CC BY
40
УДК 577.152.3.04
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ ГРИБНЫХ ГЛИКОЗИДАЗ
Н. В. Борзова Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного
Л. Д. Варбанец НАН Украины, Киев
Е-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Получено 17.07.2011
Актуальной задачей современной прикладной энзимологии, в частности инженерии энзимов, является повышение их стабильности в различных, часто экстремальных, условиях реакционной среды.
Сравнительное изучение термостабильности нативных и модифицированных различными методами а-галактозидаз из трех грибных продуцентов — Aspergillus niger, Penicillium canescens и Cladosporium cladosporioides свидетельствует о том, что обработка энзимов целлюлозой, декстрана-ми Т500 и Т20, а также полиэтиленгликолями 6 000 и 1 500 приводит к их термостабилизации при 55 и 60 °С. Эффективным оказался также подход, основанный на гидрофобной модификации а-га-лактозидаз ацилированием аминогрупп лизина и глицина 2,6-диаминопимелиновой кислотой, янтарным ангидридом и глицином. В результате таких взаимодействий термостабильность а-галакто-зидаз была повышена в 1,5-5 раз.
Ключевые слова: а-галактозидазы Aspergillus niger, Penicillium canescens и Cladosporium cladosporioides, термостабилизация, химическая модификация энзимов.
Известно, что на стабильность и другие характеристики протеина значительное влияние может оказывать гидрофильно-ли-пофильный баланс поверхности. Для изменения первого свойства можно применять различные методы, одним из которых является химическая модификация. Не затрагивая активных центров энзимов, она способна приводить к существенным изменениям субстратной специфичности, каталитической активности и стабильности.
На сегодняшний день существует ряд работ [1-3], в которых показано, как изменение гидрофильно-липофильного баланса приводит к изменению активности и стабильности энзимов. Однако однозначного ответа на вопрос, как именно изменится стабильность энзима в результате модификации протеина гидрофобными или гидрофильными реагентами, нет. Также отсутствуют данные по химической модификации а-галактозидаз. Поэтому была проведена робота по модификации а-галактозидаз из трех грибных продуцентов — Aspergillus niger, Penicillium canescens и Cladosporium cladosporioides. Эти энзимы характеризуются близкими физико-химическими свойствами, имеют много общего в механизме термоденатурации и при этом резко отлича-
ются между собой по специфичности действия и сродству к субстрату.
Существенный вклад в стабилизацию протеиновой молекулы могут вносить ионы, кофакторы, метаболиты и другие вещества [4], в присутствии которых температура денатурации протеинов, в частности энзимов, может сдвигаться к верхнему температурному пределу деградации. Нами было изучено влияние большого количества соединений различной природы на активность и стабильность а-галактозидаз. Ранее [5, 6] была показана возможность стабилизировать а-галактозидазы в присутствии ряда углеводов и субстратов этих энзимов, а также при иммобилизации на человеческом сывороточном альбумине.
Целью данной работы было изучить возможность химической модификации трех грибных а-галактозидаз и влияние такой модификации на стабильность энзимов в условиях термоденатурации. Для решения этой задачи были использованы такие подходы: иммобилизация на целлюлозе и ее производных, модификация на растворимых полимерах — декстранах и ПАВ, сульфгидрильных групп специфическими реагентами, гидрофобная модификация глицином и янтарным ангидридом.
Материалы и методы
Использованные препараты а-галактози-даз были выделены из культуральной жидкости продуцентов согласно ранее разработанным методикам [7, 8].
Активность а-галактозидазы определяли с помощью субстрата реакции — р-нитро-фенил-а^-галактопиранозида (Sigma,
США) [9]. За единицу активности принимали количество энзима, гидролизующее 1 мкмоль субстрата в 1 мин в условиях опыта.
