CC BY
7
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 1994
УДК 615.285.7.015.4.076.9
В. В. Сперанский, Т. Н. Сперанская, С. Д. Жамсаранова, Ц. Д. Гончикова
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ
СВЯЗАННЫХ ФОРМ 2,4-Д
Восточно-Сибирский технологический институт, Улан-Удэ
В последние годы «связанные» или «неэкстра-гируемые» пестициды привлекают все большее внимание исследователей. Экстракция и идентификация этих соединений традиционными химико-аналитическими методами затруднены. В результате истинное содержание пестицидов в объектах остается неопределенным.
Биологический и токсикологический эффект этих форм не установлен. Работами ряда исследователей, использовавших пестициды, меченные изотопами, было показано, что значительная часть их находится в растениях в связанном виде [4, 12, 13]. Основными локусами присоединения, по мнению авторов, являются лигнин, крахмал, гемицел-люлоза, пектиновые полисахариды [7, 11]. Основная часть связанных форм пестицидов, в частности, нитрофена, ЭШЕР, профамфенила, пропа-нил-фенила, атразина [9, 10, 13], при скармливании крысам удалялась с фекалиями и была биологически малоэффективной. По-видимому, это связано с тем, что лигнин, гемицеллюлоза и пектиновые полисахариды не расщепляются и не перевариваются в организме крыс.
При изучении метаболизма пестицидов в организме у млекопитающих были также обнаружены неэкстрагируемые формы препаратов. Уровень связывания зависел от активности цитохром-Р45о-монооксигеназной системы [5].
Наиболее распространенными белками, способными связываться с активизированными молекулами пестицидов, являются альбумины крови, однако пестициды могут конъюгироваться и с другими соединениями. Так, 12Р, ¿БЛ-изомер фен-
валерата образует липофильный конъюгат соответствующего эфира с холестеролом. Этот конъюгат способен проникать в надпочечники, печень, лимфатические узлы и селезенку [8].
Биологический эффект связанных форм пестицидов, присутствующих в органах и тканях, а также в продуктах животного происхождения, не установлен и не регламентируем. Не изучено также токсикологическое действие этих форм препаратов.
Цель нашей работы — изучение биологической и токсикологической активности связанных форм пестицидов на модели конъюгата 2,4-Д с альбумином и казеином.
Общее содержание 2,4-Д определяли на жидкостном хроматографе высокого давления («Kobo», ЧСФР). Подготовку экстрактов проводили по методу, предложенному для газовой хроматографии [2]. Метод основан на экстракции 2,4-Д органическим растворителем из гидролизо-ванной пробы. Гидролиз проводили 6 н. соляной кислотой в течение 1 ч на кипящей водяной бане. Данным методом можно определить как свободную 2,4-Д, так и находящуюся в связанном состоянии.
Содержание свободной 2,4-Д определяли после экстракции водным аммиаком с последующими очисткой, переэкстракцией органическим растворителем [1] методом жидкостной хроматографии высокого давления.
Ковалентное связывание гербицида 2,4-Д с белком проводили методом, основанным на реакции ацилирования по схеме:
се
се -/~1оснг<° ce^pCocHrct0 ^^ \=/ он \=/ се
се
се-^ V осн2- с - nh - белок
о также: X-J 2 qj_j H2S0¡) \—/ ¿ 4QH
no2
ce Q o ce
сен0_осн-<°н H-c-(ct%c-H, HOQc-CHrQ-^jV-ce. í«^ nh2 ce 0H ^N=C4CH2V<H
hooc-ch2-o -\~\-Ct
^^ NH- (CH2)S - NH - белок
Контроль за реакцией осуществляли на жид- 4 °С против дистиллированной воды в течение 3 сут костном хроматографе высокого давления. с многократной сменой диализующей жидкости.
Синтезированный конъюгат диализовали при Концентрацию белка в растворе конъюгата оп-
ределяли по Лоури, а число ковалеитно связанных молекул гаптена с 1 молекулой белка но содержанию свободных аминогрупп в белке по реакции с 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой [6]. Эпитопная плотность в синтезированных конъюгатах была равна [13].
