CC BY
94
Химия растительного сырья. 2006. №1. С. 59-64.
УДК 633.88
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА АНТИЯЗВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА «ВЕНТРОФИТ»
© П.Б. Лубсандоржиева , Т.А. Ажунова, Л.Н. Шантанова, А.А. Унагаева, Л.Х. Муханова
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул Сахьяновой, 6, Улан-Удэ, 670047 (Россия) E-mail [email protected]
На основе рецептуры антиязвенного сбора получено новое комплексное растительное средство, состоящее из отдельных экстрактов компонентов сбора и порошка кориандра. Антиязвенное средство «Вентрофит» содержит 1,30% дубильных веществ, 0,18% антоцианов, 15,0% водорастворимых полисахаридов, 2,12% глицирризиновой кислоты, 6,16 мг % каротиноидов. Хроматографическими методами в «Вентрофите» идентифицированы рутин, гиперозид, олеаноловая, урсоловая, кофейная, феруловая, глицирризиновая кислоты, Р-каротин.
На основе изучения качественного и количественного состава основных групп биологически активных веществ «Вентрофита» для его стандартизации выбраны спектрофотометрические методики определения флавоноидов и каро-тиноидов.
Введение
На основе изучения опыта традиционной медицины ранее был разработан состав антиязвенного сбора из 9 видов растительного сырья [4]. Для повышения фармакотерапевтической эффективности антиязвенного сбора было получено комплексное растительное средство, представляющее собой смесь экстрактов из отдельных компонентов сбора и порошка кориандра в тех же весовых частях, что и исходный сбор, и условно названное «Вентрофитом».
Цель данной работы - установление качественного и количественного содержания биологически активных веществ полученного средства для выбора методик стандартизации.
Экспериментальная часть
В состав «Вентрофита» входят: сухой экстракт из соцветий календулы лекарственной (Calendula officinalis L.) - 25 ч; сухой экстракт из листьев подорожника большого (Plantago major L.) - 10 ч; сухой экстракт из травы сушеницы топяной (Gnaphalium uliginosum L.s.l.) - 5 ч; сухой экстракт из корней солодки (Glycyr-rhiza glabra L.) - 10 ч; сухой экстракт из корней девясила (Inula helenium L.) - 5 ч; сухой экстракт из плодов боярышника (Crataegus L.) - 15 ч; сухой экстракт из плодов шиповника (Rosa L.) 20 ч; сухой экстракт из плодов облепихи (Hippophae rhamnoides L.) - 5 ч; мелкоизмельченный порошок плодов кориандра (Co-riandrum sativum L.) - 5 ч. Сухие экстракты из отдельных компонентов сбора получены в лаборатории медико-биологических исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. Параметры экстракции приведены в таблице 1.
Для получения сухих экстрактов растительный материал измельчали до размера частиц 1-2 мм, загружали в экстрактор, заливали экстрагентом в объеме, соответствующем соотношению сырье : экстрагент для каждого вида сырья, экстрагировали при температуре, подобранной для каждого вида, при постоянном помешивании. Извлечение фильтровали в сборник, к шроту добавляли экстрагент в объеме, равном слитому. Экстракцию повторяли в условиях, указанных в таблице 1. Извлечения фильтровали, объединяли, концентрировали до 1/10 первоначального объема, высушивали в вакуум-сушильном шкафу при определен-
* Автор, с которым следует вести переписку.
ной температуре. Полученный сухой экстракт измельчали. Плоды Coriandrum sativum L. измельчали до размера частиц 0,25-0,5 мм и использовали в виде порошка, так как при экстракции, удалении растворителя, вакуумной сушке основные действующие вещества - эфирные масла могут улетучиться. Взвешенные количества сухих экстрактов смешивали с порошком кориандра и тщательно перемешивали.
Экстрактивные вещества, извлекаемые из антиязвенного сбора последовательной экстракцией, составляют: гексаном - 4,38%; хлороформом - 2,01%; 96%-ным спиртом - 14,37%; водой - 19,44% (в сумме -40,40%). Из исходного антиязвенного сбора методом мацерации 40% этанолом (I экстракция при температуре 18-20 °С, II - 60 °С, III - 90 °С, соотношение сырье :экстрагент - 1:10) получен сухой экстракт. Выход экстракта из сбора - 38,0% от исходной массы сбора.