Термоинактивацию а-галактозидаз исследовали при температуре 55-60 °С, рН 5,2 (1,0 мМ фосфатно-цитратный буфер — ФЦБ). Кинетику термоинактивации изучали следующим образом. Образцы нативного и модифицированного энзима 0,05-0,5 Е/мл в 1 мМ ФЦБ, рН 5,2, выдерживали при заданной температуре на протяжении 1,5-3 ч. Через определенные промежутки времени (10-30 мин) отбирали аликвоты по 0,1 мл и измеряли а-галактозидазную активность.
Иммобилизацию энзимов на целлюлозе и ее производных проводили, смешивая полимеры с энзимами в ФЦБ в конечной концентрации 25 и 5 мкг на 10 мкг протеина, с использованием целлюлозы, микрокристаллической целлюлозы (МК-целлюлозы), карбоксиметилцеллюлозы (КМ-целлюло-зы), диэтиламиноэтилцеллюлозы (ДЭАЭ-цел-люлоза) и сервацела КМ 32. Выдерживали смеси при 30 °С и постоянном перемешивании 24 ч, центрифугированием (8 000 g, 5 мин) отделяли нерастворимый компонент смеси от растворимого. В процессе адсорбции энзимов на носителе при их взаимодействии возникают солевые связи, а также другие слабые взаимодействия (водородные, ван-дер-ва-альсовы). Далее изучали активность полученных энзимных препаратов при 37 °С и в условиях термоденатурации.
Обработку а-галактозидаз осуществляли также декстранами Т500 и Т20, ПЭГ 6 000 и ПЭГ 1 500 (5 г/л), цетилтриметиламмония бромидом (ЦТАБ, в концентрации 10-2-10-6 М), п-хлормеркурибензоатом (п-ХМБ) (103-105 М), глицином (0,1 М), 2,6-диаминопимелиновой кислотой (10-3 М), диэтилпирокарбонатом натрия (1%), янтарным ангидридом (10-2-10-5 М). Все энзимные препараты были предварительно выдержаны 24 ч в присутствии модификаторов при 20 °С (ФЦБ, рН 5,2), и это не вызывало снижения активности. Модифицированные энзимы отделяли от низкомолекулярных реагентов диализом или гель-фильтрацией.
Расчет констант термоинактивации выполняли в соответствии с работой Полторак и др. [10].
Статистическую обработку трех-пяти экспериментальных серий исследований проводили стандартными методами с определением ^критерия Стьюдента при 5%-м уровне значимости.
Результаты и обсуждение
Сравнительное изучение термостабильности нативных и модифицированных а-галакто-зидаз из трех грибных продуцентов (рис. 1) показало, что связывание с целлюлозными препаратами а-галактозидазы из А niger нецелесообразно проводить при концентрации 25 мкг целлюлозы/10 мкг протеина, поскольку высокие концентрации целлюлозных производных приводили к снижению термостабильности и практически полной инактивации энзима в условиях эксперимента. Связывание с ДЭАЭ-целлюлозой вызывало инактивацию всех трех а-галактозидаз в течение первого часа термообработки при 55 °С.
“ Исходная активность ■' 180 мин
Варианты опыта Рис. 1. Активность а-галактозидаз A. niger (A), P. canescens (P), C. cladosporioides (C) после модификации энзимов целлюлозой:
1 — целлюлоза; 2 — МК-целлюлоза; 3 — КМ-цел-люлоза; 4 — ДЭАЭ-целлюлоза; 5 — сервацел КМ 32. Концентрация реагентов — 25 мкг/10 мкг протеина. Инкубация — 3 ч при 55 °С
Снижение концентрации целлюлозы в 5 раз позволило увеличить период полуинактива-ции энзимов при 57°С до 10 раз. Наиболее эффективными в условиях термоденатурации были а-галактозидазы в сочетании с серва-целлом, КМ- и ДЭАЭ-целлюлозой. Значения константы денатурации увеличивались в некоторых случаях почти на порядок. Так, константа термоденатурации для нативной а-галактозидазы A. niger при 57 °С составляла 4,110-6 с1, а для адсорбированной на сервацеле КМ 32 — 0,8-10-6 с1. Константы
денатурации для нативных а-галактозидаз P. canescens и C. cladosporioides в этих условиях составляли 5,8-10-5 с1 и 7,2-10-5 с1. В случае иммобилизации энзима P. canes-cens на КМ-целлюлозе и сервацеле его термостабильность увеличивалась примерно в 7-9 раз (кден составили, соответственно, 8,3-10-6 с-1 и 6,4510-6 с-1). Показатели кден для препаратов а-галактозидазы C. cladospo-rioides, связанных на КМ-целлюлозе и сер-вацеле, также были близки между собой — 8,6 и 9,210-6 с-1, а максимальный эффект достигался при иммобилизации энзима на ДЭАЭ-целлюлозе, ^ен 9,8106 с-1.
