CC BY
45
THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2019
Орлова О.И, Савельева Е.И., Каракашев Г.В., Вивуланец Е.В.
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ N-АЦЕТИЛЦИСТЕИНА ПРИ ПОРАЖЕНИЯХ СЕРНИСТЫМ ИПРИТОМ С УЧЁТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ БИОМОНИТОРИНГА
ФГУП «НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский
Обоснована необходимость оценки влияния скавенджеров, являющихся, по сути, поглотителями свободных радикалов или активных форм кислорода, на профили экскреции биомаркеров экспозиции/эффекта токсикантов при изучении механизмов защитного действия. Исследованы образцы мочи крыс через 3 ч, 1, 2, 3, 7 сут после подкожного введения сернистого иприта (СИ) в дозе 2 мг/кг как в отсутствие терапии, так и при использовании ACC в качестве скавен-джера. Методом ВЭЖХ-МС/МС в моче крыс определены концентрации депуринизированного фрагмента аддукта СИ с ДНК - Ы7-гидроксиэтилтиоэтил гуанина (N7-HETEG) и аддукта с N-ацетилцистеином (АЦЦ) - 1,1' сульфонилбис-[2^-(^ацетилцистеинил)этана. Установлено, что терапия АЦЦ активизирует выделение с мочой его аддукта с СИ в первые часы после отравления. Через сутки и далее терапия АЦЦ приводит к снижению концентраций аддуктов СИ с АЦЦ и гуанином в сравнении с концентрациями этих аддуктов в моче крыс, не получавших лечения.
Ключевые слова: сернистый иприт; ацетилцистеин; скавенджер; биопробы; биомаркер;
метаболит; аддукт; ДНК; высокоэффективная жидкостная хроматография - масс-спектрометрия.
Для цитирования: Орлова О.И, Савельева Е.И., Каракашев Г.В., Вивуланец Е.В. Исследование защитного действия n-ацетилцистеина при поражениях сернистым ипритом с учётом результатов биомониторинга. Медицина экстремальных ситуаций. 2019; 21(1): 145-154.
Для коррспонденции: Орлова Ольга Игоревна, научный сотрудник лаборатории аналитической токсикологии ФГУП «НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России, 188663, Ленинградская область, Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский. Е-mail: [email protected]
Orlova O.I., Savelyeva E.I., Karakashev G.V., Vivulanets E.V.
THE STUDY OF THE PROTECTIVE ACTION OF N-ACETYLCYSTEINE IN DAMAGES TO SULFUR MUSTARD GAS TAKING INTO ACCOUNT THE RESULTS OF BIOMONITORING
Scientific Research Institute of Hygiene, Federal Medical and Biological Agency, Kuzmolovsky, 188663, Russian Federation
The necessity of assessing the effect of scavengers on the excretion profiles of biomarkers of exposure/toxicant effects in the study of the mechanisms of protective action is substantiated. Rat urine samples were studied at 3 h, 1, 2, 3, 7 days after subcutaneous administration of sulfur mustard (SM) at a dose of 2 mg/kg, both in the absence of therapy and when using ACC as a scavenger. The rat urine concentration of the depurized fragment of the SM adduct with DNA - N7-hydroxy-ethylthioethyl guanine (N7-HETEG) and the adduct with N-acetylcysteine (ACC) - 1,1 'sulfonylbis [2-S-(N -acetylcysteinyl) ethane with the use of high performance liquid chromatography - mass spectrometry. ACC therapy was established to activate urinary excretion of its adduct with SM in the first hours after poisoning. In one day and later, ACC therapy leads to a decrease in the concentra-
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
tions of SM adducts with ACC and guanine in comparison with the concentrations of these adducts in the urine of not treated rats.
Keywords: sulfur mustard; acetylcysteine; scavenger; bioassays; biomarker; metabolite; adduct; DNA; high performance liquid chromatography - mass spectrometry.
For citation: Orlova O.I., Savelyeva E.I., Karakashev G.V., Vivulanets E.V. The study of the protective action of n-acetylcystein in damages to sulfur mustard gas taking into account the results of biomonitoring. Meditsina ekstremal'nykh situatsiy (Medicine of Extreme Situations, Russian journal) 2019; 21(1): 145-154. (In Russ.).
For correspondence: Olga I. Orlova, MD, Scientific Research Institute of Hygiene, Federal Medical and Biological Agency, Kuzmolovsky, 188663, Russian Federation. E-mail: [email protected]
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Received: February 5, 2019 Accepted: February 21, 2019
Введение
Сернистый иприт (СИ) [бис(2-хлорэтил) сульфид] является наиболее известным боевым отравляющим веществом кожно-нарывного действия. Опасность поражения СИ сохраняется в связи с угрозой террористических актов, локальных военных конфликтов [1, 2], непреднамеренного контакта с затопленным или захороненным химическим оружием [3-7]. Актуальной остается проблема идентификации продуктов превращений СИ, установления факта поражения людей, находившихся в месте инцидента.
