CC BY
27Токсикологический вестник №з (120)
УДК [630.886.1:615.9]:504.4.054:595.3
Хромато-масс-спентрометричесное исследование токсикологических профилей отравляющих веществ ножно-нарывного действия
Исследован профиль экскреции биомаркеров отравляющих веществ кожно-нарывного действия (ОВ КНД) после интоксикации крыс люизитом и ипритно-люизитной смесью дозой 1,6 мг/кг. Проведена оценка возможности определения биомаркеров люизита в организме после проведения антидотной терапии унитиолом. Установлено, что экскреция 2-хлорвиниларсонистой кислоты (ХВАК) происходит гораздо активнее в первые двое суток после введения унитиола в сравнении с экскрецией в отсутствие антидотной терапии.
Показано, что наиболее значимым ретроспективным биомаркером при установлении факта воздействия ипритно-люизитной смеси на организм является ХВАК, которая была достоверно идентифицирована в моче спустя 77 суток после экспозиции, в то время как метаболиты сернистого иприта (СИ) - тиодигликоль (ТДГ), тиодигликоль сульфоксида
(ТДГО) - и |3-лиазные метаболиты не определяются в рамках разработанных процедур уже через 7 суток.
Ключевые слова: люизит, 2-хлорвиниларсонистая кислота, сернистый иприт, тиодигликоль, О-лиазные метаболиты, газовая хромато-масс-спектрометрия.
Н.Л. Корягина, Е.И. Савельева, Е.С. Уколова, А.И. Уколов, Н.С. Хлебникова, Н.Г. Войтенко, А.С. Радилов
ФГУП «НИИ гигиены, профпаталогаи и экологии человека ФБМА России Ленинградская область, Вселожский район, г п. Кузьмоловский
Введение. Широкое внедрение методов хромато-масс-спектрометрии в практику химико-токсикологического анализа обеспечило аналитическую платформу не только для доказательного установления факта воздействия отравляющих веществ (ОВ) на организм, но и для системных метаболомических исследований, позволивших пересмотреть и дополнить представление о токсикологических профилях известных ОВ [1].
Сернистый иприт (СИ) и люизит относятся к ОВ КНД. СИ [бис(2-хлорэтил)сульфид] является наиболее известным ОВ КНД, и механизм его токсического действия достаточно хорошо изучен. Первичным продуктом гидролиза СИ является ТДГ, способный окисляться до ТДГО. Для ретроспективного анализа наиболее перспективными являются аддукты с белками: бис^-ацетилцистеиновый) конъюгат сульфона СИ, ^-(2-гидроксиэтилтио-
этил)гуанин, |3-лиазные метаболиты СИ: 1,1'-сульфонилбис[2-(метилсульфинил)этан] (СБМСЭ) и 1-метилсульфинил-2-[(метилтио)этилсульфонил]этан (МСМТЭСЭ). Процедуры определения биомаркеров СИ представлены в многочисленных публикациях [2-11].
В отличие от ряда других ОВ, люизит [дихлор(2-хлорвинил)арсин] в течение последних лет не являлся объектом внимания исследователей, несмотря на то, что тонны люизита и ипритно-люизитных смесей находятся в неустановленных местах в качестве химического оружия (ХО), «оставленного» после Второй мировой войны. Люизит ги-дролизуется до 2-хлорвиниларсонистой кислоты (ХВАК), представляющей собой гидрат-ную форму 2-хлорвиниларсиноксида, существующую только в водном растворе. Далее он может быть окислен до 2-хлорвиниларсоновой кислоты (ХВАОК). Указанные кислоты являются маркерами люизита. Обнаружение этих соединений в пробах однозначно указывает на факт контакта с люизитом. Авторы [12] полагают, что при отравлениях высокими дозами люизита ключевым биомаркером является ХВАОК, в то время как в случае малых доз в биопробах преимущественно обнаруживается ХВАК. Факторы, влияющие на состояние баланса ХВАК/ХВАОК в биопробах при отравлениях люизитом до настоящего времени исчерпывающим образом не изучены. Раздельное определение этих нелетучих соединений методом ГХ невозможно. В целях установления факта воздействия люизита на организм человека, совместное определение ХВАОК и ХВАК в биопробах, обработанных восстановителем, вполне допустимо, поскольку оба эти соединения являются маркерами люизита.
Способность люизита образовывать при взаимодействии с сульфгидрильными соединениями малотоксичные продукты была положена в основу разработки высокоэффективных антидотов. Первым в конце Второй мировой войны был предложен 2,3-ди-меркаптопропанол («британский антилюизит», БАЛ) [13]. Антидоты нового поколения - дитиоянтарная кислота и 2,3-димеркаптопропансульфонат натрия (унитиол) - обладают более высокой биодоступностью и меньшей токсичностью. Унитиол входит в набор средств первой помощи, применяемых в токсикологической реанимации, в частности, именно его обычно используют при острых отравлениях соединениями мышьяка [14-15]. В случае поражения люизитом или при наличии подозрения на такую возможность, вероятно, антидотная терапия будет проведена раньше, чем будут отобраны биопробы для анализа. Известно [17], что антидотная терапия поражений люизитом усиливает его экскрецию и перераспределение из тканей в кровоток, что не может не сказаться на результатах определения биомаркера люизита в биопробах. Считается, что унитиол реагирует с соединениями трехвалентного мышьяка с образованием комплексов, способных быстро выводиться из организма с мочой. Однако комплекс, образующийся при взаимодействии унитиола с люизитом или ХВАК, еще ни разу не был детектирован.