Для подтверждения образования ковалентной связи 2,4-Д — аминокислота были сняты спектры на спектрофотометре ИКС-29 в диапазоне 4200— 400 см"1.
При получении конъюгата методом ацилирова-ния происходит замена хлорангидридной связи на амидную, о чем свидетельствует наличие полосы, характерной для амидной связи С—N при 1530 см"1.
Биологическую оценку синтезированных конъю-гатов 2,4-Д в разных дозах проводили на крысах-в отъемышах (самцах). Опыты ставили на белых
крысах-отъемышах (самцах) линии Вистар со средней массой 40—45 г. Определяли такие показатели, как привесы, скорость роста, массовые показатели органов, средняя продолжительность жизни, динамика выведения 2,4-Д с фекалиями и мочой [3]. Животные получали рацион, сбалансированный по содержанию пищевых веществ и не содержащий остатки 2,4-Д. Скорость роста животных определяли по формуле:
1пР,—1пЯ0
где г — скорость роста; Ро — исходная масса, Р, — масса через определенный промежуток времени, / — время (в сут).
Токсикологическую характеристику конъюгиро-ванных форм гербицида 2,4-Д определяли на инфузориях Тетрахимена пириформис, находящихся в логарифмической фазе роста, и на культуре клеток макрофагов.
Инфузории уже давно используются для токсикологической оценки вредных веществ. При этом часто применяют Тетрахимена пириформис, не только потому, что данный вид чувствителен к воздействиям вредных веществ, но и потому, что необходимы наблюдения на изолированных популяциях репрезентативных представителей пищевой цепи.
Культуру перитонеальных макрофагов мышей мы использовали как тест-систему для оценки токсикологических свойств полученных конъюга-тов.
При изучении токсических свойств синтезированных конъюгатов белок — 2,4-Д препарат вносили в сбалансированный полноценный рацион животных.
В качестве сравнения были взяты 2 группы крыс. Животные 1-й группы получали ежедневно 0,1 % водный раствор казеина перорально по 1 мл, 2-й — по 1 мл раствора 2,4-Д в подсолнечном масле, содержащего 0,01 мг 2,4-Д.
Подопытные животные ежедневно получали перорально по 1 мл водного раствора конъюгата казеин — 2,4-Д, содержащего 0,001, 0,01 и 0,1 мг 2,4-Д.
Рацион всех животных был сбалансирован по содержанию пищевых веществ и содержал картофельный крахмал, казеин, подсолнечное масло, свиной жир, смесь необходимых витаминов, макро- и микроэлементов.
Корм и воду животные получали без ограничений, за ними вели ежедневное наблюдение, учитывали состояние шерстного покрова, внешний вид, потребление корма, выживаемость. Крыс взвешивали на 3, 7, 14, 21 и 28-е сутки опыта, в эти же дни проводили учет несъеденного корма и сбор фекалий.
Динамика массы тела экспериментальных животных является чувствительным критерием оценки состояния организма в ответ на введение ксенобиотика. В нашем эксперименте у всех крыс-отъемышей, получавших перорально конъю-гат, отмечена статистически достоверная тенденция к снижению привесов относительно контроля (табл. 1). Привесы у подопытных животных менялись в зависимости от дозы и формы препарата. При поступлении 2,4-Д резкое снижение привесов отмечали лишь на 3-й сутки опыта, на 7-е сутки привесы практически не отличались от контроля, а далее наблюдали постоянное превышение привесов относительно контроля. При поступлении конъюгата в первые дни опыта (на 3-й и 7-е сутки) отмечали четкую обратную зависимость: чем больше доза, тем меньше привесы. Но к концу опыта разница в привесах у крыс, получавших разные дозы, сглаживалась и такой четкой зависимости от дозы не отмечалось. Эти результаты совпадают с данными о скорости роста крыс под влиянием 2,4-Д и конъюгата 2,4-Д — казеин (табл. 2).
Средняя продолжительность жизни крыс-отъ-емышей, получавших конъюгат, достоверно меньше, чем контрольных животных (табл. 3), и здесь также отмечается обратная зависимость от дозы. Средняя продолжительность жизни крыс, получавших максимальную дозу конъюгата, почти на 30 % ниже, чем у контрольных животных.