Патологические последствия воздействия СИ наступают вследствие сочетания следующих событий: воспалительного процесса, гибели клеток и целого комплекса клеточных стресс-индуцированных ответов. Образование аддук-тов СИ с ДНК отражает механизм воздействия СИ, поэтому их определение в биоматрицах и исследование кинетических профилей важно для углубленного понимания этиологии патологических процессов, запускаемых в организме при воздействии СИ. Особенно это относится к отдаленным эффектам, таким как онкологические риски. Биоаналитические исследования, направленные на определение аддуктов с ДНК при воздействии СИ, особенно важны для разработки защитных средств, средств терапии и, в первую очередь, антидотов и скавенджеров.
До настоящего времени открытым остается вопрос разработки эффективной терапии поражений СИ. Известно, что СИ вызывает серьез-
ное повреждение кожных покровов, однако молекулярный механизм протекающих процессов еще недостаточно изучен. Исторически, при терапии термических ожогов и ожогов, вызванных воздействием СИ, применялись одинаковые методы терапии, поэтому ряд работ посвящен оценке схожести и различий повреждений кожи, вызванных этими двумя видами ожогов [8, 9]. Исходя из уровней экспрессии генов, были определены потенциальные терапевтические цели для заживления ран и значительного перекрывания воспалительных механизмов. Например, канонические сигнальные пути ГЬ-6, ГЬ-10, и р38 МАРК активизируются как при термических, так и вызванных СИ ожогов [9]. Это позволяет предположить, что фармакологические и биологические модуляторы, применяемые при терапии термических повреждений, также будут эффективны и при химических ожогах от СИ. Однако авторы [10] задаются вопросом, существует ли некая этиологическая разница между термическими и химическими ожогами, из-за которой схемы лечения тех и других не будут совпадать? В результате установления этих различий путем исследования метаболических профилей биомаркеров СИ может быть подобрана целевая терапия, нацеленная на купирование повреждений, вызванных СИ. Биомаркеры на протяжении многих лет используются в медицине и токсикологии в целях диагностики факта и последствий воздействия токсичных соединений на организм. Согласно определению [11], биомаркер представляет собой объективно измеренную и оцененную характери-
THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION
стику, являющуюся индикатором нормального физиологического или патологического процессов, либо фармакологического отклика на проводимую терапию. Сегодня термин чаще всего употребляется в контексте «молекулярный» или «клеточный» биомаркер, фокусируясь на небольшой подгруппе биомаркеров, характеризующих роль реакционноспособных молекул, образующих аддукты с ДНК, которые, в свою очередь, считаются вовлеченными в процесс канцерогенеза, а также аддукты с белками и мочевыми метаболитами. Эта группа определяется как биомаркеры воздействия, способные в ряде случаев охарактеризовать манифестацию токсического эффекта и выступающие в данном контексте как биомаркеры эффекта.
Появление высокочувствительных аналитических приборов и методик создало условия для развития новой научной области, занимающейся изучением образования, устойчивости, репарации аддуктов различных химических соединений с ДНК. Понимание этих событий способствует установлению закономерностей метаболических процессов и молекулярного механизма воздействия на организм как токсичных веществ, так и антидотов. Механизм токсического действия сернистого и азотистого ипритов связывают с их высокой растворимостью в липидах, способностью проникать через клеточные мембраны и алкилировать пурино-вые основания, входящие в структуры ДНК и РНК. В результате этого повреждаются структуры нуклеиновых кислот, нарушаются биохимические процессы, обеспечивающие общую реактивность организма, регенерацию тканей, передачу наследственных признаков. Наиболее чувствителен к иприту гуанин [12]. Органами-мишенями при действии СИ являются кожа, глаза и легкие. Механизм действия СИ реализуется, главным образом, через его способность образовывать эписульфониевый ион, являющийся сильным электрофилом, который активно реагирует с нуклеофильными сайтами, составляющих клетки (белки, липиды, РНК и ДНК). Известно, что биомаркерами экспозиции к СИ являются 4 группы соединений: продукты окисления/гидролиза [13, 14], Р-лиазные метаболиты [15, 16] и продукты алкилирования белков [17] и ДНК [18]. Именно способностью
образовывать аддукты с ДНК объясняется токсическое и канцерогенное действие СИ [19-22]. Известно [23, 24], что при воздействии СИ на ДНК образуются моно- или перекрестно-сшитые аддукты. Как следствие, блокируется репликация ДНК, что приводит к ее разрыву и аресту клеточного цикла. Такие невосстановленные поражения могут приводить к нарушению кодирования, изменению экспрессии генов, мутациям, повышающим онкологические риски. Таким образом, идентификация и количественная оценка содержания в биосредах аддуктов СИ с ДНК имеет важное значение для установления связи между образованием аддуктов и биологическими эффектами (мутациями, разрывами 2-цепочечной ДНК и т.д.), а также оценки генетических повреждений [25, 26].
