CC BY
265
ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНАЯ ЭКСПЕРТИЗА
ОЦЕНКА И ВЗАИМОСВЯЗЬ ПАРАМЕТРОВ ТОКСИЧНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ ВЕЩЕСТВ ДЛЯ ИНФУЗОРИЙ ТЕТРАХИМЕНА ПИРИФОРМИС И БЕЛЫХ КРЫС
В.А. Долгов1, С.А. Лавина1, Д.В. Никитченко
!ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Звенигородское шоссе, 5, Москва, Россия, 123022
2Кафедра морфологии животных и ветеринарно-санитарной экспертизы Российский университет дружбы народов ул. Миклухо-Маклая, 8/2, Москва, Россия, 117198
В статье приведены результаты сравнительной оценки параметров токсичности различных веществ для инфузорий тетрахимен и белых крыс, показана их взаимосвязь и возможность межвидовой экстраполяции результатов биотестирования, полученных на инфузориях, на высших животных.
Ключевые слова: параметры токсичности, инфузории тетрахимены, белые крысы.
Введение. Инфузории Тетрахимена пириформис достаточно широко известны в качестве тест-организма, используемого в токсико-биологических исследованиях [2; 7; 8], что объясняется сходством основных этапов обмена веществ этих простейших с высшими животными.
Поскольку использование последних в качестве моделей для определения параметров токсичности различных веществ и соединений требует существенных материальных затрат (наличие вивария, содержание и кормление животных, длительность опыта и т.д.) и небезупречно с этической точки зрения, возникает необходимость поиска альтернативных тест-организмов, которые позволяют проводить подобные исследования с целью последующей экстраполяции полученных данных на высших животных. Это позволит существенно ограничить объем проводимых исследований с использованием лабораторных животных с соответствующей экономией времени и средств, а в некоторых случаях, возможно, и полностью их исключить.
Целью наших исследований было провести сравнительную оценку параметров токсичности различных веществ для инфузорий Тетрахимена пириформис и белых крыс, изучить их взаимосвязь и возможность использования результатов анализа на инфузориях для ориентировочного определения показателей токсичности ксенобиотиков для высших животных.
Материалы и методы исследований. Для сравнительной оценки параметров токсичности, определяемых в опытах на инфузориях и белых крысах, нами были взяты дозы различных веществ, вызывающие 50%-й летальный эффект при их введении в желудок лабораторных животных (белых крыс) — LD50, поскольку этот показатель является одним из самых распространенных в токсикологических исследованиях.
Количественные значения LD50 заимствованы нами из соответствующих литературных источников [1; 9—11] для следующих соединений: перманганата калия; сульфатов железа, меди и кадмия; нитрита натрия; нитрата калия, карбонатов лития и таллия; хлорида кобальта; фенола; хлороформа; ацетонитрила; этанола; резорцина; фурацилина; диметилсульфоксида; циодрина; хлорофоса; ДДВФ; ди-ацетоксисцирпенола; Т-2 токсина. Многие из этих соединений имеют ветеринарно-санитарное и экологическое значение как возможные загрязнители кормовых и пищевых продуктов, а также объектов окружающей среды, используются в промышленности, сельскохозяйственном производстве и ветеринарной практике.
Опыты на инфузориях проводились с определением основных тест-функций простейших — ростовой (генеративной) и поведенческой (хемотаксической) реакций. При изучении ростовой реакции тетрахимен использовали ряд основных методических подходов, изложенных в разработанных нами методических рекомендациях [3; 6].
В опытах применяли пептонную среду, в которую вносили необходимое количество исследуемого вещества в различных концентрациях, ингибирующих рост инфузорий от минимального значения до полного (ГС — ингибирующие концентрации). Анализ проводили во флаконах из-под антибиотиков в объеме среды 2 мл. Количество инокулята (3—5-суточная культура тетрахимен), вносимого во флаконы с средой и испытуемым веществом, составляло 0,05 мл. Контролем служила пептонная среда без добавления исследуемого токсиканта.
Через 24 часа экспозиции под микроскопом определяли жизнеспособность инфузорий, затем клетки фиксировали каплей 5%-го спиртового раствора йода и подсчитывали их количество в камере Фукса-Розенталя. На основании результатов подсчета выросших клеток определяли величины концентраций исследуемых соединений, вызывающих минимальную статистически достоверную задержку роста инфузорий по сравнению с контролем (ГСмин), 50%-ю задержку роста (ГС50) и полное его подавление, т.е. гибель инфузорий (ГС100).