По внешнему виду и поведению животных, получавших 2,4-Д в дозе 0,01 мг и конъюгат в дозе 0,001 и 0,01 мг на 1 животное, практи-
Таблица 1
Привесы крыс-отъемышей, получавших перорально 2,4-Д и конъюгат 2,4-Д—казеин (в % к контролю)
Препарат Доза, мг День опыта
3-й 7-й 14-й 21-й 28-й
2,4-Д 0,01 44,41 99,22 122,88 209,64 124,62
Конъюгат 0,001 40,00 82,35 29,58 89,88 26,94
» 0,01 26,67 62,35 83,27 70,12 32,18
» 0,1 13,33 15,29 32,73 71,68 34,62
Таблица 2
Скорость роста крыс-отъемышей, получавших 2,4-Д и конъюгат 2,4-Д — казеин (в % к контролю)
Препарат Доза, мг День опыта
3-й 7-й 14-й 21-й 28-й
2,4-Д Конъюгат » » 0,01 0,001 0,01 0,1 72,44 69,85 61,99 31,00 74,87 63,81 54,55 17,46 65,45 206,98 126.55 24,77 80,83 30,47 86,18 92,05 45,11 41,40 94,37 44,25
4
—27—
Таблица 3
Средняя продолжительность жизни крыс-отъемышей, получавших 2,4-Д и конъюгат 2,4-Д—казеин
Таблица 4
Содержание 2,4-Д в экскретах крыс (в % к введенному количеству)
Средняя
Препарат Доза, мг продолжительность жизни
(в % к контролю)
2,4-Д Конъюгат
0,01 0,001 0,01 0,1
92,65±0,67 95,06±0,22 83,87±0,51 70,64 ±0,84
чески не отличались от контрольных. У крыс, получавших максимальную дозу конъюгата 0,1 мг, в первые дни опыта отмечали более редкий шерстный покров, вялый вид, худшую поедае-мость корма, чем у контрольных животных. При вскрытии погибших животных, получавших 0,1 мг конъюгата (по 2,4-Д), были обнаружены признаки геморрагического диатеза серозных оболочек внутренних органов, увеличения лимфатических узлов и селезенки, венозного застоя в легких и предсердиях, общей дистрофии.
При изучении относительной массы внутренних органов крыс-отъемышей, получавших конъюгат в разных дозах, не выявлено существенных изменений по сравнению с контролем по таким органам, как печень, почки, сердце, легкие и селезенка.
Что касается органов иммунной системы, то отмечено достоверное увеличение массы тимуса у животных, получавших конъюгат в дозе 0,001 и 0,01 мг, на 10-е сутки, в дозе 0,1 мг — на 28-е сутки и лимфатических узлов — на 28-е сутки для всех групп крыс, получавших конъюгат.
Для изучения динамики экскреции из организма белых крыс 2,4-Д при 28-дневном его введении были собраны фекалии и моча крыс на 3, 7, 14, 21, 28 и 30-е сутки после начала эксперимента. В собранных экскретах определяли общее содержание 2,4-Д (связанной и свободной форм), а также метаболитов после гидролиза пробы 6 н. соляной кислотой и содержание свободных форм 2,4-Д после экстракции водным раствором аммиака.
В табл. 4 приведены данные о содержании 2,4-Д в моче и фекалиях крыс в разные сроки опыта и при введении разных форм 2,4-Д. Как видно, характер кривых выведения-2,4-Д и ее метаболитов из организма для
Срок опыта, сут Моча Кал Суммарное содержание
свободное общее свободное общее
Контроль
3—30 н/о н/о н/о н/о 0
2,4-Д
3 н/о 36,6 н/о 5,9 42,5
7 н/о 40,8 н/о 6,7 47,5
14 н/о 55,5 н/о 5,8 61,3
21 н/о 27,0 н/о 5,3 32,3
28 н/о 24,3 н/о 3,6 27,9
30 н/о 13,4 н/о 1,9 15,3
Конъюгат
3 н/о 32,0 н/о 20,5 52,6
7 н/о 35,7 8,3 19,7 55,4
14 н/о 33,5 11.1 16,6 50,1
21 н/о 33,4 12,2 16,1 49,5
28 н/о 21,4 8.4 9,5 30,9
30 н/о 7,9 2,7 8,5 16,4
Примечание, н/о — не обнаружено.