Классическими биомаркерами СИ, определяемыми в качестве аналитов при установлении факта его воздействия на организм, являются: тиодигликоль (кровь, моча), В-лиазные метаболиты (моча), 1,1'-сульфонил-бис[2^-(^ацетилцистеинил)этан] (моча) [27]. Для подбора эффективной терапии при поражениях как СИ, так и другими алкилирующи-ми агентами, к которым относятся, например, противораковые препараты, важным аспектом является изучение степени и характера химических взаимодействий между алкили-рующим агентом, антидотом и внутренними системами организма. Алкилирование ДНК протекает по 3 основным положениям: N7, 06 - положения в гуанине и N3 - положение в аденине. В настоящее время в качестве биомаркеров воздействия СИ обычно используют 4 типа аддуктов: N7-(2-гидроксиэтилтиоэтил)-2'-гуанин (N7-HETEG), бис(2-этил-Ы7-гуанин) тиоэфир (Bis-G), образующийся в результате реакции по каждому положению N7 двух остатков гуанина в двухцепочечной ДНК, N3-(2-гидроксиэтилтиоэтил)-2'-аденин (ЖЗ-НЕТЕА) и 06-(2-гидроксиэтилтиоэтил)-2'-гуанин (Об - HETEG) [28]. Структурные формулы аддуктов приведены на рис. 1.
В опытах с меченым 3^-СИ было установлено [29-31], что главной мишенью для воздействия СИ на ДНК является N7 положение гуанина. Последующий гидролиз приводит к образованию структуры
147
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Рис. 1. Структурные формулы известных аддуктов СИ-ДНК: а — N7-HETEG; б — HETE-N3Ade; в - N7Gua-ETE-N7Gua, CEES; г - ETE-N7Gua; д - ETE-N3Ade.
К7-гидроксиэтилтиоэтил-20-деоксигуанозин, который, в свою очередь, вследствие депурини-зации, дает свободный ^-гидроксиэтилтиоэтил гуанин (N7-HETEG). Те же авторы сообщают о возможности образования биаддуктов между положениями N7 двух гуаниновых остатков (N7Gua-ETE-N7Gua) и другого моноаддукта, образующегося за счет алкилирования по положению N3 аденина (HETE-N3Ade). Эти данные позднее были подтверждены более современными хромато-спектральными методами [32, 33].
В работе [34] приведены данные о том, что образование аддуктов протекает в соответствии со следующим процентным соотношением: по положению N7 гуанина (61%), по положению N3 аденина (16%), по двум положениям N7 гуанина как в межнитевой, так и во внутрицепо-чечной сшивке (около 17%), по положению O6
гуанина (0,1%). В качестве биомаркера воздействия СИ чаще всего используют N7-HETEG. Авторы [35] отмечают, что гораздо более критические повреждения приносит образование O6-HETEG, однако N7-HETEG значительно преобладает в количественном отношении и наиболее часто используется в качестве биомаркера воздействия СИ.
Поскольку к иприту не разработано специфических антидотов, помощь пострадавшим обычно ограничивается стандартной терапией ожоговых поражений, симптоматической терапией при поражении органов дыхания. В последние годы активно исследуются так называемые «чистильщики» или скавенджеры, содействующие быстрому связыванию и/или выведению отравляющих веществ из организма. При этом распределение и сроки существования биомаркеров в организме меняются, что
THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION
необходимо учитывать не только при применении биоаналитических методик, но и при разработке режимов дозирования скавенджеров.
Имеются данные о весьма успешном применении антиоксидантов при терапии поражений СИ [36, 37]. В качестве скавенджеров могут применяться такие антиоксиданты, как а-линоленовая кислота) и N-ацетилцистеин (АЦЦ), показавшие защитный эффект от воздействия СИ в опытах in vitro и in vivo [38]. Установлено [39,40], что АЦЦ позволяет значительно снизить повреждения, возникающие при воздействии СИ.
Хотя введение АЦЦ позволяет снизить проявление симптомов интоксикации у пострадавших от воздействия СИ, до конца не выяснено, обусловлен ли этот эффект лишь физиологическими процессами или также и химическими взаимодействиями. Известно, что АЦЦ обладает как прямым антиоксидантным потенциалом ввиду наличия тиольной группы, так и опосредованным, поскольку является биопредшественником глутатиона. В то же время, наличие свободной тиольной группы в молекуле АЦЦ позволяет рассматривать его в качестве нуклео-фильного агента, способного химически связывать СИ. Способность АЦЦ при физиологических рН и температуре взаимодействовать с СИ с образованием аддукта (NAC-(S)-HETE была продемонстрирована авторами [39]. Менее значимый продукт взаимодействия АЦЦ и СИ образовывался только при двадцатикратном избытке АЦЦ по отношению к СИ и представлял собой две поперечно сшитые молекулы АЦЦ, присоединенные к этилтиоэтильному фрагменту (ETE) через тиольные мостики - NAC-(S)-ETE-(S)-NAC. В этой же работе были исследованы образцы плазмы крови, содержащие СИ и АЦЦ в различных концентрациях после инкубирования при температуре 37 °С. Установлено, что как СИ, так и АЦЦ образуют аддукты с альбумином. В ферментном переваре сывороточного альбумина идентифицировали алки-лированный трипептид гидроксиэтилтиоэтил-CysProPhe (HETE-CPF) и трипептид NAC-CPF с дисульфидным мостиком. Связывание СИ альбумином плазмы оказалось более значимым, чем связывание АЦЦ. В итоге авторы пришли к выводу, что химическое связывание АЦЦ и СИ
не играет существенной роли в механизме защитного действия АЦЦ при поражениях СИ.