Следует отметить, что наиболее вероятен контакт человека и животных со смесью ОВ КНД, а не с каждым из ОВ отдельно. До настоящего времени не проводилось токсикологических экспериментов по экспонированию животных ипритно-люизитными смесями с последующим определением биомаркеров воздействия в биопробах. Совместное определение продуктов превращения этих ОВ проводили в отношении объектов техногенного происхождения, в частности отходов от нейтрализации иприта с примесью люизита [18]. Люизит и продукты его разложения были обнаружены после дериватизации 1,3-пропан-дитиолом и экстракции гексаном производного с последующим ГХ-МС анализом. Среди продуктов гидролиза люизита преобладали оксиды. Анализ доступной литературы свидетельствует о том, что задача хромато-масс-спектрометрического определения биомаркеров люизита и СИ в биопробах при совместном воздействии этих ОВ КНД на организм решалась впервые.
Цель исследования - разработка процедур определения биомаркеров ОВ КНД:
2-хлорвиниларсонистой кислоты, тиодигликоля, тиодигликоль сульфоксида, Р-лиазных метаболитов СИ в биопробах и их применение для исследования токсикологических профилей ОВ КНД, в том числе после проведения антидотной терапии.
Материал и методы исследования. Люизит (ГСО 8245-2003), оксид люизита (ГСО 8674-2005), сернистый иприт (ГСО 8248-2003), 1,3-пропандитиол (CAS 109-80-8, Aldrich Cat.:P5,060-9, Lot.:S40625-028), фениларсиноксид (ФАО) (CAS 637-03-6, Aldrich Cat.: 40,249-4, Lot.:71972-111), унитиол фармакопейный 5%-ный раствор в ампулах по 5 мл, диметилсульфоксид (ТУ 6-09-3818-88), тиодигликоль Aldrich, кат. № 16,678-2, тиодипро-панол, Aldrich, кат.№ 20,534-6, ацетонитрил (ТУ 6-09-5497-91), метанол (ГОСТ 2222-95), ацетат натрия (ГОСТ 199-78), уксусная кислота (ГОСТ 19814-74), аскорбиновая кислота (ГОСТ 2184-77), цитрат натрия (ГОСТ 31227-2004), трихлорид титана (Aldrich, кат. №249998), гептафтормасляный ангидрид (Supelco, кат. № 33170-U), нафталин d8 (ISOTEC 176044-1G).
Комплекс приспособлений для твердофазной микроэкстракции (ТФМЭ), включающий штатив, платформу для термостатирования и перемешивания, холдер для фиксирования микроволокон, Supelco, кат. № 57333-U.
Микроволокно для ТФМЭ с фазой полидиметилсилоксан (100um PDMS), Supelco, кат. №57300-U.
Картриджи для твердофазной экстракции (ТФЭ) OASIS HLB, 60мг фирмы Waters, кат. № WAT094226.
Растворы 2-хлорвиниларсиноксида готовили в 0,6%-ном водном растворе аскорбиновой кислоты.
Буферный раствор рН 4,5 готовили смешиванием 37 мл 0,2 М водного раствора ацетата натрия и 63,0 мл 0,2 М водного раствора уксусной кислоты.
В эксперименте были использованы 4 группы белых нелинейных крыс со средней массой тела 270±24г по 12 особей в каждой: 1-я группа животных получила люизит однократно подкожно в дозе 1,6 мг/кг, 2-я - через 30 мин после введения люизита получила однократно унитиол (70 мкл/100г в/м), 3-я - однократно подкожно раствор ипритно-лю-изитной смеси (1:2) в дозе 1,6 мг/кг по люизиту, 4-ю группу составили контрольные животные, которым вводили раствор, содержащий все вспомогательные реагенты, за исключением ОВ и унитиола.
Раствор люизита предварительно готовили в диметилсульфокси-де (ДМСО) с концентрацией 10 мг/мл (5,3 мкл люизита, d425 1,8 7 9 3, вносили в 1,0 мл ДМСО), перед введением разбавляли дистиллированной водой до конечной концентрации 1,6 мг/мл. Раствор ипритно-люизитной смеси (1:2) предварительно готовили в ДМСО с концентрацией 10 мг/мл (7 мкл люизита, d425 1,8 7 9 3, и 5 мкл сернистого иприта, d415 1,280, вносили в 1,9 мл ДМСО), а перед введением разбавляли дистиллированной водой до конечной концентрации 1,6 мг/мл по люизиту. Животным вводили раствор из расчета 100 мкл на 100 г массы тела (средний объем 0,3 мл на крысу). В ходе эксперимента гибели подопытных животных не наблюдалось.
Контрольным крысам однократно под кожу вводили дистиллированную воду с добавлением ДМСО из расчета 100 мкл на 100 г массы тела. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или иных целей [19] и «Правилами лабораторной практики» (Приказ Минздравсоцразвития РФ» от 23 августа 2010 г. №708н).
Кровь получали под наркозом (уретан 1 г/кг) из сонной артерии. В качестве антикоагулянта использовали цитрат натрия (1 часть антикоагулянта на 9 частей крови). Цельную кровь центрифугировали при 2800 об/мин в течение 14 мин. После центрифугирования отбирали плазму крови, которую собирали от каждого животного отдельно, разливали в пробирки «эппендорф» и замораживали при -70оС. Оставшийся осадок эритроцитов однократно промывали физиологическим раствором и замораживали до проведения анализа. Сбор мочи в первую неделю после интоксикации проводили с водной нагрузкой 5 мл воды внутрибрюшинно. Начиная со второй недели, мочу собирали без водной нагрузки периодически. Общая продолжительность эксперимента составила 77 суток с момента интоксикации.
В качестве внутреннего стандарта при определении ХВАК использовали фениларси-
21
ноксид (ФАО). Навеску ФАО растворяли в небольшом количестве метанола и разводили ацетонитрилом до нужной концентрации.
