием, имеющих делецию gr/gr. OAT — олигоастенотератозооспермия: ОАТI — 10—15 млн/мл; OAT II — 5—10 млн/мл; OAT III — 1—5 млн/мл; ОАТ IV— 0,1—1 млн/мл
и олигозооспермия III—IV степени), выявленные у 77 % носителей делеции gr/gr и у 56 % носителей делеции Ъ2/Ъ3 (см. рис. 3, 4).
У пациентов с редкими частичными делециями AZFc-региона (n = 6), так же как и при полных деле-циях, выявленные формы патозооспермии свидетельствовали о тяжелых нарушениях сперматогенеза. У 3 из них выявлена секреторная азооспермия и у 3 — тяжелая олигозооспермия с концентрацией сперматозоидов < 1 млн/мл. Среднее значение концентрации сперматозоидов у этих пациентов составило 0,21 ± 0,1 млн/мл (см. табл. 1). Вследствие малочисленности носителей редких делеций мы не рассчитывали средние значения подвижности и доли атипичных сперматозоидов, а также не сравнивали их по результатам ККА НПК с частыми типами делеций AZFc-региона. В целом соотношение спермиологических нарушений для этих типов AZFc-делеций было близко к соотношению азооспермии и олигозооспермии тяжелой степени, выявленному при полной делеции AZFc (Ь2/Ь4).
Таблица 1. Показатели концентрации, доли прогрессивно подвижных и атипичных сперматозоидов, а также частоты тяжелых форм нарушения сперматогенеза, частичного блока сперматогенеза на допахитенных стадиях профазы Iмейоза и увеличенной доли неразошедшихся сперматид у мужчин с различными типами Л2¥с-делеций
Тип AZFc-делеции Средняя концентрация сперматозоидов, млн/мл (норма > 15 млн/мл) Средняя подвижность сперматозоидов, % (норма > 32 %) Средний показатель атипичных сперматозоидов, % (норма < 85 %) Частота тяжелых форм нарушения сперматогенеза (концентрация сперматозоидов < 1 млн/мл), % Частота частичного блока сперматогенеза на допахитенных стадиях профазы I мейоза, % Частота увеличенной доли неразошедшихся сперматид, %
Ъ2/Ъ3 (n = 93) 30,3 ± 5,3 10 ± 1,0 94 + 0,8 41,8 54 25
gr/gr (n = 30) 12,2 ± 7,1 7,5 ± 2,3 94 + 2,1 57,0 27 45,5
Ъ2/Ъ4 (n = 89) 0,37 ± 0,13 Н.о. Н.о. 93,0 37 31,3
Редкие частич-
ные AZFc-деле- 0,21 ± 0,10 Н.о. Н.о. 84,3 Не исследовали
ции (n = 6)
Е га Е
Примечание. Н.о. — не оценивали (вследствие малого количества половых клеток).
Оценка частоты встречаемости различных форм патозооспермии у мужчин, имеющих делеции Ъ2/Ъ3 и gr/gr, позволила установить, что степень тяжести нарушения сперматогенеза у них отличается не только от полной делеции Л/Бе (Ъ2/Ъ4), но и между собой (см. рис. 3, 4). Так, у носителей делеций Ъ2 /Ъ3 распространенной формой патозооспермии является асте-нотератозооспермия, выявленная у 30 % пациентов, в то время как среди мужчин с делецией gr/gr данный тип патозооспермии встречали лишь у 10 % пациентов. Важно напомнить, что при делециях, целиком захватывающих хотя бы один Л/Б-регион, вообще не встречаются такие формы патозооспермии, как астено- и/или тератозооспермия без снижения концентрации сперматозоидов (олигозооспермии). Как видно из диаграмм, представленных на рис. 3 и 4, при делеции Ъ2/Ъ3 преобладают астенотератозооспермия и астенозооспер-мия, доля которых в данной подгруппе пациентов составила 37,6 %. На 2-м месте — олигоастенотерато-зооспермия IV степени (22,5 %). У 33 % мужчин с бесплодием, имевших делецию gr/gr, преобладающей формой патозооспермии является олигозооспермия тяжелой степени, концентрация сперматозоидов при этом составляла от 0,1 до 1 млн /мл, на 2-м месте — азооспермия (24 %).