Аналогичная методология той же группой авторов [41] была применена для исследования механизмов положительного влияния глутати-она при терапии ипритных поражений. Несмотря на то, что им удалось подтвердить методами масс-спектрометрии факт образования аддукта глутатиона с СИ, в опытах in vitro введение глу-татиона не способствовало снижению концентрации иприта в сыворотке крови после инкубирования в течение 2 ч при 37 °С. Подобный эффект авторы отмечают и в опытах с АЦЦ [39]. Таким образом, авторы упомянутых работ делают вывод о том, что имеющий место защитный эффект связан скорее с физиологическими процессами, например, со связыванием активных форм кислорода, нежели с прямым химическим взаимодействием СИ со скавенджерами. Той же точки зрения придерживаются авторы [42], изучившие действие антиоксидантов в эндоте-лиальных клетках, экспонированных хлорамбу-цилом, являющимся производным азотистого иприта.
По нашему мнению, в таких замкнутых системах, как кровь/плазма крови, инкубируемые с СИ в присутствии скавенджера, невозможно оценить влияние последнего на кинетику детоксикации СИ, и, таким образом, главная функция скавенджера - очищение организма от СИ и продуктов его биоконверсии, остается не исследованной. В этой же связи представляется неправомочным выносить суждение о кинетике и, следовательно, биологической роли реакции образования аддукта СИ с АЦЦ в тех условиях, когда продукт реакции не выводится из системы. Исследование кинетики выведения биомолекулярных аддуктов СИ при терапии скавен-джерами ранее не проводилось и представляет значительный интерес.
Цель настоящей работы - исследование влияния АЦЦ на выведение с мочой двух важнейших метаболитов СИ - аддуктов с АЦЦ и ДНК (N7-HETEG). Изменение профиля экскреции аддуктов с ДНК при действии скавенджера позволяет сделать прогноз о наличии либо отсутствии защитного действия скавенджера в отношении одного из наиболее грозных патологических эффектов СИ - повреждения ДНК.
149
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Для биомониторинга экскреции аддуктов СИ с АЦЦ и ДНК была разработана методика их совместного определения в моче методом ВЭЖХ-МС/МС высокого разрешения.
В более ранней работе [43] нами была разработана методика определения аддукта N7-HETEG в моче методом ВЭЖХ-МС/МС высокого разрешения с применением внутреннего стандарта и исследован профиль экскреции N7-HETEG с мочой крыс, получивших СИ подкожно в дозе V LD50. В настоящей работе представлены результаты эксперимента in vivo, в котором одной группе крыс вводили СИ (2 мг/кг), а второй группе крыс - СИ в той же дозе и двукратно АЦЦ (2 х 200 мг/кг). Выбор именно ACC в качестве скавенджера объясняется его доступностью, низкой токсичностью, а также наличием литературных данных о том, что применение ACC способствует смягчению симптомов воздействия СИ [39, 40], а также ряда медицинских препаратов на основе азотистого иприта, применяющихся в химиотерапии онкобольных и обладающих схожим действием [44-46]. Для оценки содержания N7-HETEG и аддукта СИ-АСС в моче была разработана методика их совместного определения, включающая концентрирование и очистку методом твердофазной экстракции, перерастворение и последующее определение методом ВЭЖХ-МС/ МС высокого разрешения.
В рамках настоящего исследования было оценено влияние терапии АЦЦ на профили экскреции аддуктов СИ с гуанином и АЦЦ с мочой крыс.
Экспериментальная часть
Реактивы и материалы: сернистый иприт (ГСО 8248-2003), ацетонитрил (ТУ 6-09-5497-91), муравьиная кислота (ОСЧ, CAS 64-18-6), картриджи для твердофазной экстракции Supelclean ENVI-8 (500 mg) Supelco кат. № 57231, ацетилцистеин фирмы Sigma кат. № A9165-5G, коньюгат ацетилцистеина и сульфона иприта - 1,1-сульфонилбис[2^-(№ ацетилцистеинил) этан] (СИ-АЦЦ), синтезирован в лаборатории ФГБУ 27 Научного центра МО РФ, внутренний стандарт 8-(1-гидроксибутан-2-иламино)-1,3,7-триметил-1-пурин-2,6(3Н,7Н) и N7-гидроксиэтилтиоэтил гуанин (^7-HETEG),
синтезированы в лаборатории химического моделирования ФГУП «НИИ ГПЭЧ».