Для изучения качественного состава «Вентрофита» и экстракта из сбора хроматографическими методами получены гексановая (каротиноиды), хлороформная (тритерпеновые кислоты, агликоны флавоноидов), этилацетатная (гликозиды флавоноидов, фенолокислоты) фракции. Использованы системы растворителей: для тонкослойной хроматографии на силикагеле (ТСХ) - бензол - этилацетат - метанол (50 : 1 : 1) - I; бензол - ацетон (8 : 2) - II; бензол - метанол (9 : 1) - III; бензол - диэтиловый эфир (1 : 1) - IV); гексан -этилацетат (7 : 3) - V; гексан - этилацетат - муравьиная кислота (15 : 9 : 2) - VI; этилацетат - муравьиная кислота - уксусная кислота - вода (100 : 11 : 11 : 26) - VII; бензол - этилацетат (2 : 1) - VIII; толуол - этил-ацетат (93 : 7) - IX; для бумажной двумерной хроматографии (БХ) - 15% уксусная кислота - X; 1-бута-нол - уксусная кислота - вода (4 : 1 : 2) - XI; Для обнаружения сесквитерпеновых лактонов использованы 20% раствор фосфорномолибденовой кислоты, 1% раствор ванилина в концентрированной серной кислоте, тритерпеновых соединений - 20% раствор фосфорновольфрамовой кислоты - ФВК, фенолокислот - пары аммиака. Для идентификации БАВ использованы достоверные образцы химически чистых веществ.
Таблица 1. Условия экстракции отдельных компонентов антиязвенного сбора для получения сухих экстрактов из них
Наименование Степень измельче- Тип экстрагента, Соотношение Температура Кратность и время экстракции
сырья ния сырья, мм концентрация сырье : экстрагент экстракции, оС
Calendula offi- 1-2 мм Этанол -80% (1-11 экс- 1:10 18-20 (I- IV экс- По 2 ч четыре
cinalis L.(со- тракции), 50% (Ш-1У тракции) экстракции
цветия) экстракции)
Rosa L. 0,5-1,0 мм Этанол 96%(1—11 экс- 1 :1 0 18-20 (I-II экс- По 2 ч четыре
(плоды) тракции), вода (Ш-1У) тракции), 30-40 (III-IV) экстракции
Crataegus L. 2,0 мм Этанол 1:20-1:21 35-40 По 6 ч две экс-
(плоды) I пример -38% II пример -40% III пример -42% тракции
Plantago major 3,0 мм Вода очищенная 1:18-1:20 95 ± 2 По 1,5 ч две
L. (листья) экстракции
Glycyrrhiza 1,0-2,0 мм Этанол 1:14-1:15 95 ± 2 По 1 ч две экс-
glabra L. Кор- I пример - 40% тракции
ни и корне- II пример -42%
вища III пример -45%
Gnaphalium 1,0-2,0 мм Этанол 1:10-1:12 95 ± 2 По 1 ч две экс-
uliginosum I пример -40% тракции
L.s.l. (трава) II пример - 43% III пример-45%
Hippophae 0,5-1,0 мм Этанол 1:10-1:12 95 ± 2 По 1 ч три экс-
rhamnoides L. I пример -38 % тракции
(плоды) II пример -40% III пример -45%
Inula helenium 2,0 мм Этанол 1:20-1:22 95 ± 2 По 2 ч две экс-
L. (корни и I пример -35% тракции
корневища) II пример -40% III пример-45%
Количественное определение БАВ в «Вентрофите» и экстракте из сбора проведено по описанным в литературе методам: флавоноидов, дубильных веществ, антоцианов, водорастворимых полисахаридов - по методикам Государственной Фармакопеи СССР XI изд. (ГФ XI); аскорбиновой кислоты - фотоколоримет-рическим методом [9]; каротиноидов [2], тритерпеновых сапонинов [7], кумаринов [11] - спектрофотометрическим методом; глицирризиновой кислоты [12], рутина, гиперозида [3, 5] - хроматоспектрофотометрическим методом. Данные анализов приведены в таблице 2.
Определение флавоноидов. 5,0 г (точная навеска) «Вентрофита» обработали 200 мл гексана (4 раза по 50 мл), затем хлороформом (4 раза по 100 мл), остаток экстракта растворяли в горячей воде, отфильтровали, после охлаждения обработали этилацетатом (4 раза по 50 мл). Извлечения концентрировали на роторном испарителе, сухой остаток растворяли в 50 мл 70%-ного этанола. В извлечениях определяли содержание флавоноидов спектрофотометрическим методом с использованием реакции комплексообразования флавоноидов с хлоридом алюминия при 410 нм (ГФ XI).