На диаграмме, представленной на рис. 5, показано процентное распределение числа пациентов в зависимости от концентрации сперматозоидов и типа деле-ций. Наглядно видно, что распределение по концентрации сперматозоидов носителей полных и частичных делеций региона Л/Бс заметно различается, но при этом характер распределения для частичных делеций в целом схож. Профиль концентраций спер-
матозоидов у мужчин с делециями Ъ2/Ъ4 имеет убывающий экспоненциальный характер с максимумом в области концентраций 0—0,1 млн/мл (азооспер-мия/криптозооспермия).
Профиль концентраций сперматозоидов у мужчин с делециями Ъ2/Ъ3 и gr/gr не был монофазным и отличался как от экспоненциального, так и от нормального распределения. Хотя характер распределения для делеций Ъ2/Ъ3 и gr/gr был в целом схожим, при делеции gr/gr чаще наблюдали тяжелые формы патозооспермии. Так, у большей части носителей делеции gr/gr концентрация сперматозоидов составляла от 0 до 5 млн/мл, тогда как распределение носителей делеции Ъ2/Ъ3 характеризовалось сдвигом в сторону нормальной ко нцентрации сперматозоидов, имея максимум в области более 15 млн/мл.
Для трех наиболее распространенных типов делеций региона Л/Бе нами были рассчитаны средние значения концентрации сперматозоидов: при полной делеции Л/Бе (Ъ2/Ъ4) — 0,37 ± 0,13 млн/мл, при делеции Ъ2/Ъ3 — 30,3 ± 5,3 млн/мл, при делеции gr/gr — 12,2 ± 7,1 млн/мл (см. табл. 1). Подгруппы мужчин, имеющих полные или частичные Л/Бе-делеции, отличались между собой по данному показателю эякулята. Таким образом, 3 наиболее частых типа Л/Бе-де-леций характеризовались различной выраженностью нарушений сперматогенеза и ранжировались по нарастанию степени тяжести: делеции Ъ2/Ъ3, затем gr/gr и наиболее тяжелые — Ъ2/Ъ4.
В подгруппах мужчин, имеющих делеции Ъ2/Ъ3 и gr/gr, нами определены средние значения подвижности и количества (%) атипичных сперматозоидов. У пациентов с полными Л/Бе-делециями эти данные
Е га Е
%
70 60 50 40 30 20 10
0-0,1 0,1-1 1-5 млн 5-10 млн 10-15 > 15 млн млн млн млн
Рис. 5. Распределение числа пациентов в зависимости от типа Л2¥с-делеций и концентрации сперматозоидов
Ь2/Ь4 (84 человека) дг/дг (30 человек) Ь2/Ь3 (93 человека)
0
Таблица 2. Изменения концентрации сперматозоидов эякулята с течением времени у 2 пациентов с делецией Ъ2/Ъ3
Пациент А., 32 года Пациент В., 40 лет
07.04.2011 12 млн 08.06.2012 2,95 млн
23.09.2011 7,5 млн 12.10.2012 0,95 млн
17.10.2011 6 млн 12.11.2012 1,7 млн
16.12.2011 1,2 млн 12.12.2012 1,25 млн
16.08.2012 2,1 млн 08.02.2013 0,3 млн
28.01.2013 0,75 млн 06.03.2013 0 млн
25.04.2013 0,8 млн 15.04.2013 0,6 млн
29.08.2013 0,4 млн 17.05.2013 0,4 млн
21.06.2013 0,05 млн
■
не рассчитывали, поскольку у 93 % из них сперматозоиды или не были обнаружены при стандартном спер-миологическом исследовании (азооспермия), или их количество было недостаточным (как правило < 1 млн/мл) для достоверной оценки данных показателей. Как видно из табл. 1, средние значения доли атипичных сперматозоидов у обследованных нами пациентов с деле-циями Ь2/Ь3 и gr/gr практически совпадают, составляя около 94 %. Средние значения доли прогрессивно подвижных сперматозоидов при делециях Ь2/Ь3 и gr/gr также были близки и составляли 10,0 ± 1,0 и 7,5 ± 2,3 % соответственно.