Изучение поведенческой реакции тетрахимен осуществляли по разработанному нами методу [4; 5] с использованием прибора «Биотестер-2». Растворы исследуемых соединений готовили на дистиллированной воде в различных концент-
рациях, обеспечивающих подавление хемотаксиса инфузорий от минимального значения до полного.
При исследовании микотоксинов их растворяли в 10%-м водном растворе ди-метилсульфоксида (ДМСО), а затем разбавляли полученный раствор в 10 раз, доводя концентрацию ДМСО до 1%, не оказывающую отрицательного влияния на инфузорий. Анализ проводили в фотометрических кюветах, куда вносили по 2 мл 3—5-суточной культуры инфузорий, выращенных на пептонной среде, затем сверху наслаивали такой же объем раствора испытуемого вещества и через 30, 45 и 60 минут проводили фотометрию верхнего слоя жидкости в приборе с целью определения концентрации инфузорий. Устанавливали концентрации веществ, вызывающих минимальное (1Смин), 50%-е (1С50) и полное подавление хемо-таксической реакции инфузорий (1С100) по сравнению с контролем (дистиллированная вода).
Полученные данные подвергали статистической обработке с определением коэффициента корреляции между показателями токсичности, установленными для белых крыс ^Б50), и ингибирующими концентрациями (1Смин, 1С50, 1С100), определенными в опытах на инфузориях. На основании графических построений рассчитывали математические формулы, отражающие их взаимосвязь.
Результаты исследований. Полученные данные представлены в таблице, в которой приводятся также логарифмы параметров токсичности изученных соединений для белых крыс и инфузорий, использованные при построении графиков, отражающих взаимосвязь показателей LD50 и ингибирующих концентраций (1С).
Анализируя результаты проведенных исследований, можно сделать вывод о том, что чувствительность инфузорий к различным веществам неодинакова, как неодинаковы и пределы чувствительности ростовой и поведенческой реакций тет-рахимен. Минимальная концентрация соединений, ингибирующая ростовую реакцию, может колебаться в довольно широких пределах — от сотых долей мг/л (диацетоксисцирпенол, Т-2 токсин) до нескольких тысяч мг/л (нитрат калия, ди-метилсульфоксид, этанол).
Аналогичная картина была и в отношении поведенческой реакции, которая начинала ингибироваться в диапазоне концентраций от 0,08 мг/л (диацетоксисцир-пенол) до 40000 мг/л (диметилсульфоксид).
Хемотаксис инфузорий оказался более чувствительным, чем ростовая реакция, при индикации минимальных ингибирующих концентраций 8 из 21 изученного вещества; обратная картина наблюдалась при биотестировании 9 соединений, а для 4 чувствительность обеих тест-функций была примерно равной.
Из представленных в таблице данных видно также, что количественные значения LD50 изученных веществ в целом сопоставимы с величинами их ингибирующих концентраций (1С), выраженными в мг/л питательной среды, а для ряда соединений (перманганат калия, сульфаты меди и железа, нитрит натрия, ацето-нитрил, резорцин и др.) они близки и в абсолютном значении, в особенности при сравнении LD50 с концентрациями, подавляющими ростовую реакцию инфузорий.