Для определения содержания гиперозида и рутина 0,5 г экстракта растворяли в 50 мл 70 %-ного этанола. Хроматографическую пластинку с закрепленным слоем силикагеля делили на четыре полосы. Первая полоса служила фоном (холостой опыт), на вторую наносили 0,2 мл спиртового раствора экстракта, на третью - пробы стандартных веществ - гиперозида и рутина. Для хроматографического разделения флаво-ноидов на тонком слое силикагеля использована система растворителей этилацетат - муравьиная кислота -уксусная кислота - вода (100 : 11 : 11 : 26). Параллельно хроматографировали аликвоты «свидетелей» - по 0,1 мл 0,05% спиртовых растворов рутина и гиперозида. Пятна флавоноидных гликозидов рутина (Rf -
0,35) и гиперозида (Rf - 0,6) на уровне «свидетелей» соскабливали с пластинки, элюировали 10 мл 50% этанола. В УФ спектре элюатов наблюдаются максимумы поглощения при 363-365 нм, характерные для рутина и гиперозида. Данные анализов приведены в таблице 3.
Результаты и обсуждение
В отдельных фракциях экстрактов хроматографическими методами в присутствии достоверных образцов идентифицированы: рутин, Rf - 0,35 (ТСХ, VII); 0,48 (БХ, X); 0,18 (БХ, XI); гиперозид, Rf - 0,60 (ТСХ, VII); 0,30 (БХ, X); 0,41 (БХ, XI); олеаноловая кислота, Rf - 0,40 (ТСХ, II); 0,65 (ТСХ, VIII); урсоловая кислота, Rf - 0,55 (ТСХ, VIII); кофейная кислота, Rf - 0,46 (ТСХ, VI); 0,48 (БХ, X); 0,70 (XI); феруловая кислота, Rf - 0,28 (ТСХ, VI), 0,23 (БХ, X); 0,78 (БХ, XI); глицирризиновая кислота, Rf - 0,36 (ТСХ, XIII); Р-каротин, Rf - 0,9 (ТСХ, II, IV, V).
Гексановая фракция «Вентрофита» составила 7,95%, хлороформная - 26,73%, этилацетатная - 11,92%, водная - 38,65% от исходной массы. В «Вентрофите» содержание липофильных веществ больше, чем в экстракте, полученном из сбора (табл. 2).
Известно, что антиязвенными свойствами обладают сумма флавоноидов из соцветий календулы (Ка-лефлон); плантаглюцид - полисахаридный комплекс из листьев Plantago major L.; облепиховое масло из плодов Hippophae rhamnoides L.; холосас и каротолин из плодов Rosa L. [6]; сумма сесквитерпеновых лак-тонов Inula helenium L. - Алантон [10]. Антиязвенными и противовоспалительными свойствами обладают и индивидуальные соединения, содержащиеся в компонентах сбора. Так, урсоловая кислота оказывает противовоспалительное действие, ограничивает распространение язв, ингибирует рост раковых клеток, проявляет антивирусные, иммуномодулирующие свойства [8]. Глицирризиновая кислота Glycyrrhiza glabra L. обладает противовоспалительной и антиязвенной активностью [1]. Наиболее эффективны при язвенной болезни флавоноиды, обладаюшие широким спектром фармакологической активности: антиязвенной, спазмолитической, антимикробной, противовоспалительной [13, 14].
Для стандартизации «Вентрофита» с учетом вклада отдельных групп веществ в антиязвенный эффект выбраны спектрофотометрические методы определения флавоноидов (ГФ XI) и каротиноидов в пересчете на Р-каротин [2]. Выбранные методы в отличие от других менее трудоемки и не требуют дорогостоящих реактивов, сорбентов и растворителей.
Большая часть флавоноидных веществ содержится в водорастворимой фракции «Вентрофита»: в экстракте после удаления липофильной фракции гексаном и хлороформом содержание флавоноидов не уменьшается (табл. 3). Доминирующие флавоноидные гликозиды в «Вентрофите» - рутин и гиперозид содержатся в соотношении 2,3:1,0 и в качестве стандартного вещества выбран рутин.