Несмотря на сходство средних показателей подвижности и морфологии сперматозоидов у носителей делеций Ь2/Ь3 и gr/gr, некоторые различия между данными подгруппами были выявлены. Так, доля носителей делеций Ь2/Ь3 и носителей делеций gr/gr, имеющих 100 % атипию морфологии сперматозоидов и отсутствие подвижных сперматозоидов, составила
56 % и 67 %, 43 % и 53 % соответственно. Эти различия вместе с меньшим средним значением концентрации сперматозоидов при делеции gr/gr, чем при делеции Ъ2/Ъ3, свидетельствуют в пользу более выраженного негативного эффекта делеций gr/gr на сперматогенез и мужскую фертильность.
Поскольку такой показатель эякулята, как концентрация сперматозоидов, может довольно выраженно и даже значительно изменяться в динамике, нами был проведен ретроспективный анализ заключений спер-миологических исследований (выполненных ранее в нашей или в других лабораториях) у некоторых пациентов с различными типами частичных AZFc-деле-ций. У некоторых мужчин, имеющих делеции Ъ2/Ъ4, отмечали снижение концентрации сперматозоидов с олигозооспермии тяжелой степени до криптозоос-пермии и азооспермии, что свидетельствует о прогрес-сировании нарушений сперматогенеза с возрастом (данные не показаны). Среди 14 пациентов с делеци-ями Ъ2/Ъ3 и gr/gr, обследованных в динамике, ни у одного не выявлено улучшений состояния сперматогенеза. Концентрация сперматозоидов при этом либо снижалась (в 50 % случаев), либо стабильно находилась на низком уровне — олигозооспермия тяжелой степени (в 50 % случаев). Данные по 2 многократно обследованным носителям частичных AZFc-делеций, приведенные в табл. 2, свидетельствуют, что по крайней мере у части мужчин, имеющих частичные AZFc-делеции, существует тенденция к прогрессированию нарушения сперматогенеза с возрастом.
У 71 пациента с различными типами делеций AZFc-региона помимо стандартного спермиологичес-кого исследования был выполнен ККА состава НПК из эякулята по стадиям их развития (табл. 3). Из них 32 мужчины имели полные (Ъ2/Ъ4) и 39 — частичные AZFc-делеции (28 - del Ъ2/Ъ3, 11 - del gr/gr). У 62 (87,3 %) из 71 обследованного диагностирована азоо-
Таблица 3. Частота частичного блока сперматогенеза на допахитенных стадиях профазы Iмейоза при различных типах Л2¥с-делеций и формах патозооспермии
Форма патозооспермии Полная AZFc-делеция (b2/b4) Частичные AZFc-делеции Все AZFc-делеции (полные и частичные)
b2/b3 gr/gr все частичные AZFc-делеции
Аз 5/19 (26 %) 5/15 (33 %) 0/6 (0 %) 5/21 (24 %) 10/40 (25 %)
ОАТ III-IV 6/12 (50 %) 3/6 (50 %) 2/4 (50 %) 5/10 (50 %) 11/22 (50 %)
ОАТ II 1/1 (100 %) - 1/1 (100 %) 1/1 (100 %) 2/2 (100 %)
ОАТ I - 1/1 (100%) - 1/1 (100 %) 1/1 (100 %)
АТ - 6/6 (100 %) - 6/6 (100 %) 6/6 (100 %)
Всего 12/32 (37 %) 15/28 (54 %,) 3/11 (27%) 18/39 (46 %,) 30/71 (42 %)
Примечание. Аз - азооспермия; OAT - олигоастенотератозооспермия: OAT IV— 0,1—1 млн/мл; АТ — астенотератозооспермия. ОАТ I - 10-15 млн/мл; OAT II - 5-10 млн/мл; OAT III - 1-5 млн/мл;
Е га Е
спермия (п = 40) или олигозооспермия тяжелой степени (п = 22), у 9 остальных — олигозооспермия умеренной или легкой степени либо астенотератозооспермия. Важно отметить, что при всех типах микроделеций У-хромосомы ККА НПК позволил обнаружить в осадке эякулята сперматозоиды, в том числе и у пациентов, имеющих азооспермию (по данным стандартного спермиологического исследования). Это обусловлено тем, что при малом количестве сперматозоидов в эякуляте (от единичных до десятков клеток) их обнаружение при проведении стандартного спермиологи-ческого исследования часто не представляется возможным. Это свидетельствует о частичном сохранении сперматогенеза и его протекании в части извитых семенных канальцев у данных мужчин, вплоть