Таблица
Сравнительная оценка параметров токсичности различных веществ для белых крыс и инфузорий (в скобках — логарифмы концентраций)
Вещества LD50 для бе- Ингибирующая концентрация (IC) для инфузорий мг/л
лых крыс,
мг/кг ростовая (генеративная) поведенческая
реакция (хемотаксическая) реакция
|Смин IC50 IC100 |Смин IC50 IC100
Перманганат калия 750 25 400 500 0,5 10 100
(2,88) (1,4) (2,6) (2,7) (-0,3) (1,0) (2,0)
Сульфат железа 533 50 250 5 000 50 1 000 5 000
(2,73) (1,7) (2,4) (3,7) (1,7) (3,0) (3,7)
Нитрит натрия 200,5 150 300 1 500 40 700 800
(2,3) (2,18) (2,48) (3,18) (1,6) (2,85) (2,9)
Нитрат калия 3 540 2 000 6 000 17 000 2 500 6 500 11 000
(3,55) (3,3) (3,78) (4,23) (3,4) (3,81) (4,04)
Карбонат лития 553 90 250 1 800 9 100 500
(2,74) (1,95) (2,4) (3,26) (0,95) (2,0) (2,7)
Карбонат таллия 15 75 150 700 1 8,5 1 000
(1,18) (1,88) (2,18) (2,85) (0) (0,93) (3,0)
Сульфат меди 450 420 750 2 400 0,4 7,5 50
(2,65) (2,65) (2,88) (3,38) (-0,4) (0,88) (1,7)
Сульфат кадмия 60 1 2,5 25 1 25 45
(1,78) (0) (0,4) (1,4) (0) (1,4) (1,65)
Хлорид кобальта 80 2 25 2 000 0,01 5 3 000
(1,9) (0,3) (1,4) (3,3) (-2) (0,7) (3,48)
Фенол 512 80 140 270 100 250 800
(2,71) (1,9) (2,15) (2,43) (2,0) (2,4) (2,9)
Хлороформ 1 750 1 300 1 800 100 500 2 500
(3,24) (0) (2,48) (3,26) (2,0) (2,7) (3,4)
Ацетонитрил 3 800 900 6 000 16 000 5 000 17 000 32 000
(3,58) (2,95) (3,78) (4,2) (3,7) (4,23) (4,51)
Этанол 8 500 4 500 8 500 28 000 15 000 20 000 40 000
(3,93) (3,65) (3,93) (4,45) (4,18) (4,3) (4,6)
Резорцин 239 22 90 910 0,1 250 600
(2,38) (1,34) (1,95) (2,96) (-1,0) (2,4) (2,78)
Фурацилин 600 43 150 240 0,1 180 240
(2,78) (1,63) (2,18) (2,38) (-1,0) (2,26) (2,38)
Диметилсульфок- 24 000 12 000 15 000 23 000 40 000 >80000 —
сид (3,38) (4,08) (4,18) (4,36) (4,6) (4,9)
Циодрин 35 0,5 3,0 25 100 150 300
(1,54) (-0,3) (0,48) (1,4) (2,0) (2,18) (2,48)
Хлорофос 630 650 1 400 4 500 1 000 6 500 10 000
(2,8) (2,81) (3,15) (3,65) (3,0) (3,81) (4,0)
ДДВФ 80 2,5 30 150 150 250 450
(1,9) (0,4) (1,48) (2,18) (2,18) (2,4) (2,65)
Диацетоксис- 7,3 0,015 0,06 0,25 0,08 1,25 10
цирпенол (0,86) (-1,82) (-1,22) (-0,6) (-1,1) (0,1) (1,0)
Т-2 токсин 3,8 0,02 0,05 0,25 0,5 >10 —
(0,58) (-1,7) (-1,3) (-0,6) (-0,3) (1,0)
Сравнительная оценка данных параметров показала высокую степень их корреляционной связи. Так, коэффициент корреляции (r) между LD50 и концентрациями, угнетающими рост тетрахимен (ГСмин, IC50 и IC100), равнялся, соответственно, 0,99, 0,94 и 0,77; между LD50 и аналогичными концентрациями, ингибирующими хемотаксис — 0,99, 0,98 и 0,91. Данная взаимосвязь свидетельствует о том, что
в проявлении токсико-биологической реакции как высших животных, так и инфузорий тетрахимен есть много общего, что является следствием сходства основных этапов обмена веществ.
Разумеется, не все существующие токсиканты могут в одинаковой мере угнетать жизнедеятельность инфузорий и высших животных, поскольку видовые отличия в чувствительности к тем или иным соединениям, которые, как известно, существуют и среди высших организмов, неизбежно будут оказывать на это влияние.
Тем не менее полученные данные, свидетельствующие о высокой степени корреляционной связи параметров токсичности, определяемых на крысах и инфузориях, позволяют использовать результаты анализа на тетрахименах с целью ориентировочного определения концентраций веществ, которые могут вызывать токсический эффект у высших организмов.
Графическая взаимосвязь показателей токсичности (LD50 и ГС) представлена на рисунке.