В качестве внутреннего стандарта при определении ТДГ использовали тиодипропа-нол (ТДП). Растворы ТДГ и ТДП готовили в ацетонитриле. Определение ТДГ и ТДП в виде производных с гептафтормасляным ангидридом проводили методом ГХ-MC в режиме электронной ионизации.
В качестве внутреннего стандарта при определении ß-лиазных метаболитов СИ использовали нафталин-^. Растворы определяемых веществ и внутреннего стандарта готовили в ацетонитриле. Определение ß-лиазных метаболитов СИ проводили методом ГХ-МС после обработки пробы трихлоридом титана в кислой среде, в результате чего
оба ß-лиазных метаболита восстанавливались до 1,1'-сульфонилбис[2-(метилтио)этана].
Определение метаболитов ОВ КНД проводили методом ГХ-МС-ЭИ на хрома-то-масс-спектрометре QP 2010 (Shimadzu) c капиллярной колонкой с неподвижной фазой НР-5 или DB-5 (25 м x 0,2 мм x 0,32 мкм). Условия газохроматографического разделения: температура испарителя 2500С; ввод пробы без деления потока (1,0 мин); температурная программа: начальная температура колонки 900С (1 мин), скорость подъема температуры 200С/мин, конечная температура колонки 2700С, выдержка при конечной температуре 15 мин; газ-носитель гелий, расход газа-носителя через колонку 1 мм3/мин. Температура интерфейса и детектора 270 и 200 0С соответственно.
Масс-спектрометрический анализ производных ХВАК и ФАО проводили при следующих условиях: энергия ионизирующих электронов 70 эВ, температура ионного источника 2000С, режим мониторинга выбранных ионов (МВИ): массовые числа регистрируемых ионов для 2-(2-хлорвинил)-1,3,2-дитиоарсенана m/z 228, 229, для 2-(фенил)-1,3,2-дитиоарсе-нана - m/z 258, 259. Полуколичественную оценку проводили по ионам с m/z 228 и 258, ионы с m/z 229 и 259 использовали для подтверждения идентификации.
Съемку масс-хроматограмм при определении ТДГ и ТДП проводили в режиме МВИ по m/z 241, 300 для бис[2-(гептафторбутирилокси)этил]сульфида и m/z 328, 542 для бис[2-(-гептафторбутирилокси)пропил]сульфида. Полуколичественную оценку проводили по ионам с m/z 241 и 328, ионы с m/z 300 и 542 использовали для подтверждения идентификации.
Условия ГХ-МС анализа при определении ß-лиазных метаболитов СИ: температура испарителя 2500С; ввод пробы без деления потока (1,0 мин); температурная программа: начальная температура колонки 900С (1 мин), скорость подъема температуры 200С/мин до 180оС, 100С/мин до 240оС, выдержка при конечной температуре 20 мин; газ-носитель гелий, расход газа-носителя через колонку 1 мм3/мин. Температура интерфейса и детектора
270 и 2000С, соответственно. Съемку масс-хроматограмм при определении ß-лиазных метаболита в виде 1,1'-сульфонилбис[2-(метилтио)этана] проводили в режиме МВИ по m/z 47, 75, 140 и по m/z 136 для нафталин-^. Полуколичественную оценку проводили по ионам с m/z 140 и 136, ионы с m/z 47, 78 использовали для подтверждения идентификации.
Экспериментальная часть.
Определение 2-хлорвиниларсонистой кислоты в моче.
В виалу вместимостью 4 см3, содержащую 1,5 см3 ацетатного буфера (рН 4,5), помещали 1 см3 образца мочи, 0,005 см3 ацетонитрильного раствора ФАО с концентрацией 0,004 мг/см3 в качестве внутреннего стандарта, 25 мкл ацетонитрильного раствора 1,3-пропандитиола (1:10). Виалу герметизировали завинчивающейся крышкой с прокладкой из фторопластовой ленты и выдерживали 20 мин. при 70оС при постоянном перемешивании пробы. Определение ХВАК в приготовленном образце проводили методом ТФМЭ с применением микроволокна 100 мкм ПДМС в режиме отбора пробы из равновесного пара. Микроволокно 5 мин кондиционировали в инжекторе хроматографа при температуре 280оС, помещали путем прокола фторопластовой прокладки в паровую фазу над образцом на 10 мин. Сорбцию аналитов проводили при постоянном перемешивании и температуре 70оС. Термодесорбцию уловленных соединений проводили в инжекторе хроматографа при указанных выше условиях ГХ-МС анализа.
Линейный диапазон разработанной процедуры от 0,1 до 20,0 нг/мл; уравнение линейной зависимости y = 0,167.x (n = 3); коэффициент корреляции R2 = 0,998. Продолжительность анализа 1 ч.
Определение 2-хлорвиниларсонистой кислоты в плазме крови.
К 1 см3 плазмы крови добавляли 3 см3 ацетонитрила, пробу встряхивали и проводили центрифугирование в течение 15 мин при 12000 об/мин. Надосадочную жидкость концентрировали в токе азота досуха. Сухой остаток перерастворяли в 1,5 см3 буфера рН 4,5. Далее анализ проводили аналогично анализу мочи.
Линейный диапазон разработанной процедуры от 1,0 до 20,0 нг/мл; уравнение линейной зависимости y = 0,0051. (n = 3); коэффициент корреляции R2 = 0,995. Продолжительность анализа 3 ч.
Определение 2-хлорвиниларсонистой кислоты в эритроцитах.
Эритроцитарную массу, полученную после центрифугирования цельной крови, промывали однократно физиологическим раствором в соотношении V^V^^^ р ра как (1:1). К промытой физиологическим раствором эритроцитарной массе добавляли равный объем деионизованной воды, инкубировали 10 мин при +4оС для получения гемолизата. К 1 объему гемолизата добавляли 2 объема ледяного метанола (-20оС) и замораживали при -20оС. Через 3 ч пробу размораживали, декантацией сливали надосадочную жидкость. К осадку добавляли 2 объема ледяного ацетонитрила (-20оС) и замораживали при -20оС. Через 3 ч пробу размораживали, метанольный и ацетонитрильный экстракт объединяли и концентрировали в токе азота досуха. Сухой остаток перерастворяли в 1,5 см3 буфера рН 4,5. Далее анализ проводили аналогично анализу мочи.