до образования зрелых половых клеток. Помимо зрелых в осадке эякулята было обнаружено различное количество НПК (от нескольких десятков до сотен и более). Их количественный анализ по стадиям развития позволил в случае достаточного числа НПК оценить степень протекания различных стадий сперматогенеза и выявить наличие затруднений перехода между стадиями, увеличение доли половых клеток с дегенеративными изменениями. Признаки частичного блока сперматогенеза на допахитенных стадиях профазы I мейоза — увеличение индекса НПК — количества (в %) НПК в эякуляте (норма — 2—4 %), а также количества (в %) НПК на стадиях прелептотены — зи-готены и/или пахитены профазы I мейоза (норма 0,66 ± 0,16 и 0,45 ± 0,10 % соответственно) — обнаружены у 30 (42 %) из 71 пациента (см. табл. 3). Следует отметить, что у всех из обследованных пациентов, у которых концентрация сперматозоидов превышала 0,2 млн/мл, выявлены признаки частичного блока сперматогенеза на допахитенных стадиях (увеличение доли НПК на стадиях от прелептотены до зиготены) профазы I мейоза. У остальных мужчин, очевидно, имело
место столь выраженное угнетение сперматогенеза, что судить о протекании различных стадий и наличии блока сперматогенеза не представлялось возможным из-за малого количества половых клеток в эякуляте. Важным фактом является то, что у тех пациентов, которым ККА НПК выполняли многократно, частичный блок сперматогенеза на допахитенных стадиях сохранялся в динамике. Кроме того, у 31 % пациентов с де-лецией Ъ2/Ъ4, 25 % носителей делеции Ъ2/Ъ3 и 45 % носителей делеции gr/gr выявлено увеличение доли неразошедшихся сперматид (> 30 % при норме 22,98 ± 2,65 %), как правило, сочетавшееся с признаками частичного блока на допахитенных стадиях профазы I мейоза (табл. 4). Это может свидетельствовать об отставании отдельных хромосом в ана-/телофазе, приводящем к образованию многоядерных (от 2 до 4 ядер) НПК. Большинство таких клеток, не завершив диф-ференцировку, подвергаются дегенерации. Таким образом, признаки нарушения сперматогенеза у мужчин с бесплодием, имеющих различные типы Л/Бе-деле-ций, могут прослеживаться на различных стадиях развития мужских половых клеток.
Обсуждение
Частота микроделеций длинного плеча У-хромо-сомы среди мужчин с бесплодием значительно варьирует (от 1 до 35 % и более) в исследованиях разных авторов [4—6, 9, 20]. Столь широкий разброс частоты микроделеций обусловлен влиянием ряда факторов, среди которых наибольшее значение имеют критерии отбора пациентов для проведения молекулярного анализа и количество исследуемых локусов (маркеров) У-хромосомы [5, 20]. Спектр различных типов Л/Б-делеций также может значительно различаться, однако большинство из них целиком или частично затрагивают Л/Бе-регион [4—7, 9, 10, 14, 15]. Доля полных делеций Л/Бе (Ъ2/Ъ4) составляет около 75 % всех пол-
Таблица 4. Частота встречаемости повышенного показателя нерасхождения сперматид при различных типах Л2¥с-делеций и формах пато-зооспермии
Е Форма патозооспермии Полная AZFc-делеция (b2/b4) Частичные AZFc-делеции Все AZFc-делеции (полные и частичные)
ста b2/b3 gr/gr Все частичные AZFc-делеции
09 Аз 6/19 (31,6 %) 5/15 (33,3 %) 3/6 (50,0 %) 8/21 (38,1 %) 14/40 (35,0 %)
ОАТ III-IV 4/12 (33,3 %) 0/6 (0,0 %) 2/4 (50,0 %) 2/10 (20,0 %) 6/22 (27,3 %)
.в ОАТ II 0/1 (0,0 %) - 0/1 (0,0 %) 0/1 (0,0 %) 0/2 (0,0 %)
га ОАТ I - 0/1 (0 %) - 0/1 (0 %) 0/1 (0,0 %)
■ АТ - 2/6 (33,3 %) - 2/6 (33,3 %) 2/6 (33,3 %)
Всего 10/32 (31,3 %) 7/28 (25 %) 5/11 (45,5 %) 12/39 (30,8 %) 22/71 (31,0 %)
s Примечание. Аз — азооспермия; OAT — олигоастенотератозооспермия: ОАТ I — 10—15 млн/мл; OAT II — 5—10 млн/мл; OAT III — 1—5 млн/мл; OAT IV — 0,1—1 млн/мл; АТ — астенотератозооспермия.