Условия хромато-масс-спектрометрического анализа
В качестве внутреннего стандарта использовали синтезированный кандидатом химических наук В.А. Кузнецовым 8-(1-гидроксибутан-2-иламино)-1,3,7-триметил-1-пурин-2,6(3Н,7Н), характеризующийся ионным переходом m/z 282,15607 ^ 210,09855. В работе использовали тандемный масс-спектрометр высокого разрешения LTQ Orbitrap Velos с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении и программным обеспечением для управления и обработки данных «Xcalibur». Регистрацию N7-HETEG и СИ-АЦЦ проводили по массовым числам ионов-предшественников (m/z 445,07675; m/z 256,07924) и продукт-ионов (m/z 403.06454; m/z 105,03690). Разрешение по массам 70 000. Количественную оценку производили по площадям пиков продукт-иона N7-HETEG (105.03690) и СИ-АЦЦ (403.06454).
Хроматографическое разделение проводили на колонке Agilent SB-C8 (150 мм х 4,6 мм х 1,8 мкм) в режиме градиентного элюирования. Состав подвижной фазы: элюент A - H2O + 0,1% HCOOH, элюент Б - CH3CN + 0,1% HCOOH, скорость потока - 400 мкл/мин, температура термостата колонки - 35оС. Режим элю-ирования: 0 мин - 90% А, 2 мин - 90% А, 7 мин - 10% А, 9 мин - 10% А, 9,1 мин -90% А, 12 мин - 90% А. Время удерживания N7-HETEG составило 4,0 ± 0,1 мин., аддукта СИ-АЦЦ - 4,8 ± 0,1 мин.
Подготовка проб к анализу
Оптимальная схема подготовки проб к анализу включала кондиционирование патрона ENVI-8 фирмы Supelco двукратной промывкой 1 мл ацетонитрила с последующей трехкратной промывкой 1 мл воды, загрузку 1 мл, содержащей 10 нг внутреннего стандарта мочи, элюирование аналитов двумя порциями по 1 мл 60% ацетонитрила в 5% муравьиной кислоте (в/в), перерастворение объединенного элюата в 100 мкл смеси равных объемов ацетонитри-ла и воды, центрифугирование и разбавление
THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION
нг/мл 90
Время после экспозиции, ч
Рис. 2. График выведения N7-HETEG с мочой без введения скавенджера и с лечением АЦЦ.
100 мкл воды. Для получения градуировочных характеристик была приготовлена и проанализирована серия проб мочи крыс с внесением Ю-ИЕТЕО и СИ-АЦЦ с концентрациями 1, 10, 50, 100 и 200 нг/мл и добавкой внутреннего стандарта с концентрацией 10 нг/мл. На основании полученных данных были вычислены относительные площади пика N7-HETEG и СИ-АЦЦ и построены графики зависимости относительной площади пика от концентрации. Графики линейны во всем диапазоне анализируемых концентраций. Ошибка методики определена и составляет 15%.
Условия токсикологического эксперимента
Условия работы с экспериментальными животными соответствовали «Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (GLP)» (утв. Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации 19.06.2003 № 267). Крысы были разделены на группы по 5 животных в каждой, 1-й группе вводили внутрибрюшинно СИ в дозе У LD50 (2 мг/кг), 2-й - ту же дозу СИ в сочетании с терапией АЦЦ. Раствор АЦЦ вводили двукратно за 3 и за 0,5 ч перед введением СИ в дозе 200 мг/кг. Предварительно у всех задействованных в эксперименте крыс были взяты образцы мочи (холостая проба). Мочу крыс отбирали с использо-
ванием метаболических камер через 3 ч, 1, 2, 3, 7 сут после экспозиции. Пробы анализировали согласно разработанной методике, пулирование проб для каждой точки не проводили, анализируя мочу от каждой крысы отдельно и усредняя полученный результат.
Результаты и обсуждение
На основе собранных данных были построены диаграммы, графически иллюстрирующие кинетику выведения аддуктов с мочой .
Рис. 2. иллюстрирует кинетику выведения N7-HETEG с мочой.
Как следует из рис. 2, в пробах мочи крыс, получавших терапию АЦЦ, содержание аддук-та N7-HETEG значительно ниже, что свидетельствует о защитном действии скавенджера, препятствующем повреждению ДНК.
Рис. 3 иллюстрирует кинетику выведения аддукта СИ-АЦЦ с мочой.
Из рис. 3 видно, что при использовании ска-венджера выведение аддукта происходит более активно в быстрой фазе элиминации, период его выведения у крыс, получавших лечение, значительно сокращен, по сравнению с особями, которым не вводили АСС.