Линейный диапазон разработанной процедуры от 10,0 до 200,0 нг/мл; уравнение линейной зависимости y = 0,0112. (n = 3); коэффициент корреляции R2 = 0,995. Продолжительность анализа 8 ч.
Определение метаболитов СИ в моче.
К пробе мочи объемом 1 мл, содержащей 0,02 см3 ацетонитрильного раствора ТДП с концентрацией 0,01 мг/см3, добавляли 0,7 мл солянокислого раствора хлорида титана (15%-ный раствор в 20-30%-ной соляной кислоте). Пробу термостатировали при 80оС в течение 1 ч с перемешиванием. Затем раствор нейтрализовали 10М водным раствором гидроксида натрия до рН 6. Полученный образец подвергали центрифугированию в течение 15 мин при 3000 g. Надосадочную жидкость аккуратно отбирали одноразовым медицинским шприцом вместимостью 5,0 мл и делили на 2 равные части. Одну часть использовали для определения ß-лиазных метаболитов СИ, другую - для низкомолекулярных метаболитов СИ - ТДГ и ТДГО.
1. Определение ß-лиазных метаболитов СИ.
Жидкостную экстракцию ß-лиазных метаболитов СИ из надосадочной жидкости проводили последовательно ацетонитрилом (2х1мл) и диэтиловым эфиром (1мл) с высаливанием хлоридом натрия (добавка к образцу 1 г хлорида натрия). Объединенный ацето-нитрильно-эфирный экстракт концентрировали в токе азота до 0,05 мл, добавляли 0,005 мл ацетонитрильного раствора нафталина-^ с концентрацией 100 мкг/мл и анализировали при указанных выше условиях ГХ-МС анализа.
2. Определение суммарно ТДГ и ТДГО.
Надосадочную жидкость пропускали через сорбент (1 капля/с). Сорбент Oasis HLB емкостью 60 мг предварительно кондиционировали 2 см3 ацетонитрила и 2 см3 дистилли-
рованной воды. После пропускания пробы, сорбент промывали 1 см3 дистиллированной воды и сушили под слабым вакуумом в течение 5 мин. Элюирование целевых веществ проводили ацетонитрилом (2х1см3) в виалу объемом 5 см3 с коническим дном. Элюат упаривали досуха в роторном испарителе при 60оС. Осадок перерастворяли в 0,06 см3 смеси ацетонитрил ГФМА в соотношении 1:1. Образец инкубировали при 50оС в течение 30 мин. К охлажденному образцу добавляли 2,0 мл деионизованной воды, 1г хлорида натрия и экстрагировали дериват ТДГ в гептан. Гептановый экстракт концентрировали в токе азота до 0,05 мл и определяли ТДГ при указанных выше условиях ГХ-МС анализа.
При низких концентрациях определяемого вещества объем биопробы для анализа может быть увеличен до 10 мл. При этом должен быть пропорционально увеличен объем солянокислого раствора трихлорида титана, используемый при пробоподготовке. Для анализа больших объемов проб до 10 мл необходимо использовать картридж Oasis HLB с массой сорбента 500 мг.
Линейный диапазон разработанной процедуры для определения суммарно ТДГ и ТДГО от 1 до 400,0 нг/мл; уравнение линейной зависимости y = 0,1317. (n = 3); коэффициент корреляции R2 = 0,996. Продолжительность анализа 3 ч.
Результаты и обсуждение. Важной особенностью определяемых метаболитов ОВ КНД является их присутствие в организме в виде окислительно-восстановительной пары. При определении методом ГХ-МС в процессе предшествующей пробоподготовки все метаболиты переводятся в восстановленную форму. В этом случае состояние баланса ХВАК/ХВАОК; ТДГ/ТДГО; МСМТЭСЭ/СБМСЭ остается неизвестным. Данное обстоятельство не препятствует установлению факта воздействия ОВ КНД на организм, напротив - способствует ему, обеспечивая обнаружение биомаркера в пробе независимо от состояния окисления. Индивидуальное определение окисленных и восстановленных форм метаболитов ОВ КНД достигается методами жидкостной хромато-масс-спектроме-трии [20]. Результаты такого определения важны для понимания механизмов воздействия ОВ КНД на организм и дальнейшего совершенствования средств и методов антидотной терапии.
Литературные данные по определению ХВАК в биопробах представлены в весьма ограниченном количестве публикаций [21-29]. Определение ХВАК в данных работах проводили методом ГХ-МС с электронной ионизацией после дериватизации вициналь-ными дитиолами (1,2-этандитиолом, 1,3-пропандитиолом или 1,2-димеркаптопропан-1-о-лом) в виде летучих циклических дисульфидов.
Авторы [30] определяли ХВАК путем дериватизации целевого вещества 1,3-про-пандитиолом непосредственно в водной пробе (в том числе и моче) с последующим детектированием летучего циклического дисульфида в режиме МВИ методом ГХ-МС в сочетании с ТФМЭ. Предел обнаружения разработанной методики 7,4 пг/мл мочи. Ограничением предложенной методики является необходимость использования дорогостоящего автоматизированного дозирующего устройства. Также методика не была апробирована на образцах in vivo, что не позволяло вынести суждения о ее применимости к определению ХВАК в конъюгированной форме. В нашей лаборатории данная процедура была модифицирована и применена к анализу образцов мочи, полученных в разные сроки после введения лабораторным животным ОВ. Также данная процедура была адаптирована к анализу проб плазмы крови и эритроцитов [31].