Обработка а-галактозидаз декстранами T500 и T20, ПЭГ 6 000 и ПЭГ 1 500, а также глицином способствовала термостабилизации энзимов при 55 “С (рис. 2). Однако следует отметить различия в динамике этого процесса у а-галактозидаз из разных источников. Пока сложно указать на конкретные механизмы стабилизации в каждом случае, для этого нужно провести дополнительные исследования, в том числе рентгеноструктурные и ИК-спектрометрию. Мы можем только предполагать, что это связано с кон-формационными особенностями молекул исследованных а-галактозидаз. Модификация физиологически активных веществ протеиновой природы растворимыми полимерами и полисахаридами повышает их конформа-ционную стабильность и устойчивость посредством многоточечного связывания и модификации остатков лизина [11]. Кроме того, такое связывание обеспечивает устойчивость протеинов к протеолизу. Наличие в декстранах большого количества гидроксильных групп делает возможной их модификацию. Еще одним из способов направленного изменения структурных характеристик протеинов является введение в систему ПАВ. Следует отметить некоторые отличия в степени и характере влияния использованных веществ на разные энзимы, что, по нашему мнению, может косвенно указывать на различия в расположении заряженных групп на поверхности протеиновой глобулы. Можно предположить, что в поддержании активной конформации а-галактозидаз A. niger и P. canescens глицин играет более существенную роль, чем в молекуле а-галактозидазы C. cladosporioides. Tакже было показано, что глицин и ПЭГ способствовали эффективной термостабилизации а-галактозидаз и при 60 “С.
Кроме неионогенного ПЭГ, было изучено влияние катионного ПАВ — ЦTАБ. Есть данные [12], что в этом случае ЦTАБ с протеи-
А
Б
В
Рис. 2. Зависимость активности модифицированных а-галактозидаз A. niger (A), P. canescens (Б),
C. cladosporioides (В) от времени термоинактивации (рН 5,2, t = 55 0С)
ном образуют комплексы переменного состава, при этом наблюдаются существенные конформационные изменения вторичной структуры — доля спиральных а-цепей уменьшается, а термическая устойчивость возрастает. При низких концентрациях ПАВ взаимодействие имеет электростатическую природу в результате связывания ионов ПАВ противоположно заряженными группами протеина, а при высоких концентрациях определяющую роль играют гидрофобные взаимодействия. Однако было отмечено, что в отличие от ПЭГ образованные в этом случае комплексы ЦТАБ-энзим (об их образовании свидетельствует линейный характер зависимости активности энзимов от концентрации ЦТАБ, рис. 3) характеризовались значительно меньшей термостабильностью и полностью инактивировались при 55 °С в течение 30 мин.
Рис. 3. Зависимость активности а-галактозидаз от концентрации цетилтриметиламмония бромида при 20 “С, 30 мин
Использование янтарного ангидрида позволяло увеличить период полуинактивации всех изученных а-галактозидаз, хотя и в разных концентрациях и в различной степени. Максимальный эффект наблюдался при обработке а-галактозидазы A. niger в концентрации 10-2 М (рис. 4). Константы термоинактивации при оптимальных концентрациях янтарного ангидрида снижались в 5; 1,5 и 2 раза для а-галактозидаз A. niger, P. canescens и C. eladosporioides, соответственно. Отмеченный эффект связан, вероятно, со стабилизацией активной формы энзимов через усиление межсубъединичных взаимодействий путем ацилирования а-аминогрупп остатков лизина.
