CC BY
96
УДК 579.66:547.94
Н. И. Петухова, Л. Я. Калимуллина, Ю. Р. Сюндюкова, В. В. Зорин
Биотрансформация льняного масла в липиды,
/"' о «_» о
обогащенные эикозапентаеновои кислотои
Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 243-19-35; e-mail: bio@rusoil.net
Исследована возможность получения липидов, обогащенных эйкозапентаеновой кислотой, путем трансформации льняного масла с помощью гриба Mortierella alpina 18-1 или его галорези-стентного мутанта Mortierella alpina ХН1 при росте на овсяной среде с глицерином.
Ключевые слова: Mortierella alpina, полиненасыщенные жирные кислоты, арахидоновая кислота, эйкозапентаеновая кислота, биотрансформация.
Многочисленными клиническими исследованиями показана терапевтическая эффективность обогащения диет незаменимыми жирными кислотами при лечении различных хронических и воспалительных заболеваний, включая астму, экзему, псориаз, ревматоидные артриты, волчанку, язвенные колиты, сердечно-сосудистые заболевания. Доказано, что активная роль диетических эссенциальных полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в аллергической и воспалительной реакции
(n-6 путь)
обусловлена их участием в метаболизме эйко-заноидов — простагландинов и лейкотриенов — важных медиаторов воспаления, а при атопи-ческих заболеваниях имеет место активация циклооксигеназных и липооксигеназных путей превращения арахидоновой (АК) и эйкозапентаеновой (ЭПК) кислот, гиперпродукция ли-пидных медиаторов 1-5.
Альтернативным подходом к получению практически важных ПНЖК является трансформация растительных масел с помощью микроорганизмов. Описана возможность получения ЭПК трансформацией б-линоленовой кислоты, содержащейся в масле льна, с помощью грибов Mortierella alpina 1S-4, используемого в промышленном производстве АК 4.
Предполагается, что б-линоленовая кислота модифицируется в ЭПК под действием тех же ферментов, которые участвуют в синтезе самой арахидоновой кислоты (n-6 путь), и могут также проявлять активность к интер-медиатам диет n-3 пути синтеза ПНЖК:
(n-3 путь)
Дата поступления 18.12.07
Фикомицет Mortierella alpina 18-1, выделенный и хранящийся в музее кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ, накапливает в большом количестве АК 6, поэтому представляла интерес возможность использования его в качестве биокатализатора для получения ЭПК из льняного масла.
Нами была изучена биотрансформация льняного масла с помощью исследуемого гриба. Льняное масло вносили в ростовую среду на 10 сут. культивирования, когда наиболее активно осуществлялся синтез арахидоновой кислоты. Трансформацию заканчивали на 23 сут. и выделяли липиды из мицелия после предварительной промывки его от остатков непоглощенного льняного масла.
Хроматомасс-спектрометрический анализ состава липидов 23-суточного мицелия гриба показал, что в них преобладают ненасыщенные жирные кислоты, среди которых идентифицированы эйкозатриеновая, арахидоновая и эйкозапентаеновая С20 кислоты (рис. 1).
60 т
% 50
¡I 403020100
н о
50,21
0,2 03 0,191,67 0,07
16,29
,76 4,09
>uIUL
24,49
!
ОО ОО ОО 00
00 22
Рис. 1. Жирнокислотный профиль 23-х суточного мицелия гриба Mortierella alpina 18-1 при трансформации льняного масла
В этих условиях выход ЭПК составил 1.48 г/кг среды.
В отличие от описанного в литературе штамма Mortierella alpina 1S-4, изученный микроорганизм практически не синтезировал ЭПК de novo, даже при пониженной температуре 7. Вместе с тем, галорезистентный мутант Mortierella alpina ХН1, полученный на основе этого штамма, оказался способен осуществлять синтез ЭПК de novo при росте на овсяной среде с глицерином в присутствии 5% NaCl 7 8. Это указывает на наличие у данного микроорганизма активной десатуразы (предположительно, ю3-десатуразы), окисляющей арахидо-новую кислоту.
Было предположено, что наличие такой десатуразы позволит увеличить выход ЭПК в процессе трансформации льняного масла по сравнению с исходным штаммом. Гипотетические схемы образования ЭПК при трансформации льняного масла, обогащенного б-лино-леновой кислотой, с помощью исходного гриба (А) и галорезистентного мутанта (Б) представлены ниже.
16:0
глицерин
18:0
I D9 18:1n9 I D12
» D6 EL D5 18:2n6 -»• 18:3n6 ->-20:3n6-* 20:4n6
18:3n3 D6
экзогенная
EL
D5
18:4n3
-20:4n3
■20:5n3
А
16:0
глицерин
18:0
D9
18:1n9 I D12
» D6 EL D5 18:2n6 -►18:3n6 -»"20:3n6-- 20:4n6
I w3
18:3n3 D6
экзогенная
EL
D5
18:4n3
-20:4n3
■20:5n3
Б
В связи с этим была исследована трансформация льняного масла с помощью галоре-зистентного мутанта Mortierella alpina ХН1.