Таблица 2. Количественное содержание биологически активных веществ в экстрактах
Наименование Биологически активные вещества в экстрактах
«Вентрофит» Сухой экстракт из сбора
Дубильные вещества, в пересчете на таннин, % Антоцианы, в пересчете на цианидин- 3,5-диглюкозид, % Тритерпеновые сапонины, в пересчете на урсоловую кислоту, % Водорастворимые полисахариды, % Кумарины, в пересчете на скополетин, % Глицирризиновая кислота, % Каротиноиды, в пересчете на Р-каротин, мг % 1,30 ± 0,06 0,18 ± 0,01 0,072 ± 0.001 15,0 ± 0,4 0,078 ± 0.001 2,12 ± 0.02 6,16 ± 0,11 1,33± 0.05 0,38 ± 0.02 0,058 ± 0,001 3,46 ± 0.10 0,070 ± 0,001 6,79 ± 0,10 0,90 ± 0,01
Таблица 3. Количественное содержание флавоноидов в извлечениях из экстрактов
Наименование Флавоноиды, в пересчете на рутин, в %
Вентрофит Экстракт сухой из сбора
Исходный экстракт 2,26 ± 0.01 2,74 ± 0.01
Хлороформная фракция 0,062 ± 0.001* 0.007 ±0.001*
Этилацетатная фракция 1,54 ± 0.01 1,03 ± 0.01
Водная фракция 1.38 ± 0.01 0,94 ± 0,01
Экстракт, после удаления липофильных 2,23 ±0.02 1,88 ±0.02
веществ
Рутин в экстракте 0.39 ± 0.02 0.38 ± 0.02
Гиперозид в экстракте 0,17 ± 0.01 0.19 ± 0.01
* В пересчете на лютеолин.
Для количественного определения флавоноидов в «Вентрофите» достаточно 2-кратной экстракции 70% этанолом в соотношении сырье : экстрагент (1 : 50) и при температуре водяной бани 80-90 °С. Относительная ошибка среднего результата количественного определения флавоноидов в «Вентрофите» составляет 0,62%, отдельного - 2,07%.
В УФ спектрах гексановых извлечений «Вентрофита» наблюдается максимум поглощения при 450 нм, характерный для Р-каротина. Подобраны оптимальные условия для наиболее полной экстракции кароти-ноидов из «Вентрофита». Данные анализа приведены в таблице 4. При однократной экстракции кароти-ноидов гексаном в соотношении 1 : 20 извлекается 74,5%, при второй экстракции (соотношение сырье : экстрагент - 1 : 20) извлекается 15,2% каротиноидов от содержания в исходном экстракте. Третья экстракция (1 : 20) извлекает 9,0% каротиноидов, поэтому для максимального извлечения каротиноидов достаточно 2-кратной экстракции при соотношении сырье : экстрагент 1 : 20, первая экстракция проводится в течение 2 ч, вторая - 0,5 ч. Относительная ошибка среднего результата определения каротиноидов в «Вентрофите» составляет 1,18%, отдельного определения - 3,03%.
Таблица 4. Подбор условий для количественного определения каротиноидов в «Вентрофите»
Испытуемый параметр Каротиноиды, в пересчете на Р-каротин, мг % (а..с.с.)
1 2
1. Соотношение сырье : экстрагент
1 : 10, время экстракции - 2 ч 5,67
1 : 20 6,20
1 : 25 6,64
2. Кратность экстракции, время каждой экстракции - 2 ч
I. 1). 1 : 10 5,678
2) 1 : 10 1,627
3) 1 : 10 0,474
Итого : 1 : 30 Итого: 7,778 мг%
II. 1) 1 : 15 5,832
2) 1 : 15 0,985
3) 1 : 15 0,576
Итого: 1 : 45 Итого : 7,394
III. 1) 1 : 20 6,277
2) 1 : 20 1,283
3) 1 : 20 0,763
Итого: 1 : 60 Итого : 8,323
Продолжение таблицы 4
1 2
IV. 1). 1 : 25 6,643
2). 1 : 25 1,308
3). 1 : 25 0,475
Итого: 1 : 75 Итого: 8,436 мг%
3. Время экстракции, соотношение 1 : 20
1. 60 мин 5,22
2. 90 мин. 5,35
3. 120 мин 5,44
4. 150 мин 5,41
Время второй экстракции, первая - 2 ч
1. 30 мин 1,253
2. 60 мин 1,254
3. 90 мин 1,259
Таблица 5. Количественное содержание флавоноидов и каротиноидов в «Вентрофите»
Серия Влажность, % Флавоноиды, в пересчете на рутин, % Каротиноиды, в пересчете на Р-каротин, мг%
07.06.04. 3,92 2,26 6,18
10.05.04. 3,45 2,98 6,57
14.06.04. 3,87 2,09 5,98
02.07.04. 3,55 2,23 6,50
13.09.04. 3,82 2,42 6,36
В таблице 5 приведены данные о содержании флавоноидов и каротиноидов в «Вентрофите» в разных сериях. Полученные данные показывают, что содержание флавоноидов в суммарном экстракте должно быть не менее 2%, каротиноидов - не менее 5 мг%.