Поскольку ранее была показана важная роль SH-групп в поддержании активной конформации молекул всех трех а-галактозидаз [7, 8], нами применялись для обработки энзимов такие протекторы этих групп, как цисте-ин и дитиотреитол. Однако в использованной концентрации эти вещества стабилизировали а-галактозидазы лишь в незначительной степени, а все изменения активности происходили в пределах погрешности опыта. Использование диэтилпирокарбоната и п-ХМБ — модификаторов гистидина и сульфгидриль-ных групп — в исследованных концентрациях либо не приводило к изменению каталитической активности энзимов в условиях термоденатурации (рис. 5), либо ускоряло их инактивацию, предположительно за счет облегчения перехода протеиновой глобулы в развернутое состояние. Присутствие 2,6-диаминопимели-новой кислоты, которая является предшественником L-лизина, оказывало незначитель-
Рис. 4. Зависимость активности а-галактозидазы A. niger от концентрации янтарного ангидрида
(температура инкубации — 55 “С)
А
Время, мин
60 120
180
Б
Время, мин
60 120
180
Время, мин
В
<
£
—♦—Контроль -о— п-ХМБ —*— ДЭПК —*— ДАШС
Рис. 5. Кинетические кривые термоинактивации а-галактозидаз A. niger (А), P. canescens (Б) и C. cladosporioides (В) в полулогарифмических координатах при 55 “С:
обработка п-ХМБ (10-5 М), 2,6-диаминопимелиновой кислотой (ДАПК, 10-3 М), диэтилпирокарбонатом натрия (ДЭПК, 1%)
ный стабилизирующий эффект, возможно за счет связывания с поверхностными остатками лизина, что в свою очередь обеспечивало меж-молекулярные сшивки и способствовало сохранению активной конформации протеиновой молекулы.
Таким образом, нами проведена работа по исследованию путей модификации грибных а-галактозидаз с целью как выяснения структурно-функциональных различий между ними, так и для получения практически важных высокостабильных препаратов этих энзимов. Показано, что иммобилизация на биополимерах (целлюлозе и декстранах) при-
водит к термостабилизации грибных а-галак-тозидаз. Также эффективным может быть подход, основанный на гидрофобной модификации молекул энзимов ацилированием аминогрупп лизина и глицина с помощью 2,6-ди-аминопимелиновой кислоты, янтарного ангидрида и глицина. Эти результаты могут свидетельствовать о том, что исследованные гликозидазы не относятся к протеинам, функционирующим в частично развернутом состоянии. На основе полученных данных планируется разработать мицелярно-поли-электролитную композицию или липосом-ную форму для создания препаратов а-галак-тозидаз пролонгированного действия.
ЛИТЕРАТУРА
1. Трофимова Д. Н., Камышный А. Л., Магдас-си Ш., Левашов А. В. Влияние химической модификации на стабильность глюкозоок-сидазы и формиатдегидрогеназы // Вестн.
Моск. ун-та. Серия 2. Химия. — 2003. — Т. 44, № 1. — С. 48-52.
2. Трофимова Д. Н., Левашов А. В. Фиксация мономерной формы формиатдегидрогеназы в системе обращенных мицелл путем моди-
фикации фермента глюкозой // Tам же. — 2000. — T. 41, № 6. — С. 390-394.
3. Plou F. J., Ballesteros A. Acylation of subtilisin with long fatty acyl residues affects its activity and thermostability in aqueous medium // FEBS Let. — 1994. — V. 339, N 1-2. — P. 200-204.
4. Янике Р. Что можно узнать о стабилизации белка из исследований ультрастабильных глобулярных белков // Биохимия. — 1998. — T. 63, № 3. — С. 370-380.
5. Борзова H. В., Варбанец Л. Д. Tермоинакти-вация а-галактозидазы Рenicillium canescens // Укр. біохім. журн. — 2010. — T. 82, № 3. — С. 24-30.