Результаты определения ХВАК в биопробах лабораторных животных.
По описанным выше процедурам определения биомаркеров ОВ КНД были проанализированы образцы биопроб животных всех групп, задействованных в токсикологическом эксперименте. Разработанные методики позволили определить ХВАК методом ГХ-МС в моче крыс через 2,5 месяца, в плазме крови и эритроцитах - через 7 суток после введения люизита в дозе 1,6 мг/кг и ипритно-люизитной смеси в дозе 1,6 мг/кг по люизиту.
На рисунке 1 в качестве примера представлена масс-хроматограмма, полученная после ГХ-МС-анализа образца мочи животных 1-й группы через 31 сутки после интоксикации. На рисунке 2 представлены диаграммы, иллюстрирующие изменение содержания ХВАК в моче экспонированных ОВ КНД животных. Для наглядности начальная фаза экскреции (первые сутки) представлена на диаграмме а, а весь последующий период (до 77 суток) - на диаграмме б, поскольку содержание ХВАК в моче в первые сутки после интоксикации на несколько порядков выше, чем в последующие дни исследования.
Профили экскреции ХВАК в случае антидотной терапии унитиолом и в ее отсутствие существенно различаются в первые сутки после введения унитиола (рис. 2а). Максимальная концентрация ~30 мкг/мл ХВАК в исследованных образцах мочи зафиксирована через 3-6 ч после интоксикации и последующего лечения унитиолом. Без введения унитиола ориентировочное содержание ХВАК в моче животных 1-й и 3-й групп в период 3-6 ч составляет ориентировочно 2,5 и 5,0 мкг/мл соответственно. Через 24 ч после интоксикации содержание ХВАК в моче животных, получивших унитиол, как минимум в 5 раз выше в сравнении с образцами мочи, полученными от животных 1 и 3 групп. Содержание ХВАК в моче животных 3-й группы в первые 10 дней после экспозиции ОВ выше примерно в 2 раза. И это при том, что дозы люизита как такового и люизита в составе смеси с ипритом (2:1) были одинаковыми. СИ и люизит реализуют различные механизмы воздействия на организм, но первичные мишени воздействия для них одни и те же. Это сульфгидрильные группы. Активные сайты воздействия частично блокированы ипритом, поэтому люизит (ХВАК) в меньшей степени конъюгирован с биомолекулами, активно перераспределяется в кровоток и выводится с мочой. Более активному выведению может способствовать и образование комплексов люизита (ХВАК) с продуктом гидролиза СИ - ТДГ. Начиная с 48 ч после отравления значимых отличий, с учетом введенной дозы и типа ОВ, в содержании ХВАК в образцах, полученных от животных всех групп, не обнаружено.
На рисунках 3 и 4 представлены диаграммы, иллюстрирующие изменение содержания ХВАК в плазме крови и эритроцитах животных исследованных групп.
Экспериментально установлено, что содержание метаболита люизита в плазме крови и эритроцитах животных всех групп через 48 ч составило ориентировочно 10 и 150 нг/мл соответственно. Через 7 суток после отравления в плазме крови животных 1-й и 2-й групп содержание ХВАК зафиксировано на пределе обнаружения методики ~1 нг/мл, 3-й группы - 3 нг/мл. Следует отметить, что в эритроцитах крыс 1-й и 3-й групп, не получавших унитиол, снижение содержания ХВАК через 7 суток не обнаружено. Полученные данные согласуются с результатами, представленными в работе [32]. Авторы [32] определяли ХВАК методом ГХ-МС в виде производного с БАЛ и гептафторбутирилимидазолом в моче и цельной крови морских свинок после интоксикации люизитом дозой 0,25 мг/кг. В образцах мочи ХВАК была обнаружена в первые 12 ч после экспозиции, в цельной крови - спустя 10 дней. Проведенные исследования на образцах крови, in vitro экспонированной люизитом [14C] (20нМ-0,2мМ), показали, что более 90% радиоактивной метки обнаруживалось в эритроцитах, причем 25-50% было связано с глобином.
На рисунке 5 представлена масс-хроматограмма, полученная после ГХ-МС - анализа образца мочи животных 3-й группы через 6 суток после интоксикации. На рисунке 6 представлены результаты исследования образцов мочи животных 3-й группы на содержание
метаболитов СИ - суммарно ТДГ и ТДГО и Р-лиазных метаболитов СИ.
Таким образом, анализ проб мочи животных 3-й группы показал, что при подкожном введении крысам ипритно-люизитной смеси (1:2) в дозе 1,6 мг/кг по люизиту концентрация ТДГ в моче составила от 3 мкг/см3 до 10 нг/см3. При этом максимальная концентрация ТДГ была отмечена через 6 часов после интоксикации. Концентрации ТДГ в моче животных контрольной группы не превышали 1-3 нг/мл. Повышенные концентрации ТДГ в моче фиксировались в течение 7 дней после интоксикации. Содержание |3-лиазных метаболитов СИ в моче животных 3-й группы в первые сутки после отравления было на уровне 100 нг/мл и оставалось на уровне
22
Токсикологический вестник №з (120)
10 нг/мл в течение 7 суток.
Следует отметить, что низкомолекулярные продукты гидролиза СИ (ТДГ и ТДГО) являются соединениями биогенными. ТДГ может присутствовать в лакокрасочных покрытиях, полимерных и фотографических материалах, чернилах и, в низких концентрациях, в моче и плазме крови человека или животных. В рамках настоящих исследований было проведено определение ТДГ в моче 10 добровольцев разного возраста и разной половой принадлежности. Содержание ТДГ у разных людей варьировало от 1 до 14 нг/мл. Фоновые содержания ТДГ в моче на уровне 1-12 нг/мл были зафиксированы и в более ранних исследованиях [33, 34]. С учетом того, что в 24% случаев концентрации ТДГ в моче экспонированных СИ людей не превышали 25 нг/мл, ни ТДГ, ни ТДГО на уровнях 1-10 нг/мл не могут рассматриваться в качестве доказательных маркеров воздействия СИ или ипритно-люизитных смесей на организм человека и могут быть использованы в таком качестве только при детектировании значительно более высоких концентраций (согласно [35], выше 100 нг/мл).