ных (классических) Л/Б-делеций, занимая среди них 1 -е место [4—7]. В отличие от частичных, частота полных микроделеций данного региона не зависит от этнического происхождения и гаплотипа У-хромосомы. Частота встречаемости делеции Ь2/Ь4 среди мужчин из неотобранных популяций составляет приблизительно 1 на 2000 [15]. В среднем Л/Бе-делеции обнаруживают у 3—6 % мужчин с бесплодием и у 10—15 % пациентов с азооспермией или олигозооспермией тяжелой степени [2, 4—7, 9].
Многими исследователями показано, что встречаемость частичных Л/Бе-делеций у мужчин из различных регионов мира значительно варьирует, что в значительной мере обусловлено разницей в этническом происхождении и гаплотипе У-хромосомы обследуемых [9, 10—15]. Частота полных и частичных делеций Л/Бе-региона среди обследованных нами российских мужчин с бесплодием составила 3,9 и 12,1 % соответственно. Таким образом, выявленная частота полной делеции Л/Бе (Ь2/Ь4) соответствует данным, полученным для мужчин с бесплодием из других стран. Как нами установлено, наиболее распространенными среди всех типов микроделеций У-хромосомы и наиболее частыми типами частичных делеций региона Л/Бе у российских мужчин с бесплодием являются делеции Ь2/Ь3 (7,9 %) и gr/gr (3,5 %). Примечательно, что самая частая среди них — делеция Ь2/Ь3 — характерна для N гаплогруппы У-хромосомы, встречающейся с высокой частотой у мужчин севера Евразии [12, 13]. Частота данного типа Л/Бе-делеций у мужчин из западноевропейских популяций составляет 1—2 % [15]. Частота делеции gr/gr варьирует в различных популяциях мира от 2 до 15 % и более. В Западной Европе наиболее частой является делеция gr/gr, где ее обнаруживают в среднем у 4 % мужчин, имеющих азооспермию или олигозооспермию тяжелой степени [14—18, 23]. Среди мужчин с бесплодием из популяций Китая де-леции Ь2/Ь3 и gr/gr встречаются с почти равной частотой — 9 и 7—14 % соответственно [19, 24, 25].
Обследованная нами выборка мужчин с микроделе-циями региона У-хромосомы — одна из наиболее многочисленных (согласно анализу научных публикаций). При этом выборка носителей делеции Ь2/Ь3, обследованных спермиологически, является самой крупной среди исследований, опубликованных к настоящему времени. Большое число мужчин с делециями данного региона У-хромосомы и проведение комплексного спер-миологического исследования позволили впервые детально охарактеризовать различия в состоянии сперматогенеза у ее носителей. Полученные нами данные подтверждают различия в степени нарушения/сохранности сперматогенеза у носителей полных и частичных Л/Бе-делеций.
При полных делециях региона Л/Бе степень нарушения сперматогенеза (в отличие от делеций Л/Ба
и AZFb) не у всех мужчин приводит к полному отсутствию половых клеток, а варьирует от азооспермии до олигозооспермии тяжелой степени и крайне редко сочетается с сохранением сперматогенеза со среднетя-желой степенью олигозооспермии (< 10 млн/мл). Согласно настоящему, а также предыдущим собственным исследованиям, для мужчин с полными AZFc-делеция-ми характерны выраженные нарушения сперматогенеза (блок сперматогенеза на допахитенных стадиях профазы I мейоза, нарушения делений созревания) вплоть до Сертоли-клеточного синдрома [4]. Как правило, при этом количество сперматозоидов не превышает 1—2 млн/мл. Редко встречаются пациенты с делециями, целиком захватывающими AZFc-регион, у которых концентрация сперматозоидов составляет 2—5 млн/мл, и крайне редко — 5—10 млн/мл. Среди них описаны уникальные случаи сохранения фертильности и наступления беременности естественным путем, а также наследование делеций сыновьями после программ ICSI, интрацитоп-лазматической инъекции сперматозоидов [26—28]. Как правило, данные пациенты были выявлены после обнаружения микроделеций Y-хромосомы у их сыновей, обратившихся для обследования по поводу азооспермии либо олигозооспермии и бесплодия [26]. В сравнении с другими полными (классическими) типами AZF-делеций (AZFa, AZFb, AZFb+c, AZFa+b+c, AZFa+c), репродуктивный прогноз при которых негативен, делеции AZFc-региона в целом относят к более благоприятным в отношении возможности репродукции типам структурных перестроек Y-хромосомы [28, 29]. Так, у 2/3 мужчин с полными AZFc-делециями могут быть получены единичные сперматозоиды из эякулята либо с помощью биопсии. В среднем у 50—70 % пациентов с делецией, целиком захватывающей AZF^ регион, удается получить сперматозоиды, пригодные для искусственного оплодотворения [28, 29].