6. Борзова H. В., Варбанец Л. Д. Исследование термоинактивации а-галактозидазы Clado-sporium cladosporioides // Микробиол. био-технол. — 2010. — № 1. — С. 30-36.
7. Маланчук В. М. а-Галактозидаза Penicillium canescens 239 i Cladosporium cladosporioides 189. Автореф. дис. ... канд. біол. наук. — К., 2000. — 21 с.
ВИКОРИСТАННЯ МЕТОДІВ ХІМІЧНОЇ
МОДИФІКАЦІЇ ДЛЯ СТАБІЛІЗАЦІЇ ГРИБНИХ ГЛІКОЗИДАЗ
H. В. Борзова Л. Д. Варбанець
Інститут мікробіології i вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, Київ
E-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Актуальним завданням сучасної прикладної ензимології, зокрема інженерії ензимів, є підвищення їхньої стабільності в різних, часто екстремальних, умовах реакційного середовища.
Порівняльне вивчення термостабільності нативних та модифікованих різними методами а-галактозидаз із трьох грибних продуцентів — Aspergillus niger, Penicillium canescens i Clado-sporium cladosporioides свідчить про те, що обробка ензимів целюлозою, декстранами T500 i T20, а також поліетиленгліколями 6 000 i 1 500 призводить до їх термостабілізації при 55 i 60 “С. Ефективним виявився також підхід, заснований на гідрофобній модифікації а-га-лактозидаз ацилюванням аміногруп лізину та гліцину 2,6-діамінопімеліновою кислотою, янтарним ангідридом i гліцином. У результаті таких взаємодій термостабільність а-галактози-даз було підвищено в 1,5-5 разів.
Ключові слова: а-галактозидази Aspergillus niger, Penicillium canescens, Cladosporium cladosporioides, термостабілізація, хімічна модифікація ензимів.
8. Борзова Н. В. а-^ацетилгалактозамшща-за та а-галактозидаза Aspergillus niger 185ш. Автореф. дис. ... канд. бмл. наук. — К., 2003. — 21 с.
9. Chaplin M. E., Kennedy J. E. Carbohydrate analysis. — Oxford; Washington: IRL Press, 1986. — 228 p.
10. Полторак О. М., Чухрай Е. С., Торшин И. Ю. Диссоциативная термоинактивация, стабильность и активность олигомерных ферментов // Биохимия. — 1998. — Т. 63, № 3. — С. 360-369.
11. Marshall J. J. Preparation and characterization of a dextran-amylase conjugate // Carbohydr. Res. — 1976. — V. 49. — P. 389-398.
12. Кукушкина А. Н., Деркач С. Р., Ужинов Б. М. и др. Взаимодействие бычьего сывороточного альбумина с катионными поверхностно-активными веществами по данным флуоресценции // Изв. КГТУ. — 2008. — № 13. — С. 59-62.
USE OF CHEMICAL MODIFICATION METHODS FOR STABILIZATION OF FUNGAL GLYCOSIDASES
N. V. Borzova L. D. Varbanets
Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Urgent task of the modern applied enzymolo-gy, in particular enzyme engineering technique, is increasing of enzyme stability in different, often extreme, conditions of the reaction medium. Comparative study of thermostability of а-galactosidases native and modified by various methods out of three fungal producers — Aspergillus niger, Penicillium canescens and Cladosporium cladosporioides indicated that treatment with cellulose, dextrans T500, T20 and also 6 000 and 1 500 PEG stabilized the enzymes at 55 “С and 60 “С. An approach based on hydrophobic modification of enzymes by acylation of aminogroups of lysine and glycine with 2,6-diaminoipimelic acid and glycine appeared to be effective. As a result of such interaction thermostability of а-galactosidase was increased in
1,5-5 times.
Key words: а-galactosidases Aspergillus niger, Penicillium canescens, Cladosporium cladosporioi-des, thermal stabilization, chemical modification of enzymes.