Рис. Взаимосвязь логарифмов LD50 и 1С (-ростовая реакция;-----поведенческая реакция)
1) 1д LD50 = 1,67 + 0,588 1д 1Смин-(г = 0,99; т - =0,031; п = 21; Р < 0,01)
2) 1д LD50 = 1,20 + 0,625 1д 1С50 (г = 0,94; тг =0,025; п = 21; Р < 0,01)
3) 1д LD50 = 0,36 + 0,756 1д 1С100 (г = 0,77; тг =0,091; п = 21; Р < 0,01)
4) 1д LD5n = 1,87 + 0,455 1д 1С (г = 0,99; т =0,0004; п = 21; Р < 0,01)
/ э 50 ' э мин 4 г ' ' ' ' '
5) 1д LD50 = 1,38 + 0,450 1д 1С50 (г = 0,98; тг =0,006; п = 21; Р < 0,01)
6) 1д LD50 = 0,15 + 0,787 1д 1С100 (г = 0,91; т - =0,03; п = 21; Р < 0,01)
Исходя из установленных зависимостей между LD50 и ГС, нами предложен ряд формул, использование которых дает возможность расчета параметров токсичности веществ для крыс на основании их биотестирования на инфузориях.
При определении ростовой реакции тетрахимен данные формулы имеют следующий вид:
^ LD50 = 1,67 + 0,588 ^ Юм™; (1)
^ LD50 = 1,20 + 0,625 lg IC5o; (2)
^ LD50 = 0,36 + 0,756 lg ICloo. (3)
При изучении поведенческой реакции инфузорий формулы расчета LD50 имеют следующий вид:
^ LD5o = 1,87 + 0,455 lg Юм™; (4)
lg LD5o = 1,38 + 0,450 ^ ГС50; (5)
lg LD5o = 0,15 + 0,787 ^ IC1oo. (6)
При расчетах для получения более стабильных и близких к фактическим значений LD50 предпочтительнее брать в качестве критерия ростовую реакцию тетрахимен (формулы 1—3), которая является интегрированным выражением протекающих в клетке обменных процессов; при использовании поведенческой реакции целесообразно применять концентрации, ингибирующие данную тест-функцию на 50 и 100% (формулы 5 и 6).
Заключение. В результате исследований проведена сравнительная оценка и установлена взаимосвязь параметров токсичности различных веществ для инфузорий тетрахимена пириформис и белых крыс. Предложены математические формулы, позволяющие на основании результатов определения концентраций веществ, ингибирующих ростовую и поведенческую реакции инфузорий, ориентировочно определять показатель LD50 для белых крыс, что имеет как научное, так и практическое значение при проведении токсикологических исследований.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Вредные вещества в промышленности. — Л., 1976.
[2] Долгов В.А. Методические аспекты и практическое применение ускоренной биологической оценки кормов, продуктов животноводства и других объектов ветеринарно-сани-тарного и экологического контроля: Дисс. ... докт. вет. наук. — М., 1992.
[3] Долгов В.А., Нелюбин В.П., Шаблий В.Я., Суханов Б.П. Методические рекомендации для использования экспресс-метода биологической оценки продуктов и кормов. — М.: ВАСХНИЛ, 1990.
[4] Долгов В.А., Лапаев В.Э. Методические рекомендации «Использование инфузорий (Тет-рахимена пириформис) в качестве тест-культуры в приборе «Биотестер-2» (экспресс-метод). — М.: Государственное лечебно-оздоровительное объединение, 1991.
[5] Долгов В.А., Лавина С.А. Методические указания по использованию инфузорий Tetra-hymena pyriformis в качестве тест-культуры в приборе «Биотестер-2». — М.: Департамент ветеринарии МСХ РФ, 2000. — № 13-7-2/2156.
[6] Долгов В.А., Лавина С.А., Арно Т.С. и др. Методическое пособие по биотестовой оценке качества и безопасности различных объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля. — М.: РАСХН, 2010.
[7] Игнатьев А.Д., Шаблий В.Я. Использование инфузории тетрахимены пириформис как тест-объекта при биологических исследованиях в сельском хозяйстве. — М.: ВАСХНИЛ, 1978.