Известно, что после внутрибрюшинного введения СИ лабораторным животным 60 % от полученной дозы выводится с мочой в первые 24 ч [47]. Более активная экскреция с мочой
151
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Рис. 3. Профиль экскреции аддукта СИ-АЦЦ с мочой без введения скавенджера и с лечением ЛЦЦ.
аддукта СИ с АЦЦ в первые часы после экспозиции имеет большое терапевтическое значение. Через 3 ч концентрация аддукта СИ с АЦЦ в моче крыс, получавших АЦЦ, значительно выше, чем у крыс, не получавших лечения: 3,5 и 2,0 мкг/мл, соответственно. Через сутки и далее наблюдается противоположный эффект: концентрация аддукта СИ с АЦЦ в моче крыс, получавших АЦЦ, в 4 и более раз ниже, чем в группе без лечения. Подобный эффект мы наблюдали при сравнительном исследовании профилей экскреции мочевого метаболита люизита - хлорвиниларсонистой кислоты с применением и без применения антидота - унитиола [48]. В быстрой фазе элиминации метаболита, в случае введения унитио-ла, люизита выводилось значительно больше. В медленной фазе элиминации концентрации метаболита люизита в моче всех животных выравнивались. Мы синтезировали комплекс люизита с унитиолом и получили его масс-спектрометрические характеристики, однако не смогли обнаружить этот комплекс ни в моче, ни в плазме крови, ни в эритроцитах животных, экспонированных люизитом на фоне лечения унитиолом. Таким образом, активная экскреция токсиканта, обусловленная введением антидота, способного образовывать комплексы (аддукты) с токсикантом, происходила в иной форме, чем в составе этого комплекса.
В свете таких рассуждений защитное действие АЦЦ при поражении СИ было бы неправильно связывать исключительно с выведением СИ в виде аддукта с АЦЦ. Тот факт, что на фоне применения АЦЦ аддукта СИ-АЦЦ в целом за 7 сут (период наблюдения) выделяется с мочой меньше, чем без АЦЦ, указывает на сложность механизма связывания/выведения СИ, обусловливающего защитное действие АЦЦ при поражениях СИ. То, что наиболее мажорного аддукта СИ с ДНК при лечении АЦЦ выделяется меньше, указывает на способность АЦЦ защищать ДНК от повреждений, но для раскрытия механизма этого процесса требуется исследование влияния АЦЦ на профили всех метаболитов СИ.
В целом, исследование механизмов действия скавенджеров и антидотов на молекулярном уровне имеет перспективное значение в контексте разработки схемы лечения не только в случаях применения химоружия, но также и в медицинских целях при длительной химиотерапии цитостатиками.
Заключение
Исследование влияния АЦЦ на профили экскреции аддуктов СИ с АЦЦ и гуанином подтверждает защитное действие АЦЦ при поражениях СИ и указывает на существование молекулярного механизма этого действия.
THE PROBLEM OF ENSURING SAFETY IN THE USE OF NARCOTIC ANALGESICS IN THE RUSSIAN FEDERATION
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии
конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской
поддержки.
ЛИТЕРАТУРА
(пп. 1-11, 13-42, 43-48 см. в REFERENCES)
12. Сетевой ресурс Большая Медицинская энциклопедия http://xn-90aw5c.xn-c1avg/index.php. Дата обращения 22.11.2018
43. Орлова О. И., Каракашев Г.В., Шмурак В.И., Абзи-анидзе В.В., Савельева Е.И. Определение N7-[2-[(2-гидроксиэтил)-тио]-этил]-гуанина в моче крыс как маркера воздействия сернистого иприта. Вестник СПбГУ. Физика и химия. 2017; 4(62): 313-23.
REFERENCES
1. Balali-Mood M., Hefazi M. The Pharmacology, Toxicology, and Medical Treatment of Sulphur Mustard Poisoning. Fundamental & Clinical Pharmacology. 2005; 19: 297-315.
2. Kehe K., Szinicz L. Medical Aspects of Sulphur Mustard Poisoning. Toxicology. 2005; 214: 198-209.
3. Davis K.G., Aspera G. Exposure to liquid sulfur mustard. Ann. Emerg.Medicine. 2001; 37: 653-56.
4. Newmark J., Langer J.M., Capacio B., Barr J., Mcintosh R.G. Liquid sulfur mustard exposure. Mil. Medicine. 2007; 172: 196-8.
5. Ruhl C.M., Park S.J., Danisa O., Morgan R.F., Papir-meister B., Sidell F.R. A serious skin sulfur mustard burn from an artillery shell. J. Emergency Medicine. 1994; 12: 159-66.
6. Thomsen A.B., Eriksen J., Smidt-Nielsen K. Chronic neuropathicsymptoms after exposure to mustard gas: a long-term investigation. Am. Academic Dermatology. 1998; 39: 187-90.
