CC BY
43
УДК 543.9:663
БИОГИБРИДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ МИКРООРГАНИЗМОВ, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В КРЕМНИЙОРГАНИЧЕСКИЕ ЗОЛЬ-ГЕЛЬ МАТРИЦЫ
О.А. Каманина, П.В. Рыбочкин, М.С. Тимошина, Д.Г. Лаврова
Материалы, полученные за счёт взаимодействия химически различных компонентов, формирующих определённую пространственную структуру, являются функциональными гибридными материалами. Для улучшения жизнеспособности клеток, иммобилизованных в гибридных биоматериалах, используют органо-неорганические матрицы различного состава, полученные золь-гель методом. В работе охарактеризовали функциональные биоматериалы, полученные в ходе иммобилизации метилотроф-ных дрожжей Ogataea polymorpha ВКМ Y-2559 золь-гель методом с использованием в качестве силановых прекурсоров тетраэтоксисилан и изобутилтриэтоксисилан.
Ключевые слова: гетерогенный биокатализатор, инкапсулированные микроорганизмы, золь-гель технологии, органосиликатные материалы, ассоциации микроорганизмов.
В настоящее время популярность использования биотехнологических процессов обусловлена их экономической выгодой и экологической чистотой, так как большую часть отходов предприятия можно повторно использовать в промышленном производстве. Однако использование биологических агентов (биомолекул, клеток, микроорганизмов, тканей) в биотехнологических процессах ограничено жёсткой зависимостью биологической активности биоагентов от условий окружающей среды: pH, УФ-излучения, солей тяжёлых металлов, температуры и т. д. При отклонении условий среды от оптимальных для используемого биологического материала наблюдается снижение его биологической активности или прекращение работы.
Среди методов защиты биоагента от негативных условий выделяется метод включения живых клеток в кремниевую матрицу. Клетку окружает пористая оболочка, через которую может осуществляться эффективный обмен веществ между клеткой и окружающей средой, но при этом клетка не подвержена воздействию агрессивных факторов окружающей среды [1, 2].
В течение последних нескольких лет инкапсулирование клеток в неорганические оболочки стало предметом повышенного внимания [3, 4]. Такие биоматериалы на основе живых клеток представляют значительный интерес для экологии, медицины [5], биотехнологии, биоаналитической химии и находят применение как биокатализаторы для биосенсоров [6], расходные материалы биофильтра для очистки стоков [7], на их основе можно разрабатывать биопрепараты для деградации токсичных соединений, что благоприятно скажется на экологии в целом.
Ранее в нашем научном коллективе была установлена возможность инкапсулирования дрожжевых клеток в органосиликатные матрицы с использованием золь-гель технологий как способа получения стабильных гетерогенных биокатализаторов. Впервые было показано, что дрожжевые клетки участвуют в самоорганизованном формировании архитектуры гибридного материала, и в определённых условиях образуется структура «клетки в оболочке» [8]. Однако пока выявлены не все параметры и условия для направленного формирования таких структур. Так, важным компонентом в золь-гель синтезе биогибридов являются алкилалкоксисиланы, к которым относятся, к примеру, тетраэтоксисилан, диметилдиэтоксисилан, изобутилтриэтоксисилан. Использование алкилалкоксисиланов позволяет варьировать количество образующихся между молекулами связей. Ранее все исследования [7-10] были выполнены с использованием в качестве гидрофобной добавки к тетраэтоксисилану соединения с одной негидролизующейся связью - метилтриэтоксисилана, что способствовало образованию золь-гель матрицы с трёхмерной, объёмной структурой, более гибкой, так как связывание происходит только по трём связям, а не по четырём, как в случае с тетраэтоксисиланом. Изобутилтриэтоксисилан - вещество, в котором есть негидролизующаяся связь атома Si с разветвлённым радикалом изобутила. Можно ожидать, что при его использовании будет образовываться менее жёсткая, но прочная оболочка вокруг клеток дрожжей.
Таким образом, в работе необходимо охарактеризовать функциональные биоматериалы, полученные в ходе иммобилизации метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha ВКМ Y-2559 золь-гель методом с использованием изобутилтриэтоксисилана.