Выводы
Антиязвенное средство «Вентрофит» содержит 1,30% дубильных веществ; 0,18% антоцианов; 15,0% водорастворимых полисахаридов; 2,12% глицирризиновой кислоты; 6,16 мг % каротиноидов. Хроматографическими методами в «Вентрофите» идентифицированы рутин, гиперозид, олеаноловая, урсоловая, кофейная, феруловая, глицирризиновая кислоты, Р-каротин.
На основе изучения качественного и количественного состава основных групп биологически активных веществ «Вентрофита» для его стандартизации предлагаются спектрофотометрические методы определения флавоноидов и каротиноидов.
Список литературы
1. Давыдова В.А., Балтина Л.А., Сердюк Н.Г. и др. Противовоспалительные и противоязвенные свойства новых эфиров глицирризиновой кислоты // Химико-фармацевтический журнал. 1997. №8. С. 23-25.
2. Евдокимова О.В., Самылина И.А., Нестерова О.В. Определение содержания суммы фосфолипидов и каротиноидов в плодах некоторых видов боярышника // Фармация. 1992. № 6. С. 70-72.
3. Левашова И.Г., Комиссаренко В.П., Жданова В.П., Шатунов Л.В. Гиперозид - как стандарт для контроля качества лекарственных средств и средств медицинского микроанализа // Проблемы стандартизации и контроля качества лекарственных средств. М., 1991. Т. 2, ч. 2. С. 37-38.
4. Лубсандоржиева П.Б., Унагаева А.А., Муханова Л.Х., Шантанова Л.Н., Ажунова Т.А. Создание антиязвенно-го сбора и содержание в нем биологически активных веществ // Развитие традиционной медицины в России. Улан-Удэ, 2004. С. 71-72.
5. Лукьянчиков М.С. Количественное определение флавоноидов в некоторых представителях семейства Fa-baceae // Химия природных соединений. 1984. №1. С. 43.
6. Машковский М. Д. Лекарственные средства: В 2 т. 14-е изд. М., 2000. Т. 1. 540 с.; Т. 2. 608 с.
7. Муравьев И.А., Шатило В.В., Семенченко В.Ф. Спектрофотометрический метод количественного определения урсоловой кислоты // Химия природных соединений. 1972. №6. С. 738.
8. Покровский А.Г., Ильичева Т.Н., Проняева Т.Р. и др. Иммуномодулирующая активность производных урсоловой кислоты //Доклады Академии наук. 1999. Т. 369. №3. С. 414-415.
9. Приступа Е. А., Понов Д. М. Совершенствование технологии приготовления и контроля качества витаминных чаев // Актуальные проблемы фармацевтической технологии: Науч. труды ВНИИФ. М., 1994. Т. XXXII. С. 151-159.
10. Соколов С.Я., Замотаев И.П. Справочник но лекарственным растениям {Фитотерапия). М., 1990. 428 с.
11. Чемесова И.И., Чубарова С.Л., Саканян Е.И. и др. Спектрофотометрический метод количественной оценки содержания полифенолов в сухом экстракте из надземной части Melilotus officinalis {L.) Pall. и в его лекарственной форме {таблетках) // Растительные ресурсы. 2000. Т. 36. Вып. 1. С. 86-91.
12. Якубова М. Р., Генкина Г.Л., Шакиров Г.Г. УФ спектрофотометрическое определение глицирризиновой кислоты в Glycyrrhiza glabra // Химия природных соединений. 1977. №6. С. 802-806.
13. Brasseur T. Medikaments renfermant des flavonoids // J. Pharm. Belg. 1989. V. 44. №6. P. 403-410.
14. Elliott Middleton Jr. The flavonoids // Trends in Pharmac. Sci. 1984. Vol. 5. №8. P. 335-338.
Поступило в редакцию 11 октября 2005 г.
После переработки 24 марта 2005 г.