химически чистой 2,4-Д и искусственно синтезированного конъюгата 2,4-Д — казеин заметно различается.
Экскреция 2,4-Д из организма крыс зависит от дозы препарата, поступающего при затравке. При введении 0,1, 0,01 и 0,001 мг конъюгата на животное отмечено дозозависимое выделение 2,4-Д из организма. Наибольшее количество выделенного из организма 2,4-Д обнаружено при введении 0,1 мг конъюгата.
Динамика выведения препарата при этом характеризуется 2 пиками (на 7-й и 28-й дни эксперимента). А характер экскреции 2,4-Д при выведении им конъюгата 2,4-Д в дозе 0,01 и '0,001 мг имеет тенденцию к увеличению на 3-й сутки опыта, а затем отмечено постепенное уменьшение вплоть до 30-го дня опыта. Наибольшее количество препарата выводится с мочой, в основном в связанном виде. Экскреция с фекалиями обнаруживается в меньшей степени. Учитывая, что 2,4-Д вводится в виде конъюгата с белком, можно предположить, что конъюгат подвергается расщеплению в желудочно-кишечном тракте и 2,4-Д через кровь поступает в органы и ткани подопытных животных. В пользу этого свидетельствует наличие в фекалиях сво-
Таблица 5
Морфологическая и количественная характеристика популяций Тетрахимена пириформис при разных сроках инкубации (в динамике роста) под влиянием препаратов в дозе 7,5 мкг/мл
Препарат Время инкубации
15 мин 1 ч 24 ч
Казеин Морфологических
(43 200±2 631) Норлейцин Без изменений
2,4-Д Особи в популяции с замедленным
движением, есть деформированные
Конъюгат Масса лизированных клеток, есть 2,4-Д— живые деформированные клетки
норлейцин (24 000±2 162)
изменений нет Без изменений (51 200± 1824)
Без изменений
Наблюдаются деформированные особи с заторможенным движением (15 200±447,25) Замедленное, «блуждающее» движение, есть лизированные и мертвые особи (12 800+758,25)
Нормальное развитие культуры
(548 400±17 484) Без изменений
Наблюдается заторможенность в движениях (144 000+8 093)
Такая же картина (18 800±1 096)
Примечание. В скобках — число клеток (М±т).
брдного препарата наряду со связанными формами 2,4-Д.
При сравнительном введении конъюгирован-ной и свободной форм 2,4-Д в одной дозе динамика экскреции препарата из организма крыс была различна. При воздействии конъюгирован-ной формы 2,4-Д характерно большее выделение с фекалиями как связанной, так и свободной 2,4-Д по сравнению с введением свободной 2,4-Д. А экскреция с мочой при введении конъюгированной формы препарата меньше, чем при затравке животных раствором 2,4-Д.
Общий объем выделенного из организма препарата при затравке животных в течение 28 дней конъюгированной формой 2,4-Д на 12 % больше, чем при введении раствора 2,4-Д. Это достигается за счет увеличения выделений с фекалиями при незначительном уменьшении выделяемого с мочой 2,4-Д.
Учитывая показатели привеса и среднюю продолжительность жизни животных в группах, следует отметить, что наряду с увеличением количества 2,4-Д, выводимого из организма с фекалиями, и соответственно общего количества 2,4-Д конъюгированные формы 2,4-Д обладают большей токсичностью для организма. Опыты на Тетрахимене пириформис и культуре макрофагов подтверждают полученные данные (табл. 5).
