CC BY
59
УДК 579.66:547.94
Н. И. Петухова, Ю.Р. Рахматуллина, С. Н. Пантелеева, В. В. Зорин
Исследование синтеза полиненасыщенных жирных кислот галорезистентным грибом Mortierella alpina ХН1
Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел.: (347) 243-19-35; e-mail: bio@rusoil.net
Получен галорезистентный гриб Mortierella alpina ХН-1, способный расти на овсяной среде с 5% NaCl, и показана принципиальная возможность использования данного микроорганизма для получения эйкозапентаеновой кислоты.
Ключевые слова: полиненасыщенные жирные кислоты, эйкозапентаеновая кислота, Mortierella alpina.
Грибы Mortierella alpina хорошо извест-
1
ны как продуценты арахидоновой кислоты и используются в промышленности для получения этого ценного продукта 2. Однако с помощью этого микроорганизма могут быть получены в значительных количествах и другие полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), важнейшей из которых является эй-козапентаеновая (20 : 5n3), использующаяся в лечении сердечно-сосудистых заболеваний 1 2, а также болезней, связанных с агрегацией тромбоцитов и повышенным кровяным давле-
3
нием 3.
Известно, что эйкозапентаеновая кислота может синтезироваться грибами Mortierella alpina в небольших количествах при культивировании при низкой температуре (ниже 10 оС)
12 4
или при низкой влажности , что связано 2100
с активацией в этих условиях ю-десатуразы, окисляющей арахидоновую кислоту.
В настоящей работе с целью создания эффективного метода получения эйкозапентаено-вой кислоты с помощью грибов-продуцентов арахидоновой кислоты было исследовано влияние хлорида натрия на рост и липидообразо-вание гриба Mortierella alpina 18-1.
Культивирование продуцентов полиненасыщенных жирных кислот в условиях повышенной солености среды в ряде случаев позволяет существенно увеличить выход этих практически ценных соединений 3. Однако при выращивании Mortierella alpina 18-1 на овсяной среде с глицерином (1%) было обнаружено, что NaCl уже в концентрации 1% подавляет рост гриба на 15%, а при 3% почти ингибирует развитие грибного мицелия (рис. 1).
Для увеличения устойчивости исследуемого гриба к хлориду натрия была предпринята попытка получить галорезистентные колонии, способные расти при повышенных концентрациях соли.
В результате облучения суспензии спор гриба УФ-светом и последующем инкубировании на градиентном агаре была получена
к к к
§ 60
и
ft н
(U CS
К
80
40
20
0
5
10
15
20
Время, сут
NaCl —о—0 г/л -а- 10 г/л -а-30 г/л -о-50 г/л -о-70 г/л
Рис. 1. Влияние NaCl на рост гриба Mortierella alpina 18-1 на овсяной среде с глицерином
Дата поступления 21.03.07
Башкирский химический журнал. 2007. Том 14. № 1 14 1
колония гриба, способная расти на овсяной среде с глицерином, содержащей 5% NaCl. При этом галорезистентный гриб образовывал колонии, типичные для Mortierella alpina (рис. 2а).
Микроскопирование препаратов галоре-зистентных грибов также подтверждает их принадлежность к грибам Mortierella alpina, для которых характерен несептирован-ный мицелий, образование стилоконидий и зи-госпорангиев (рис. 2 б, в).
В отличие от исходного гриба, вариант ХН1 хорошо рос в присутствии 5% хлорида натрия, при этом выход биомассы галорезис-тентных грибов был даже выше, чем выход биомассы исходного гриба на среде без NaCl (табл. 1). В то же время, выход обезжиренной биомассы, накапливаемой вариантом ХН1, сопоставим с уровнем исходного штамма (табл. 1), что свидетельствует об интенсивном биосинтезе липидов.
Исследование процесса липидообразова-ния показало, что у галорезистентных грибов
выход липидов, накапливаемых в 23-х-суточ-ной биомассе, в 2 раза выше, чем у исходного штамма. Это указывает на стимулирование NaCl липидообразования у грибов Mortierella alpina. Обнаружено также, что полученный галорезистентный гриб характеризуется пониженной по сравнению с исходным грибом ТТХ-редуктазной активностью (рис. 3), что указывает на возможные различия составов липидов исследуемых грибов (в частности, более низкое содержание арахидоновой кислоты в липидах галорезистентного гриба 4).
Таблица 1 Выход биомассы и липидов при культивировании исходного гриба Mortierella alpina 18-1 и галорезистентного варианта ХН1
Гриб Выход биомассы, г(АСВ)/кг (среды) Выход обезжиренной биомассы, г (АСВ)/кг (среды) Выход липидов, (% от АСВ)
18-1а 10.43 8.03 23
ХН1б 14.98 8.24 45
00 с
О
2 п 1,8 1,6 1,4 1,2 1
0,8 0,6 0,4 0,2 н 0
10 11 12 13 14 16 17 18 19 20 22 23
время, сутки
♦ исходный —♦— ХН1
Рис. 3. ТТХ-редуктазная активность мицелия галорезистентного гриба МоИ:1еге!!а а/рта(ХН1): условия реакции: ТТХ — 0.8%; биомасса —100мг/мл; 0.2Мборатный буфер(рН8.0); температура — 25 оС, время — 1 ч
Хроматомасс-спектрометрическое исследование качественного состава жирных кислот, накапливаемых галорезистентным грибом, выявило наличие насыщенных жирных кислот: миристиновой (14 : 0), пальмитиновой (16 : 0), стеариновой (18 : 0), а также ненасыщенных: олеиновой (18 : 1п9), линоле-вой (18 : 2п6), у-линоленовой (18 : 3п6), ара-хидоновой (20 : 4п6) и эйкозапентаеновой (20 : 5п3).