Р-Лиазные метаболиты являются доказательными маркерами экспозиции СИ в связи с их отсутствием в моче неэкспонированных людей, и их обнаружение на любом уровне (вплоть до 0,1-0,3 нг/мл) убедительно доказывает факт экспозиции. В то же время, как
отмечают исследователи [36], Р-лиазные метаболиты детектируются в организме в течение более короткого времени. Так, в моче, отобранной через 2-3 дня у двух человек, подвергшихся случайному воздействию СИ из снарядов времен Первой мировой войны,
были обнаружены сопоставимые концентрации ТДГ (52-80 нг/мл) и Р-лиазных метаболитов (42-57 нг/мл). В то же время при ретроспективном исследовании мочи, отобранной через 13 дней после экспозиции, концентрация Р-лиазных метаболитов составила 0,1-5 нг/мл, в то время как концентрации ТДГ все еще оставались достаточно высокими (11-72 нг/мл). Таким образом, для наиболее полной характеристики экспозиции СИ по результатам анализа мочи необходим анализ метаболитов, образующихся по обеим ветвям токсикологического профиля.
Заключение. В рамках проведенного токсикологического эксперимента показано, что максимальные уровни метаболитов ОВ КНД обнаруживаются в моче и эритроцитах. Показано, что в составе ипритно-люизитной смеси, как и в случае применения унитиола, люизит (ХВАК) более активно перераспределяется из тканей в кровоток и выводится с мочой в первые сутки после воздействия. Таким образом, влияние антидотной терапии, как и конкурирующего агента, радикально меняет токсикологический профиль люизита. Проведение антидотной терапии унитиолом существенно активизирует экскрецию ХВАК в первые сутки после введения антидота. Антидотная терапия повышает возможность обнаружения ХВАК в моче в течение двух суток после введения унитиола. При этом возможность обнаружения биомаркера люизита в моче сохраняется даже в отдаленные сроки после воздействия.
Предложен алгоритм, позволяющий установить факт воздействия ипритно-люизит-ной смеси на организм. При этом в биожидкостях, полученных в опыте in vivo после введения крысам ипритно-люизитной смеси (1:2) в дозе 1,6 мг/кг по люизиту, определены
как тиодигликоль и р-лиазные метаболиты сернистого иприта, так и метаболит люизита - 2-хлорвиниларсонистая кислота. Установлено, что наилучшим ретроспективным биомаркером является 2-хлорвиниларсонистая кислота, которая была достоверно идентифицирована в моче спустя 77 суток после экспозиции, в то время как метаболиты сернистого иприта не определяются в рамках разработанных процедур уже через 7 суток.
23
24
Токсикологический вестник №з (120)
242.00 (1. 244.00 (1. 0) 0) а
7-УШ эрвш аил)- -дит иоар сенш 1
ят 8.77 9
.А '\_
8,3 8,4 8.5 8.6 8.7
9.1 9.2
М1С1
258.00 (1.00) 259.00 (1.00)
2.252.001.75
2-(фенил
КГ 10.591
)-1/3/2-дитиоарсе
О
Рис. 1. Масс-хроматограмма, полученная после ГХ-МС - анализа образца мочи животных 1-й группы через 31 сутки после интоксикации: а - 2-(2-хлорвинил)-1,3,2-дитиоарсенана, б - пик внутреннего стандарта 2-(фенил)-1,3,2-дитиоарсенана
5
25
а
ч: о
и
1 0 000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
0-3ч
у у у у У У У У У У
У У У У ■■
У У У У У У У У У У У У У У У У
_ 1!
т т У У У У У У У У У У У У У У У У У У У У У У Г-± 1
[й: я: ■■
§ т й! | 1 ¡и ы
0-3 ч к и Я£ ---Г^ЬЕч
3-6ч
Время после экспозиции ОВ, часы
24ч
НЛюизит
ИЛюизит + Унитиол ИИпритно-люизитная смесь
i «и
О О сд СО
ООО СО СП
м м м м
о со
Время после экспозиции ОВ, сутки
О ООО Ю сд О ю со
НЛюизит
□ Люизит + Унитиол ИИпритно-люизитная смесь
Рис. 2. Диаграммы, иллюстрирующие изменение содержания ХВАК в моче животных 1, 2 и 3 групп: а -изменение содержания ХВАК в первые сутки после интоксикации; б - изменение содержания ХВАК со 2-х по 77-е сутки
26
Токсикологический вестник №з (120)
15 14 13 12
11 Ч 10
1 9 ■ 8
и V
^ 7
М
* 6 ® II 5 ! 4 I 3 О 2 1 0
У У У У У У У У У У У У У У У У У У У У У
48час
/■ад
¿«ьл
Время после экспозиции ОВ, часы
7суток НЛюизит
□Люизит + Унитиол ИИпритно-люизитная смесь
Рис. 3- Диаграмма, иллюстрирующая изменение содержания ХВАК в плазме крови животных 1, 2 и 3 групп
240 220 200
80 60 40 20 0
—;-1
1 \ 3
' У ' У • У 'У ' * ' ' • У 'У Щ-й ¡8 ж
1 ^ V] и
' у у у ; • у у у ; • у у у \ ' У У у ' У У У \ 1 § чз—
Время после экспозиции ОВ, часы
7суток НЛюизит
□Люизит + Унитиол ИИпритно-люизитная смесь
Рис. 4. Диаграмма, иллюстрирующая изменение содержания ХВАК в эритроцитах животных 1-й, 2-й и 3-й групп
27
iie " t» «.w eis
]J*JH>I1JH! ^jy.fln H1-BOI
I
J4 (
(б) - бис[2-
(гепт афторбутирилокси)-пропил]сульфид RT 6,558
/
ш
У! ist V Ч
Рис. 5. Масс-хроматограмма, полученная после ГХ-МС-анализа образца мочи животных 3-й группы через 6 суток после интоксикации: а - бис[2-(гептафторбутирилок-си)этил]сульфид, б - бис[2-(гептафторбутирилокси)пропил] сульфид (внутренний стандарт)
800 т-,.■.,-
. 500
а 300
200
□ ТДГ ■ß-лиазные метаболиты
И ii
И ы 1 i [
Время после экспозиции крыс ипритно-люизитной смесью,часы
Рис. 6. Изменение содержания ТДГ и р-лиазных метаболитов СИ в моче животных 3-й группы
0
0-3ч
3-6ч
24ч
48ч
144ч
168ч
28
Токсикологический вестник №з (120)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Орлова О.И., Савельева Е.И., Хлебникова Н.С. Методы обнаружения метаболитов сернистого иприта в объектах биологического происхождения. Аналитический обзор // Журнал аналитической химии, 2013.