В отличие от полных, частичные делеции региона AZFc часто наследуются (в случаях сохранения фер-тильности у их носителей), являясь полиморфизмами Y-хромосомы [9—15]. Очевидно, что степень сохранности репродуктивной функции при этом обусловлена наличием/отсутствием других генетических и средо-вых факторов, негативно влияющих на репродуктивную систему в супружеской паре, в которой мужчина является носителем AZFc-делеции [5].
Результаты спермиологического исследования пациентов, имеющих полные и частичные AZFc-деле-ции, свидетельствуют о явных различиях в таких показателях спермограмм, как концентрация, подвижность и доля морфологически аномальных (атипичных) сперматозоидов. По средним значениям концентрации сперматозоидов группы мужчин, имеющих полные и частичные AZFc-делеции, явно различались между собой. Ранее другими авторами было показано, что у носителей делеции gr/gr по сравнению с контрольной
Е га Е
Е га Е
группой (фертильные мужчины) снижена средняя концентрация сперматозоидов [30]. Наличие некоторых типов (подтипов) частичных Л/Бе-делеций, таких как gr/gr, является фактором риска нарушения сперматогенеза и мужской фертильности [14—16, 19]. В отличие от них значимость влияния делеции Ь2/Ь3 и других редких частичных делеций, а также дупликаций региона Л/Бе на У-хромосому и сперматогенез не показана и остается предметом исследований [9, 10, 15, 23].
Помимо того, что Л/Б-микроделеции могут приводить к нарушению сперматогенеза и инфертильнос-ти у мужчин, они также повышают чувствительность У-хромосомы к последующим воздействиям и мутациям. Рядом авторов было показано, что наличие частичных делеций Л/Бе-региона может предрасполагать к возникновению полной Л/Бе-делеции в незрелых мужских половых клетках. Наличие полных Л/Бе-де-леций (при сохраненном сперматогенезе) может вести к мейотической и митотической нестабильности У-хромосомы и возникновению хромосомного моза-ицизма, а также повышению доли анеуплоидных по гоносомам гамет [5, 24].
Одним из представляющих научный интерес и имеющих практическое значение результатов данного исследования является то, что у мужчин с частичными Л/Бе-делециями отмечено выраженное снижение концентрации сперматозоидов с возрастом. Изменение параметров эякулята в динамике у мужчин с делециями локуса Л/Б практически не исследовали ранее. У некоторых пациентов с полными Л/Бс-деле-циями, обследованных в динамике, отмечали снижение концентрации сперматозоидов с олигозооспермии тяжелой степени до криптозооспермии и азооспермии [4]. Ухудшение показателей количества и качества сперматозоидов требует дальнейшего исследования на крупных выборках мужчин — носителей Л/Б-деле-ций, а также поднимает вопрос о целесообразности криоконсервации сперматозоидов для дальнейшего их использования при искусственном оплодотворении.
Исходя из полученных нами результатов и данных других исследователей, отсутствие генов региона Л/Бе У-хромосомы у мужчин с бесплодием характеризуется различной степенью тяжести нарушений сперматогенеза. При этом имеют место нарушения деления и созревания НПК: от частичного блока на допахитенных стадиях профазы I мейоза и/или нарушения делений созревания вплоть до полного угнетения сперматогенеза. Так, за исключением редких случаев, полные де-леции Л/Бе-региона приводят к выраженному угнете-
нию сперматогенеза и как следствие — к секреторной азооспермии или олигозооспермии тяжелой степени. У носителей частичных Л/Бе-делеций состояние сперматогенеза и репродуктивной функции значительно варьирует.