[8] Лавина С.А. Биотесты на основе ферментных систем для оценки токсического действия ксенобиотиков на объекты ветеринарно-санитарного и экологического контроля: Дисс. ... докт. биол. наук. — М., 2002.
[9] Микотоксины. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. II. — ВОЗ. Женева, 1982.
[10] Список химических и биологических средств борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками и регуляторов роста растений, разрешенных для применения в сельском хозяйстве на 1986—1990 годы. — М., 1987.
[11] Шамшурин А.А., Криммер М.З. Физико-химические свойства пестицидов. Справочник. — М.: Химия, 1976.
COMPARATIVE EVALUATION AND RELATIONSHIP OF TOXICITY PARAMETERS OF DIFFERENT SUBSTANCES TO TETRAHYMENA PIRIFORMIS AND WHITE RATS
V.A. Dolgov1, S.A. Lavina1, D.V. Nikitchenko2
'All-Russian Scientific and Research Institute Veterinary Sanitation, Hygiene and Ecology Zvenigorodsky highway, 5, Moscow, Russia, 123022 2Department of morphology of animals
and veterinary-sanitary inspection Peoples' Friendship University of Russia Miklukho-Maklaya str., 8/2, Moscow, Russia, 117198
The article presents the results of a comparative evaluation of various substances toxicity parameters for Tetrahymena pyriformis and white rats, shows their relationship and the possibility of interspecies extrapolation of bioassay results obtained on infusoria on higher animals.
Key words: toxicity parameters, Tetrahymena pyriformis, white rats.
REFERENCES
[1] Vrednye veshhestva v promyshlennosti. — L., 1976.
[2] Dolgov V.A. Metodicheskie aspekty i prakticheskoe primenenie uskorennoj biologicheskoj ocenki kormov, produktov zhivotnovodstva i drugih obektov veterinarno-sanitarnogo i jekolo-gicheskogo kontrolja: Diss. ... dokt. vet. nauk. — M., 1992.
[3] Dolgov V.A., Neljubin V.P., Shablij V.Ja., Suhanov B.P. Metodicheskie rekomendacii dlja ispol'zovanija jekspress-metoda biologicheskoj ocenki produktov i kormov. — M.: VASHNIL, 1990.
[4] Dolgov V.A., Lapaev V.Je. Metodicheskie rekomendacii «Ispol'zovanie infuzorij (Tetrahimena piriformis) v kachestve test-kul'tury v pribore «Biotester-2» (jekspress-metod). — M.: Gosudar-stvennoe lechebno-ozdorovitel'noe ob#edinenie, 1991.
[5] Dolgov V.A., Lavina S.A. Metodicheskie ukazanija po ispol'zovaniju infuzorij Tetrahymena pyriformis v kachestve test-kul'tury v pribore «Biotester-2». — M.: Departament veterinarii MSH RF, 2000. — № 13-7-2/2156.
[6] Dolgov V.A., Lavina S.A., Arno T.S. i dr. Metodicheskoe posobie po biotestovoj ocenkee kachestva i bezopasnosti razlichnyh ob#ektov veterinarno-sanitarnogo i jekologicheskogo kontrolja. — M.: RASHN, 2010.
[7] Ignat'ev A.D., Shablij V.Ja. Ispol'zovanie infuzorii tetrahimeny piriformis kak test-ob#ekta pri biologicheskih issledovanijah v sel'skom hozjajstve. — M.: VASHNIL, 1978.
[8] Lavina S.A. Biotesty na osnove fermentnyh sistem dlja ocenki toksicheskogo dejstvija ksenobio-tikov na obekty veterinarno-sanitarnogo i jekologicheskogo kontrolja: Diss. ... dokt. biol. nauk. — M., 2002.
[9] Mikotoksiny. Gigienicheskie kriterii sostojanija okruzhajushhej sredy. II. — VOZ. Zheneva, 1982.
[10] Spisok himicheskih i biologicheskih sredstv bor'by s vrediteljami, boleznjami rastenij i sornja-kami i reguljatorov rosta rastenij, razreshennyh dlja primenenija v sel'skom hozjajstve na 1986— 1990 gody. — M., 1987.
[11] Shamshurin A.A., Krimmer M.Z. Fiziko-himicheskie svojstva pesticidov. Spravochnik. — M.: Himija, 1976.