Биомассу гриба Mortierella alpina ХН1 выращивали на среде ОГ, содержащей 5% хлорида натрия, в течение 10 сут., после чего в среду вносили льняное масло (1%). Трансформацию масла осуществляли в течение 10 сут. Липиды из 20-ти суточного мицелия выделяли после предварительной промывки его от остатков непоглощенного льняного масла.
В результате исследования было получено грибное масло, содержащее 21.9% ЭПК (рис. 2).
Выход эйкозапентаеновой кислоты при этом составил 1.35 г/кг среды, что сопоставимо с выходом этого соединения, полученного ранее с помощью исходного штамма Mortierella alpina 18-1 (1.48 г/кг).
Таким образом, галорезистентный гриб Mortierella alpina ХН1 также может представ-
лять интерес для биотрансформации растительных масел в ЭПК, при этом использование мутанта может быть даже более эффективным, чем применение дикого штамма, поскольку целевой продукт с данным выходом удается получить уже через 20 сут., тогда как исходный гриб накапливал указанное количество ЭПК в течение 23 сут.
я а
30 25 20 15 10
25,3
1,1 *ж
1,6 ÍÍ
2,2
21,9
15,6
Рис. 2. Жирнокислотный профиль 20-ти суточного мицелия гриба Mortierella alpina ХН1 при трансформации льняного масла на среде ОГ с NaCl (5%)
Вместе с тем, следует отметить, что в обоих случаях выход целевого продукта недостаточно высок и требуется поиск способов интенсификации разрабатываемых биотрансформаций.
Экспериментальная часть
Объектом исследования служил гриб Mortierella alpina (18-1) из коллекции микроорганизмов кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ.
Выращивание продуцента осуществляли в чашках Петри на стерильной овсяной среде (100 г овса на 1000 мл воды), содержащей 1% глицерина, при температуре 25 оС. При необходимости в среду вносили хлористый натрий в концентрациях 1—5 %.
Для засева использовали суспензию спор и фрагментов мицелия (2-3-106 фрагментов мицелия и спор/мл), полученную смывом культуры стерильной водопроводной водой, со скошенной в пробирках среды Чапека.
Биомассу после выращивания и трансформации собирали, трижды промывали холодной дистиллированной водой и высушивали в сушильном шкафу до постоянного веса
при t=65 оС. ЖК выделяли в виде метиловых эфиров согласно частично модифицированной
9
методике .
Идентификацию метиловых эфиров ЖК
поводили на хроматомасс-спектрометре
"HP-5896" c масс-селективным детектором
НР-5972А. Относительное количество жирных
кислот в пробе определяли по отношению
к внутреннему стандарту — бегеновой кислоте
(0.1 мкг/мл в пробе). Физико-химические
константы всех полученных соединений совпа-
10 11
дают с литературными данными ".
Масс-спектр метилового эфира арахидо-новой кислоты, m/z: 55(49), 67(79), 79(100), 91(67), 105(30), 119(18), 133(12), 150(13), 161(3), 175(4), 203(3), 247(3), 318M+(1)
Масс-спектр метилового эфира эйкозапен-таеновой кислоты, m/z: 67(61), 79(100), 91(74), 105(33), 108(18), 119(31), 131(16), 147(12), 161(7), 175(7), 201(6), 215(4), 247(2), 316M+(0).
Литература
1. German J. B., Dillard С. J., Whelan J. Symposium: // J. Nutr.- 1996.- V. 126.— P. 1076.
2. Steekstra H. // J. Biotechnol.— 1997.— V. 56.— P. 153.
3. Higashiyama K., Fujikawa S., Park E., Shimizu S. // Biotechnol. Bioprocess. Eng.— 2002.— V. 7.— P. 252.
4. Shimizu S. // Appl Microbiol Biotechnol.— 1989.— №32.— P. 1.
5. Shimizu S., Shinmen Y., Kawashima H., Akimoto K., Yamada H. // Biochem Biophys Res Commun V.150.— P. 335.
6. Давлетбаева И. М. Автореферат дисс... канд. техн. н.— Уфа, 2002.— 24 с.
7. Рахматуллина Ю. Р. Автореф. дисс... канд. техн. н.— Казань, 2007.— 20 с.
8. Петухова Н. И., Рахматуллина Ю. Р., Пантелеева С. Н., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.— 2007.— Т. 14, № 1.— С. 141.
9. А. С. 968072. СССР, МКИ С 12 Q 1/100. Способ количественного определения жирно-кислотного состава липидов микроорганизмов / Султанович Ю. А., Нечаев А. П., Барсукова И. А. // Б.И.— 1982.— № 39.— С. 223.
10. MRS Lipid Analysis Unit [Электронный ресурс]: Режим доступа: www.lipid.co.uk, свободный.— Загл. с экрана. Яз. англ.
11. Lipid bank [Электронный ресурс]: Copyright 1999—2002 International Medical Center of Japan / Japan Science and Technology Corporation all rights reserved. Режим доступа: http:// lipid.bio.m.u—tokyo.ac.jp, свободный.— Загл. с экрана. Яз. англ.
5
0