Количественный анализ состава липидов 23-х-суточного мицелия гриба ХН1 показал, что в них превалируют ненасыщенные жирные кислоты (более 90%) (рис. 4). При этом
суммарный уровень практически важных С20 полиненасыщенных жирных кислот составляет около 24%.
Содержание в липидах эйкозопентаено-вой кислоты, которая обнаруживается только в следовых количествах у галочувствительного штамма Mortierella alpina 18-1 при низких температурах 4, в случае галорезистентного гриба достигает 14%.
Выход эйкозапентаеновой кислоты при культивировании галорезистентного гриба ХН1 в используемых условиях (овсяная среда с 1% глицерина и 5% хлористого натрия) составляет 0.95 г/кг среды.
Однако, суммарное содержание эйкоза-пентаеновой и арахидоновой кислот в мицелии гриба M. alpina ХН1 на 23 сутки оказалось ниже, чем содержание арахидоновой кислоты в мицелии гриба M. alpina 18-1, имеющего более высокую ТТХ-редуктазную активность, за тот же период времени.
Таким образом, показана принципиальная возможность получения эйкозапентаеновой кислоты с помощью галорезистентного гриба Mortierella alpina путем ферментации на овсяной среде в присутствии глицерина и хлорида натрия.
Экспериментальная часть
Объектом исследования служил гриб Mortierella alpina (18-1) из коллекции микроорганизмов кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ.
Выращивание продуцента осуществляли в чашках Петри на стерильной овсяной среде (100 г овса на 1000 мл воды), содержащей 1% глицерина, при температуре 25 оС. При необходимости в среду вносили хлорид натрия в концентрациях 1—5 %.
Для засева использовали суспензию спор и фрагментов мицелия (2—3 х 106 фрагментов мицелия и спор/мл), полученную смывом культуры стерильной водопроводной водой, со скошенной в пробирках среды Чапека.
Для получения галорезистентного гриба суспензии спор Mortierella alpina 18-1 облучали УФ-светом и высевали на агаризованные овсяные среды с градиентом хлористого натрия (концентрация соли по диаметру чашки изменялась от 3 до 7 %).
ТТХ-редуктазную активность мицелия оценивали по степени окрашивания мицелия 2,3,5-трифенилформазаном в процессе инкубации с 2,3,5-трифенилтетразолий хлоридом (ТТХ) в течение 1 ч. Биомассу (0.1 г) помещали в 1 мл 0.8% раствора ТТХ в 0.2 М боратном буфере (рН 8.0) и инкубировали в темноте 1 ч при 25 оС. Мицелий дважды промывали дистиллированной водой, разрушали и трижды экстрагировали 2,3,5-трифенилформазан этилацетатом (по 2 мл) при комнатной темпе-
ратуре. Степень окрашивания измеряли при длине волны 485 нм.
Биомассу после выращивания собирали, трижды промывали холодной дистиллированной водой и высушивали в сушильном шкафу до постоянного веса при 65 оС. Жирные кислоты выделяли в виде метиловых эфиров согласно модифицированной методике 5.
Идентификацию метиловых эфиров ПНЖК поводили на хроматомасс-спектромет-ре «HP-5896» c масс-селективным детектором НР-5972А. Относительное количество жирных кислот в пробе определяли по отношению к внутреннему стандарту - бегеновой кислоте (0.1 мкг/мл в пробе). Физико-химические константы полученных соединений совпадают с литературными данными 6' 7.
Масс-спектр метилового эфира арахидоновой кислоты, m/z: 55(49), 67(79), 79(100), 91(67), 105(30), 119(18), 133(12), 150(13), 161(3), 175(4), 203(3), 247(3), 318M+(1)
Масс-спектр метилового эфира эйкозапен-таеновой кислоты, m/z: 67(61), 79(100), 91(74), 105(33), 108(18), 119(31), 131(16), 147(12), 161(7), 175(7), 201(6), 215(4), 247(2), 316M+(0).
Литература
1. Shimizu S., Shinmen Y., Kawashima H., Akimoto K., Yamada H. // Biochem Biophys Res Commun.- 1988.- V. 150.- P. 335.
2. Shimizu S. // Appl Microbiol Biotechnol.-1989.- V. 32.- P. 1.
3. Dosanjhi B. S., Higgs D. A., Plotnikoff M. D., Markert J. R., Buckley J. T. // Aquaculture.-1988.- V. 68.- P. 325.
4. Петухова Н. И., Рахматуллина Ю. Р., Яхутова Я. Р., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.-2006.- Т. 13, № 1.- С. 95.
5. АХ. 968072. СССР, МКИ С 12 Q 1/100. / Султанович Ю. А., Нечаев А. П., Барсукова И. А. // Б. И.- 1982.- № 39.- С. 223.
6. MRS Lipid Analysis Unit [Электронный ресурс: Режим доступа: www.lipid.co.uk, свободный. -Загл. с экрана. Яз. англ.
7. Lipid bank [Электронный ресурс]: Copyright 1999-2002 International Medical Center of Japan / Japan Science and Technology Corporation all rights reserved. Режим доступа: http://lipid.bio.m.u-tokyo.ac.ip, свободный. -Загл. с экрана. Яз. англ.
