CC BY
33
637.5.002.611+613.2—099
СВОЙСТВА КОНЪЮГИРОВАННЫХ ФОРМ РАЗЛИЧНЫХ БЕЛКОВ С КАРБОФОСОМ
Е.И. ЧЕБУНИНА
Зое точно-Сибирский технологический институт
Многие ксенобиотики легко проходят через биологические мембраны, вызывая нарушения физиологических процессов. В организме чужеродные вещества подвергаются разнообразной биотранс-формации. которая приводит к образованию менее токсичных или нейтральных метаболитов. Реакции нейтрализации (детоксикации) ксенобиотиков разделяются на две фазы: первая — окислительно-вос-становительные и гидролиз, вторая — конъюгации. К важнейшим из последних относятся реакции с глюкуроновой кислотой, сульфатами, аминокислотами и т.п. [ 1].
В лабораторных условиях конъюгирование низкомолекулярных чужеродных веществ с белками производится для создания антигенов, которые при иммунизации животных способствуют образованию антител, защищающих организм от токсического действия ксенобиотиков [2].
Нами синтезированы конъюгаты карбофоса с бычьим и человечьим сывороточным альбумином для получения из них иммунных сывороток [3].
Реакции ковалентного связывания гаптенов с белками проводили в водных растворах при пониженной температуре и нейтральных или слабощелочных значениях pH, т.е. в условиях, препятствующих денатурированию белка [4]. Гаптен должен иметь хотя бы одну функциональную группу для ковалентного связывания с белком, содержащим следующие реакционноспособные группы: карбоксильную (аспарагиновая и глутаминовая кислоты, С—концевая карбоксильная), остаток фенола (тирозин), алифатическую оксигруппу (серин, треонин), сульфгидрильную (цистеин), свободную аминогруппу (лизин и N—концевая аминогруппа), остаток индола (триптофан) и .имидазола (гистидин). Основные реакции между функциональными группами гаптенов и белков представлены в табл. 1 І4].
Из таблицы видно, что аминогруппа наиболее способна к реакциям ковалентного связывания, следовательно, по количеству свободных аминных групп можно судить о связывании молекулы белка с гаптеном, в том числе с пестицидом.
Чтобы установить степень связывания карбофоса с различными белками животного происхождения, применяющимися в комбинированных мясных системах, выбрали в качестве носителей пищевые белки, используемые в мясной промышлеи-
ности: казеин, казеинат, белок структурированной добавки из крови [5], а в качестве гаптена — ангидрид карбофоса. Эталонным белком для получения конъюгатов и исследования их свойств служил человечий сывороточный альбумин ЧСА. Конъюгаты синтезировали при рН=8,0, температуре от 0 до +4°С в 1 М натрий-фосфатном буфере и различном соотношении компонентов реакционной смеси, установленном в границах, не вызывающих денатурации белка. По окончании синтеза проводили очистку конъюгата от излишков низкомолекулярного компонента с помощью диализа. Количество непрореагировавших аминогрупп определяли с использованием тринитробензолсульфо-кислоты [6]. Результаты приведены в табл. 2.
Таблица !
Гаптен Группа белка
кар- бок- силь- ная фе- ноль- ная ок- си- груп- па тио- груп- па ами- но- груп- па индол ь* ная ими* да- золь- ная
Ангидриды
кислот ± ". +
Изоцианаты + . +■■
Изотиоцианаты ± +
Азиды кислот ■ ±;-': + .
Имидоэфиры ±, +
Хлорформиаты . + : +
Ароматические
диазосоли •+ . ♦
Меркураты ■ +
Галогенацетиль-
ная. группа ; + .
Аминогруппы +
Для каждого белка количество замещенных N[-.2-групп зависит от соотношения компонентов реакционной смеси. Так, ЧСА можех замещать в условиях реакции до 19,12% имеющихся аминогрупп. Дальнейшее увеличение количества гаптена на молекулу носителя вызывает денатурационные изменения белка. Казеин при молярном соотношении с ангидридом карбофоса 1:10 присоединяет ксенобиотик к 14,28% аминных групп. Казеинат проявляет стабильность во взаимодействии с производным пестицида: при соотношениях 1:10... 1:30 в нем блокируется 9,09% аминогрупп; при соотношении 1:40, очевидно, происходит денатурация белкового комплекса. Для белка структурата крови
[Щлкнэй
1^ II id —
ид ггалу-|:-r слу-ju ЧСА.