Т. 68. - № 1. - С. 4-14.
2. Jakubowski E.M., Woodard C.L., Mershon M.M., Dolzine T.W. Quantification of thiodiglycol in urine by electron ionization gas chromatography-mass spectrometry // J. Chromatogr., 1990. - Vol. 528. -
P. 184-190.
3. Black R.M., Read R.W. Methods for the analysis of thiodiglycol sulfoxide, a metabolite of sulfur mustard, in urine by gas chromatography-mass spectrometry //
J. Chromatogr., 1991. - Vol. 558. - P. 393-404.
4. Hambrook J.L., Harrison J.M., Howells D.J. and Schoc C. Biologicfl fate of sulfur mustard (1,1 -Thiobis(2-chloroethane): urinary and faecal excretion of 35S by rat after injection
or cutaneous application of 35S-labelled sulfur mustard. Xenobiotica. - 1992. - Vol. 22. -P. 65-75.
5. Hambrook J.L., Howells D.J. and Schock C., Biologicfl fate of sulfur mustard (1,1-thiobis(2-chloroethane)): uptake, distribution and retention of 35S in skin and in blood after cutaneous application of 35S-sulfur mustard in rat and comparison with human blood in vitro. Xenobiotica. - 1993. -Vol. 23. - P. 537-561.
6. Noort D., Benschtop H.P. and Black R.M. Biomonitoring of exposure to chemical warfare agents: a review // Toxicol.Appl. Pharmacol. - 2002. - Vol. 184. - P. 116-126.
7. Black R.M., Hambrook J.L, Howells D.J. and Read R.W. Biologicfl fate of sulfur mustard, 1,1-Thiobis(2-chloroethane). Urinary excretion profiles of hydrolysis products and B-lyase metabolites of sulfur mustard after cutaneous application in rats // J. Anal. Toxicol. -
1992. - Vol. 16. - P. 79-84.
8. Riches J., ReadR., Black R.M. Analysis of the sulphur mustard metabolites thiodiglycol and thiodiglycol sulphoxide in urine using isotope-dilution gas chromatography-ion trap tandem mass spectrometry //
J. Chromatogr. B. - 2007. - Vol. 845. - P. 114-120.
9. Robin M. Black a; Robert W. Read, Environmental and biomedical sample analysis in support of allegations of use of chemical warfare agents // Toxin Reviews. July. - 2007. - Vol. 26. Issue 3. - P. 275-298.
10. Brian A. Logue et al. Solid-Phase Microextraction Gas-Chromatography Mass-Spectrometry of Sulfur Mustard Metabolites in Hair. SDSU. PITTCON 2006. March 12-17. 2006. Orlando. Florida.
11. Koyama J., Matsumoto T., Ohtsu Y. andNakata O. Determination of thioglycolic acid, dithiodiglycolic acid, cysteine and cystine in hair-waving solutions by HPLC. Bunseki Kagaku. - 1988. - Vol. 37. - P. 142-146. (http:// www.springerlink.com/content/uu531p7844723251/fulltext. pdf).
12. Stanelle R., McShane W., Dodova E., Pappas R. Rapid analysis of Lewisite metabolites in urine by high-performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry // J. Anal Toxicol. - 2010. - Vol. 34. - № 3. - P. 122-128.
13. Vilensky JA., Redman K. British anti-Lewisite (Dimercaprol): an amazing history //Ann. Emerg. Med. -2003. - Vol. 41. - P. 378-383.
14. Aposhian H. V DMSA and DMPSswater soluble antidotes for heavy metal poisoning // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. -1983. - Vol. 23. - P. 193-215.
15. Aposhian H. V., Carter D. E., Hoover T. D., Hsu C. A., Maiorino R. M., Stine E. DMSA, DMPS, and DMPAsas arsenic antidotes // Fundam. Appl. Toxicol. - 1984. - Vol.4.
- P. S58-S70.
16. Aposhian H. V., Maiorino R. M., Gonzalez-Ramirez D., Zuniga-Charles M., Xu Z., Hurlbut K. M., Junco-Munoz P., Dart R.C., Aposhian M. M. Mobilization of heavy metals by newer, therapeutically useful chelating agents // Toxicology. -1995. - Vol. 97. - P. 23-38.
17. Gong Z., Jiang G., Cullen W.R., Vasken Aposhian H., Le X. Determination of Arsenic Metabolic Complex Excreted in Human Urine after Administration of Sodium 2,3-Dimercapto-
1-propane Sulfonate // Chem. Res. Toxicol. - 2002. - Vol. 15.