7. Weibrecht K., Rhyee S., Manuell M.E., Longo C., Boyer E.W., Brush E. Sulfur mustard exposure presenting to a community emergency department. Ann. Emergency Medicine. 2012; 59: 70-4.
8. Rogers J.V, McDougal J.N., Price J.A., Reid F.M., Graham J.S. Transcriptional responses associated with sulfur mustard and thermal burns in porcine skin. Cutan. Ocul. Toxicololy. 2008; 27: 135-60.
9. Price J.A., Rogers J.V., McDougal J.N., Shaw M.Q., Reid F.M., Graham J.S. Transcriptional changes in porcine skin at 7 days following sulfur mustard and thermal burn injury. Cutan. Ocul. Toxicol. 2009; 28: 129-40.
10. Everley P. A., Dillman J.F.Genomics and proteomics in chemical warfare agent research: Recent studies and future applications. 3rd Toxicology Letters. 2010; 198: 297-303.
11. Biomarkers Definitions Working Group. Biomarkers and surrogate endpoints: Preferred definitions and conceptual framework. Clinical Pharmacological Therapy. 2001; 69: 89-95.
12. Network resource Big Medical encyclopedia. http:// xn-90aw5c.xn-c1avg/index.php / дата обращения 22.11.2018.
13. Riches J., Read R.W., Black R.M. Analysis of the sulphur mustard metabolites thiodiglycol and thiodiglycol sulphoxide in urine using isotope-dilution gas chroma-tography-ion trap tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 2007; 845: 114-20.
14. Li C., Chen J., Zhong Y., Zhong Y., Xie J., Li H. Simultaneous quantification of thioglycol and thioglycol sulfoxide in rat plasma by isotope dilution-liquid chro-matography tandem mass spectrometry. Chinese Journal Analytical Chemistry. 2012; 40: 1567-72.
15. Li C., Chen J., Liu Q., Xie J., Li H. Simultaneous quantification of seven plasma metabolites of sulfur mustard by ultra-high performance liquid chromatography-tan-dem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 2013; 917-918: 100-7.
16. Barr J.R., Pierce C.L., Smith J.R., Capacio B.R., Woolfitt A.R., Solano M.I., Wooten J.V. Analysis of urinary metabolites of sulfur mustard in two individuals after accidental exposure. Journal of Analytical Toxicology. 2008; 32: 10-6.
17.Noort D., Fidder A., Benschop H.P., de Jong L.P.A., Smith J.R. Procedure for monitoring exposure to sulfur mustard based on modified Edman degradation of globin. Journal of Analytical Toxicology. 2004; 28: 311-5.
18. Noort D., Fidder A. Sample collection, preparation and analytical methods, in: M. Mesilaakso (Ed.), Chemical weapons convention chemicals analysis, John Wiley & Sons, Ltd., New York, 2005, pp. 433-451.
19. Papirmeister B., Gross C. L., Meier H. L., Petrali J. P., Johnson J. B. Molecular Basis for Mustard-Induced Vesication. Fundamental and Applied Toxicology. 1985; 5: S134-S49.
20. Lodhi I. J., Sweeney J. F., Clift R. E., Hinshaw D.B. Nuclear Dependence of Sulfur Mustard-Mediated Cell Death. Toxicological and Applied Pharmacology. 2001; 170: 69-77.
21. Lakshmana-Rao P.V., Vijayaraghavan R., Bhaskar A.S.B. Sulphur mustard induced DNA damage in mice after dermal and inhalation exposure. Toxicology. 1999; 139: 39-51.
22. Jowsey P.A., Williams F.M., Blain P.G. DNA damage, signaling and repair after exposure of cells to the sulphur mustard analogue 2-chloroethyl ethyl sulphide. Toxicology. 2009; 257: 105-12.
23. Lawley P. D., Brookes P. Interstrand cross-linking of DNA by difunctional alkylating agents. Journal Mol. Biology. 1957; 25: 143-60.
24. Fidder A., Moes G. W. H., Scheffer A. G., Vanderschans G. P., Baan R. A., Dejong L. P. A., Benschop H. P. Synthesis, Characterization, and Quantitation of the Major Adducts Formed Between Sulfur Mustard and DNA of Calf Thymus and Human Blood. Chemical Research in Toxicology. 1994; 7: 199-204.
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
25. Martinez G. R., Loureiro A. P., Marques S. A., Miyamoto S.,Yamaguchi L. F., Onuki J. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 2003; 544: 115-27.
26. Garner R. C. The role of DNA adducts in chemical carcinogenesis. Mutation Research. 1998; 402: 67-75.
27. Black R.M. An overview of biological markers of exposure to chemical warfare agents. J. Anal. Toxicol. 2008; 32: 2-9.
28. Zhang Y., Nie Z., Chen J., Guo L., Wu B. Simultaneous determination of four sulfur mustard-DNA adducts in rabbit urine after dermal exposure by isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 2014; 961: 29-35.