»П£р-ЛТу-
:клнон-
рь:ь:ре:з
СИНІР.ІЯ Е; ^^ЗКЛ-ІКЛЛЯІЗ. Ill] L'l'pi' lilVJ LLfvV
I
"j-jILL^J }
- HL.H-
ь-
11 ;;л.
-і:н
оптимальное соотношение взаимодеиствия с пестицидом — 1:30, при котором связывается 11,11% аминных групп.
Таблица 2
Белок Моль белка/моль пестицида Свободные аминогруппы % замеще ния
в белке в конъюгате
ЧСА 68 68
1:10 66 2,89
1:20 64 7,35
1:30 61 10,29
1:40 56 19,12
Казеин 14
1:10 •2 14,28
Казеинат 22
1:10 20 9,09
1:20 20 9.09
1:30 20 <■. 9.09 "
1:40 21 4.54'
Структурат
крови 27
1:30 24 11,11
Таким образом, установлено, что исследованные оелки взаимодействуют с инсектицидом с образованием конъюгированной формы, но присоединяют меньшее количество молекул гаптена, чем чистый изолированный белок.
Исследование, проведенное с использованием
тест-организма Тетрахимена пириформис, показало, что относительная биологическая ценность конъюгатов не снижается по сравнению с нативными белками.
Конъюгаты обладают слабовыраженным токсическим и не обладают аллергенным действием.
ЛИТЕРАТУРА
1. Baranczyk-Kuzma A. Detoksykacia ksenobiotycov па drodze reakcji sprzegania // Post. hig. i med dows. — 1988.
— 42. — № 1. — C. 29—42.
2. Полевая О.Ю. и др. Ковалентное связывание этаперази-на с белком для получения антител, нейтрализующих физиологическое действие этаперазина // Химико-фарма-цевт. журн. — 1976. — 10. — № 9. — С. 15—19.
3. Разработать методы иммунологического скрининга пестицидов. Исследование влияния пестицидов на реакции клеточного иммунитета: Отчет о НИР (промежуточ.) / Вост.-Сиб. технолог, ин-т / Под руковод. С.Д.ЙСамсарановой; № ГР 01825017264. — Улан-Удэ, 1988. — .С. 30—35.
4 Полевая О.Ю., Ковалев И.Е. Принципы синтеза конъюгированных антигенов / / Химико-фармацевт. журн. — 1988. — 12. — № 2. — С. 8—20.
5. Чиркина Т.Ф., Медведева Е.И., Данилова Т.Е. Теоретические подходы к обоснованию количества немясных .белков, вводимых в мясные системы. Пути совершенствования технологических процессов и оборудования для производства, хранения и транспортировки продуктов питания / Тез. докл. — М., 1984. — С. 123—124, ДСП.
6 Habeen A.F. // Analyt. Biochem. — 1966. — 14. — P. 3,28.
7. Игнатьев А.Д., Корнеева Н.А. Полимеры. Экспрессный контроль безвредности и качества сельскохозяйственных продуктов: Проспект международной выставки «Химия-82*.
— М.. 1982.
Кафедра биохимии и микробиологии
Поступила 08.06.92
663.252.4:577.15.U24
АКТИВНОСТЬ £-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ вТ!?. ЬАСПБ ЗиВвР. 01 АСЕТУ1-АСТ/5 265 И 5Г/?.С/?ЕЛ10/?/5 333 В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДОБАВЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ И ГАЛАКТОЗЫ К ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ
IS реэх-Н уСЛ0-
f.'rpynn їиз из ные кз-miouj*-дан'яет Ькипат 5 •: про-0...1:30
СОС-’НО-■урЗіЦЯЯ і аки'й
ГРАЖИНА ЦИХОШ, ЕЖИ РЫМАШЕВСКИ, МАРИАН КУЯВСКИ
Институт технологии молочного дела Сельскохозяйственно-техническая академия в Ольштыне (Польша)
Проследили влияние добавления к питательной среде 0/--глкжозы и £)/.-галактозы на активность /?-галактозидазы 1асИз зиЬзр. <Иасе1у1ас11$ 265 и 5/г. сгетот 333. Определили оптимальные ве-
личины pH и температуры, а также оценили термостабильность /?-галактозидазы внутриклеточных экстрактов, полученных из биомассы исследуемых штаммов молочнокислых бактерий путем дезинтеграции механическим методом под давлением, Коц-статировали, что добавление сахаров к питатель? ной среде повышало активность /?-галактозидазы в 2—3 раза и способствовало повышению термостабильности фермента. Оптимальные условия действия Д-галактозидазы были различными; они зависели от штамма и химического состава питательной среды.