- P. 1318-1323.
18. Creasy W.R. et al // Environ. Sci. Technol. - 1999. - Vol. 33. - P. 2157-2162.
19. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Страсбург. - 1986. - ETS №123.
20. Read R.W. and Black R.M. Analysis of b-lyase metabolites of sulfur mustard in urine by electrospray liquid chromatography-tandem mass spectrometry //
J. Anal. Toxicol. 28. - 2004. - P. 346-351.
21. Logan T., Smith J., Jakubowski E., Nielson R. Verification of lewisite exposure by the analysis of 2-chlorovinyl arsonous acid in urine // Toxicol Meth. - 1999. - Vol. 9. - P. 275-284.
22. Wooten J., Ashley D., Calafat A. Quantitation of
2-chlorovinylarsonous acid in human urine by automated solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry // J. Chromatogr. B. Anal. Technol. Biomed Life Sci. - 2002. - Vol. 772. - P. 147-153.
23. Fidder A., Noort D., Hulst et al. Biomonitoring of exposure to lewisite based on adducts to haemoglobin // Arch. Toxicol. - 2000. - Vol. 74. - P. 207-214.
24. Smith J., Logan T., Szafraniec L., Jakubowski EM. Spectroscopic characterization of the geminal isomer of Lewisite // Anal Lett. - 1995. - Vol. 28. - P. 1541-1554.
25. Waters W., Williams J. Hydrolyses and derivatives of some vesicant arsenicals // J. Chem Soc. - 1950. -
P. 18-22.
26. Jakubowski E., Smith J., Logan T. Verification of Lewisite exposure: quantification of chlorovinylarsonous acid in biological samples // Proceedings of the 1993 Medical
Defense Bioscience Review. Aberdeen Proving Ground, Md: US Army Medical Research Institute of Chemical Defense. -1993. AD A275667.
27. Shirley D. Tuorinsky (senior editor) Medical Aspects of Chemical Warfare, Chapter 22 Medical Diagnostics // Library of Congress. Washington. DC 20307-5001. - 1997. - P. 728-731.
28. Stanelle R., McShane W., Dodova E., Pappas R. Rapid analysis of Lewisite metabolites in urine by high-performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry // J. Anal Toxicol. - 2010. - Vol. 34. - № 3. - P. 122-128.
29. Gong Z., Jiang G., Cullen W. Determination of arsenic metabolic complex excreted in human urine after administration of sodium 2,3-dimercapto-1-propane sulfonate // Chem Res Toxicol. - 2002. - Vol. 15. -
P. 1318-1323.
30. Wooten J., Ashley D., Calafat A. Quantitation of 2-chlorovinylarsonous acid in human urine by automated solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry // J. Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. - 2002. - Vol. 772. - P. 147-153.
31. NL.Koryagina, E.S. Ukolova, E.I. Savel'eva, N.G. Voitenko, O.I. Orlova, R.O. Jenkins, N.V Goncharov. High-Sensitivity Determination of 2-Chlorovinylarsonous Acid in Biomedical Samples for Retrospective Detection of Exposure to Lewisite Upon Antidotal Therapy // Spectroscopy. - 2011.-Vol. 26. - № 1. - P. 1-10.
32. Fidder A., Noort D., Hulst et al. Biomonitoring of exposure to lewisite based on adducts to haemoglobin // Arch. Toxicol. - 2000. - Vol. 74 - P. 207-214.
33. Wils E.R.J., Hulst A.G., de Jong A.L., et al. Analysis of thiodiglycol in urine of victims of an alleged attack with mustard gas // J. Anal. Toxicol. 1985. V. 9. P. 254-257.
34. Wils E.R.J., Hulst A.G., A. G. van Laar. Analysis of thiodiglycol in urine of victims of an alleged attack with mustard gas. Part II // J. Anal. Toxicol. - 1988. - Vol. 12. - P. 15-19.
35. Report of U.S. Army Center for Health Promotion and Preventive Medicine. Candidate Biomarkers, http://chppm-www.apgea.army.mil/doem/EMP- files/bmark.doc.
36. Boyer A.E., Ash D., Barr D.B., et al., Quantitation of the sulfur mustard metabolites 1,r-sulfonyl[2-(methylthio) ethane] and thiodiglycol in urine using isotope-dilution gas chromatography-tandem mass spectrometry // J. Anal. Toxicol. - 2004. - Vol. 28. - P. 327-332.
N. L. Koryagina, E. I. Savelieva, E. S. Ukolova, A. I. Ukolov, N.S. Khlebnikova, N. G. Voitenko, A.S. Radilov
Gas Chromatography-Mass Spectrometry Study of Toxicological Profiles of Blister Agents
Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology, Federal Unitary Enterprise, Federal Medical Biological Agency, g/p Kuzmolovsky, Vsevolozhsk District, Leningrad Region
The excretion profiles of biomarkers of blister agents after intoxication of rats by lewisite and piryte- lewisite mixture at a dose of 1.6 mg/kg were studied. The possibility of determination of lewisite markers in the organism after antidotal therapy with unithiol was assessed. It was found out that the excretion of 2-chlorovinylarsonous acid (CVAA) the first two days after unithiol treatment develops more actively as compared with that in the absence of antidotal therapy. It was shown that the most reliable biomarker to establish a retrospective exposure of an organism to sulfur mustard-lewisite mixtures is
CVAA which was detected with confidence in urine 77 days after exposure, while sulfur mustard metabolites such as thiodiglycol, thiodiglycol sulfoxide, and |3-lyase metabolites, could not be detected by existing procedures even 7 days after exposure.
Переработанный материал поступил в редакцию 11.04.2013 г
29