29. Brookes P., Lawley P. D. Reaction of Mustard Gas With Nucleic Acids in vitro and in vivo. Biochemical Journal. 1960; 77: 478-84.
30. Brookes P., Lawley P. D. Effects of Alkylating Agents on T2 And T4 Bacteriophages. Biochemical Journal. 1963; 89: 138-44.
31. Lawley P. D., Brookes P. Further Studies on Alkylation of Nucleic Acids and Their Constituent Nucleotides. Biochemical Journal. 1963; 89: 127-38.
32. Fidder A., G. Moes W. H., Scheffer A. G., Vanderschans G. P., Baan R. A., Dejong L. P. A. Synthesis, Characterization, and Quantitation of the Major Adducts Formed Between Sulfur Mustard and DNA of Calf Thymus and Human Blood. Chemical Research in Toxicology. 1994; 7: 199-204.
33. Ludlum D. B., Austinritchie P., Hagopian M., Niu T. Q., Yu D. Detection of Sulfur Mustard-Induced DNA Modifications. Chemico-Biological Interactions. 1994; 91: 39-49.
34. Kehe K., Balszuweit F., Steinritz D., Thiermann H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 2009; 263: 12-9.
35. Ludlum D. B., Kent S., Mehta J. R. Formation of O6-ethylthioethylguanine in DNA by reaction with the sulfur mustard, chloroethyl sulfide, and its apparent lack of repair by O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase. Carci-nogene. 1986; 7: 1203-6.
36. Thiermann H. et al. Limitations and challenges in treatment of acute chemical warfare agent poisoning. Chem-Bio Interactions. 2013; 206: 435-43.
37. Shohrati M., Aslani J., Eshraghi M., Alaedini F., Ghanei M. Therapeutics effect of N-acetyl cysteine on mustard gas exposed patients: evaluating clinical aspect in patients with impaired pulmonary function test. Respira-toryMedicine. 2008; 102: 443-8.
38. Jugg B., Fairhall S., Smith A., Rutter S., Mann T., Perrott R., Jenner J. N-acetyl-L-cysteine protects against inhaled sulfur mustard poisoning in the large swine. Clin. Toxicol. (Phila.) 2013; 51: 216-24.
39. Siegert M., Kranawetvogl A., Thiermann H., John H. N-Acetylcysteine as a chemical scavenger for sulfur mustard: New insights by mass spectrometry. Drug Test Anal. 2018; 10(2): 243-54.
40. Shohrati M., Karimzadeh I., Saburi A., Khalili H. The role of N-acetylcysteine in the management of acute and chronic pulmonary complications of sulfur mustard: a literature review. Inhal Toxicology. 2014; 26(9): 507-23.
41. Siegert M., Kranawetvogl A., Thiermann H., John H. Glutathione as an antidote for sulfur mustard poisoning: mass spectrometric investigations of its potency as a chemical scavenger. Toxicology Letters. 2018; 293: 31-45.
42. Steinritz D., Schmidt A., Simons T. Ibrahim M., Morguet C., Balszuweit F., Thiermann H., Kehe K. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of a-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chem-Bio Interact. 2014; 219: 143-50.
43. Orlova O.I., Karakashev G.V., Shmurak V.I., Abzianid-ze V.V., Savelieva E.I. Determination of N7-[2-[(2-hy-droxyethyl)thio]-ethyl]guanine in urine as biomarker of exposure of sulfur mustard. Vestnik SPbSU. Fizika I khi-miya. 2017; 4(62): 313-23. (in Russian)
44. Mansour H.H., Shereen M. El Kiki, Hasan H.F. Protective effect of N-acetylcysteine on cyclophosphamide-in-ducedcardiotoxicity in rats. Health Environmental Toxicology and Pharmacology. 2015; 40: 417-22.
45. Experimental and Clinical Progress in Cancer Chemotherapy. ed. Muggia F.M. New York University Medical Center, New York, USA. 1985.
46. Kurauchi K., Nishikawa T., Miyahara E., Okamoto Y., Kawano Y. Role of metabolites of cyclophosphamide in cardiotoxicity. BMC Res Notes. 2017; 10: 406-13.
47. Black RM., Brewster K, Clarke RJ, Hambrook JL, Harrison JM, Howells DJ. Biological fate of sulphur mustard, 1,1'-thiobis(2-chloroethane): isolation and identification of urinary metabolites following intraperitoneal administration to rat. Xenobiotica. 1992; 22(4): 405-18
48. Koryagina N.L., Ukolova E.S., Savel'eva E.I., Voitenko N.G., Orlova O.I., Jenkins R.O. and Goncharov N.V. High-sensitivity determination of 2-chlorovinylarsonous acid in biomedical samples for retrospective detection of exposure to lewisite upon antidotal therapy. Spectroscopy. 2011; 26: 1-10
Поступила 05.02.2019 Принята в печать 21.02.2019