Определение токсичности конъюгированных форм 2,4-Д на инфузории Тетрахимена пири-; формис было проведено на конъюгатах 2,4-Д — норлейцин и 2,4-Д — казеин в диапазоне концентраций 0,0075—75 мкг/мл. Морфологическая и количественная характеристики популяций Тетрахимена пириформис под влиянием препаратов приведены в табл. 5, из которой видно, что токсичность 2,4-Д, ковалентно связанной с норлейцином или с казеином, усиливалась по сравнению со свободной 2,4-Д. При этом через 24 ч численность клеток под воздействием дозы 2,4-Д 7,5 мкг/мл уменьшалась на 73,7 %, а под воздействием конъюгатов 2,4-Д — норлейцин в той же концентрации — на 96,6 % и 2,4-Д — казеин — на 87,4 %.
Токсичность связанных форм пестицидов, по-видимому, зависит от метода конъюгирования или типа связи. Нами были получены конъюгаты 2 типов. Токсичность этих конъюгатов определяли на культуре Тетрахимена пириформис. Результаты опытов свидетельствуют о разной токсичности полученных комплексов. Конъюгаты, полученные через хлорангидрид 2,4-Д, обладали большей токсичностью на инфузориях Тетрахимена пириформис. Однако трудно предполагать преимущественное образование в организме
того или иного конъюгата. Необходимы дополнительные экспериментальные данные.
При инкубации культуры перитонеальных макрофагов мышей с конъюгатом 2,4-Д — человечий сывороточный альбумин (ЧСА) была исследована фагоцитарная активность макрофагов в отношении культуры Staph, aureus в концентрациях 1, 10 и 100 мкг/мл. Полученные результаты показали, что конъюгированная форма 2,4-Д и по интенсивности, и по активности фагоцитоза давала более выраженный токсический эффект, чем свободная форма 2,4-Д. Так, если активность фагоцитоза под влиянием 2,4-Д в концентрации 100 мкг/мл уменьшалась по сравнению с контролем на 4,5 %, то при воздействии конъюгата 2,4-Д — ЧСА в той же •концентрации она снижалась на 24,7 %. Интенсивность фагоцитоза при действии 2,4-Д уменьшалась на 22,6 %, а при воздействии 2,4-Д — ЧСА — на 39,5 %.
Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют, что конъюгированные формы гербицида 2,4-Д являются биологически активными и обладают большей токсичностью, чем свободная. Токсичность связанных форм пестицидов зависит от химической природы конъюгирования. При контроле и регламентации остаточных количеств пестицидов в продуктах питания, особенно детского и диетического, необходимо учитывать наличие связанных форм пестицидов.
Литература
1. Крамаренко В. Ф., Туркевич В. М. Анализ ядохимикатов,— М„ 1978,— С. 90—91.
2. Лабораторные исследования в ветеринарии: Химико-токсикологические методы: Справочник / Под ред. Б. И. Антонова,— М„ 1989,— С. 210—217.
3. Методические указания по биологической оценке продуктов питания.— Минск, 1984.
4. Balba H. M., Still G. G., Mansager E. R. // J. Ass. off. analyt. Chem.— 1979,— Vol. 62,— P. 237.
5. Catinot R.. Sonnier M., Do-Cao-Thang. Synthesis and Application of Isotopically Lobelled Compounds.— Amsterdam, 1989,— P. 657.
6. Habeen A. F. // Analyt. Biochem.— 1966,— Vol. 14,— P. 328.
7. Haque A., Weisgerber ]., Klein W. // Chemosphere.— 1976,— Vol. 5.— P. 167.
8. Kaneko Hideo // J. pestic. sei.— 1988,— Vol. 13,— P. 3.
9. Khan S. U„ Kacew S., Molnar S. J. // J. Agricult. Food Chem.— 1985,— Vol. 33.— P. 712.
10. Paulson G. D., Jacobsen A. M., Still G. G. 11 Pestic. Biochem. Physiol.— 1975,— Vol. 5,— P. 523.
11. Pillmoor J. В., Gaunt J. К., Roberts T. R. Ц Pestic. Sei.— 1984.— Vol. 15.— P. 375.
12. Registration of pesticides in the United States.— Proposed Guidelines // Fed. Reg.— 1975.— Vol. 40,— P. 123.
13. Sutherland M. Z. // Amer. Chem. Soc. Symp. Ser.— 1976,— Vol. 29,— P. 153.
Поступила 30.06.93