Проведение анализа микроделеций У-хромосомы необходимо рекомендовать всем мужчинам с азооспермией или олигозооспермией при концентрации сперматозоидов менее 5 млн/мл. Поиск частичных Л/Бс-делеций не является обязательным в клинической практике, и необходимость его проведения в настоящее время обсуждается [31]. Учитывая собственные данные, анализ частичных Л/Бс-делеций может быть рекомендован в качестве дополнительного моле-кулярно-генетического исследования мужчинам с бесплодием, не имеющим полных Л/Б-делеций, у которых концентрация сперматозоидов составляет менее 15 млн/мл и/или наблюдается снижение концентрации сперматозоидов в динамике неясного генеза.
Выводы
1. Наиболее частыми типами делеций Л/Бе-региона У-хромосомы среди российских мужчин с бесплодием являются делеции Ь2/Ь4, Ь2/Ь3 и gr/gr. Их частоты составляют 3,9; 7,9 и 3,5 % от общего числа обследованных соответственно.
2. Выявлены различия в структуре форм патозоос-пермии у мужчин с бесплодием, имеющих полные или частичные Л/Бе-делеции. Полные Л/Бе-делеции в 97 % случаев приводят к секреторной азооспермии и олигозооспермии с концентрацией сперматозоидов менее 5 млн/мл. Примерно у 1/3 носителей частичных Л/Бе-делеций сперматогенез в значительной мере сохранен. При этом доля выраженных нарушений сперматогенеза (с концентрацией сперматозоидов менее 5 млн/мл) при делеции gr/gr выше, чем при делеции Ь2/Ь3 (77 и 56 % соответственно).
3. Выявлена отрицательная динамика в изменении концентрации сперматозоидов во времени у мужчин с некоторыми типами делеций Л/Бе региона, в частности у носителей частичных Л/Бе-делеций Ь2/Ь3.
4. Тяжесть нарушений сперматогенеза по данным ККА НПК не зависит от типа Л/Бе-делеций у пациентов с одинаковыми формами патозооспермии. Наличие частичного блока сперматогенеза на допахитен-ных стадиях профазы I мейоза выявлено у всех пациентов с различными типами делеций Л/Бе-региона, имеющих концентрацию сперматозоидов более 0,2 млн/мл.
ЛИТЕРАТУРА
1. Курило Л.Ф., Сорокина Т.М., Черных В.Б. и др. Структура генетически обусловленных заболеваний органов половой системы у человека. Андрол и генит хир 2011;(3):17-26.
2. Черных В.Б. Генетические факторы мужского бесплодия. Мат. Всерос. науч.-практ. конф. «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний: возможности и перспективы». Мед генетика 2006;(Прил 2):8-14.
3. Matzuk M.M., Lamb D.J. The biology of infertility: research advances and clinical challenges. Nat Med 2008;14(11):1197-213.
4. Черных В.Б., Чухрова А.Л., Бескоровайная Т.С. и др. Типы делеций Y-хромосомы и их частота у мужчин с бесплодием. Генетика 2006;42(8):1130-6.
5. Черных В.Б. AZF делеции - частая генетическая причина бесплодия у мужчин: современное состояние исследований. Пробл репрод 2009;15(1):10-5.
6. Vogt P.H., Edelmann A., Kirsch S. et al. Human Y chromosome azoospermia factors (AZF) mapped to different subregions in Yq11. Hum Mol Genet 1996;5(7):933-43.
7. Kuroda-Kawaguchi T., Skaletsky H., Brown L.G. et al. The AZFc region of the
Y chromosome features massive palindromes and uniform recurrent deletions in infertile men. Nat Genet 2001;29(3):279-86.
8. Skaletsky H., Kuroda-Kawaguchi T., Minx P.J. et al. The male specific region of the human Y chromosome is a mosaic of discrete sequence classes. Nature 2003;423(6942): 825-37.
9. Vogt P.H. AZF deletions and Y chromosomal haplogroups: history and update based on sequence. Hum Reprod Update 2005;11(4):319-36.
10. Repping S., van Daalen S.K., Brown L.G. et al. High mutation rates have driven extensive structural polymorphism among human Y chromosomes. Nat Genet 2006;38(4):463-7.
11. Repping S., Skaletsky H., Brown L. et al. Polymorphism for a 1.6-Mb deletion of the human Y chromosome persists through balance between recurrent mutation and
haploid selection. Nat Genet 2003;35(3): 247-51.
12. Fernandes S., Paracchini S., Meyer L.H. et al. A large AZFc deletion removes DAZ3/ DAZ4 and nearby genes from men in Y haplogroup N. Am J Hum Genet 2004;74(1):180-7.
13. Repping S., van Daalen S.K., Korver C.M. et al. A family of human Y chromosomes has dispersed throughout northern Eurasia despite a 1.8-Mb deletion in the azoospermia factor
c region. Genomics 2004;83(6):1046-52.
14. Machev N., Saut N., Longepied G. et al. Sequence family variant loss from the AZFc interval of the human Y chromosome, but not gene copy loss, is strongly associated with male infertility. J Med Genet 2004;41(11):814-25.
15. Rozen S.G., Marszalek J.D., Irenze K. et al. AZFc deletions and spermatogenic failure: a population-based survey of 20,000
Y chromosomes. Am J Hum Genet 2012;91(5):890-6.
16. Ferlin A., Tessari A., Ganz F. et al. Association of partial AZFc region deletions with spermatogenic impairment and male infertility. J Med Genet 2005;42(3):209-13.
17. Hucklenbroich K., Gromoll J., Heinrich M. et al. Partial deletions in the AZFc region of the Y chromosome occur in men with impaired as well as normal spermatogenesis. Hum Reprod 2005;20(1):191-7.
18. Krausz C., Giachini C., Xue Y. et al. Phenotypic variation within European carriers of the Y-chromosomal gr/gr deletion is independent of Y-chromosomal background.
J Med Genet 2009;46(1):21-31.
19. Wu B., Lu N.X., Xia Y.K. et al. A frequent
Y chromosome b2/b3 subdeletion shows strong association with male infertility in HanChinese population. Hum Reprod 2007;22(4):1107-13.
20. Simoni M., Bakker E., Eurlings M.C. et al. Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions. Int J Androl 1999;22(5):292-9.
21. Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека (пер.
с англ. Н.П. Макаровой под научн. ред.
рус. перевода Л.Ф. Курило). 5-е изд. М., 2012. 291 с.
22. Курило Л.Ф. Способ цитологической диагностики нарушения сперматогенеза. Патент на изобретение № 2328736
от 01.02.2007.
23. Giachini C., Laface I., Guarducci E. et al. Partial AZFc deletions and duplications: clinical correlates in the Italian population. Hum Genet 2008;124(4):399-410.
24. Zhang F., Lu C., Li Z. et al. Partial deletions are associated with an increased risk of complete deletion in AZFc: a new insight into the role of partial AZFc deletions in male infertility. J Med Genet 2007;44(7):437-44.
25. Yang Y., Ma M., Li L. et al. Y chromosome haplogroups may confer susceptibility
to partial AZFc deletions and deletion effect on spermatogenesis impairment. Hum Reprod 2008;23(9):2167-72.
26. Chang P.L., Sauer M.V., Brown S.
Y chromosome microdeletion in a father and his four infertile sons. Hum Reprod 1999;14(11):2689-94.
27. Page D.C., Silber S., Brown L.G. Men with infertility caused by AZFc deletion can produce sons by intracytoplasmic sperm injection, but are likely to transmit the deletion and infertility. Hum Reprod 1999;14(7):1722-6.
28. Oates R.D., Silber S., Brown L.G., Page D.C. Clinical characterization of 42 oligospermic or azoospermic men with microdeletion of the AZFc region of the Y chromosome, and of 18 children conceived via ICSI. Hum Reprod 2002;17(11):2813-24.
29. Hopps C.V., Mielnik A., Goldstein M. et al. Detection of sperm in men with Y chromosome microdeletions of the AZFa, AZFb and AZFc regions. Hum Reprod 2003;18(8):1660-5.
30. Visser L., Westerveld G.H., Korver C.M. et al. Y chromosome gr/gr deletions are a risk factor of low semen quality. Hum Reprod 2009;24(10):2667-73.
31. Stouffs K., Tournaye H., Van der Elst J. et al. Do we need to search for gr/gr deletions in infertile men in a clinical setting? Hum Reprod 2008;23(5):1193-9.
E
W
E