Простейший подход к иммобилизации биоматериала посредством золь-гель метода - это захват клетки в формирующуюся силикатную матрицу. Для создания кремнийорганической золь-гель структуры дополнительно вносят органические полимеры, которые выполняют роль структурообразующих агентов (СА). Ранее в нашем научном коллективе был разработан гетерогенный биокатализатор на основе силановых прекурсоров тетраэтоксисилана (ТЭОС) и метилтриэтоксисилана (МТЭС), при участии СА полиэтиленгликоля (ПЭГ) [8-10]. В этих условиях конечная структура напоминала рыхлую суспензию, что усложняло использование её в качестве эффективного биокатализатора. Поэтому в данной работе в качестве СА был выбран поливиниловый спирт (ПВС), он способен образовывать плёнки, что позволит значительно упростить работу при использовании их в качестве гетерогенного биоматериала для биотехнологии. В качестве гидрофобной добавки использовали изобутилтриэтоксисилан. В работе было получено 11 образцов с различным соотношением силановых прекурсоров (рис. 1).
Рис. 1. Соотношения силановых прекурсоров, используемых в работе
Особенности морфологии и структуры золь-гель матрицы, выявленные при помощи СЭМ
Для получения представления о морфологии матриц при использовании в синтезе функциональных материалов иБТЭС изучали изображения биоматериала методом сканирующей электронной микроскопии. Были получены изображения золь-гель матрицы с содержанием гидрофобной добавки изобутилтриэтоксисилана (иБТЭС) 20% и 80 % от общего количества силановых прекурсоров с использованием клеток и без них. Полученные изображения приведены на рис. 2.
На изображениях, полученных для золь-гель матрицы с содержанием иБТЭС об. 20 % (рис. 2а), клетки включены в толщу силикагеля, дрожжи захватываются внутрь матрицы, что должно способствовать удержанию клеток внутри слоя матрицы. В случае образцов с содержанием иБТЭС 80 об. % (рис. 2б) видно, что клетки располагаются внутри пор, размер которых превышает размер дрожжевой клетки. Это может привести к тому, что клетки будут свободно вымываться из материала, что в свою очередь спровоцирует падение каталитической активности функционального материала, полученного на основе такой золь-гель матрицы.
Морфология матриц без клеток (рис. 2в, г) не зависит от содержания гидрофобной добавки и имеет единую морфологию. Можно видеть, что в матрице присутствуют образования, размер которых меньше среднего размера дрожжевых клеток. Можно предположить, что это частицы золя, который не связался с основной массой геля.
х7,000 2|ш
Рис. 2. Изображение СЭМ: а - иБТЭС 20 %; б - 20 % иБТЭС без клеток; в - иБТЭС 80 %; г - 80 % иБТЭС без клеток
Аналитические и метрологические характеристики биорецепторных элементов, полученных в ходе работы
Для характеристики «живых» функциональных биоматериалов использовали биосенсорный подход. Для этого на поверхности кислородного электрода закрепили иммобилизованные клетки дрожжей. Принцип функционирования биосенсора основан на том, что в присутствии субстратов увеличивается дыхательная активность микроорганизмов, это приводит к уменьшению содержания кислорода в приэлектродном пространстве. Это изменение фиксирует кислородный электрод. За ответ биосенсора принимали скорость изменения содержания кислорода при добавлении определяемого вещества (мг (02)-л-1-мин-1). Согласно рекомендациям подразделения Международного союза
теоретической и прикладной химии (ШРАС) по физической и аналитической химии [11] важными характеристиками биосенсоров являются характеристики: чувствительность, рабочий или линейный интервал концентраций, предел обнаружения и нижняя граница определяемых концентраций. Время функционирования биосенсора без замены биораспознающего элемента (долговременная стабильность) позволило судить о стабильности биокатализатора на основе инкапсулированных в кремнийорганическую матрицу микроорганизмов. Полученные в ходе работы характеристики приведены в табл. 1.
Таблица 1
Характеристики полученных биорецепторных элементов
Содержание гидрофобной добавки иБТЭС Характеристики биорецепто рных элементов
Предел обнаружения, мкмоль/дм3 Диапазон определяемых содержаний, мкмоль/дм3 Коэффициент чувствительности, мг (02)/(ммольмин) Операционная стабильность, % (п=10; Р=0,95) Долговременная стабильность, сутки
0 % 3 9 - 600 0,42±0,01 1 9
10 % 51 10 - 7000 0,39±0,03 1 12
20 % 1 5 - 1200 3,8±0,3 1 20
30 % 23 17 - 190 0,63±0,03 4 30
50 % 26 15 - 190 0,57±0,02 4 27
75 % 24 12 - 1700 0,68±0,03 3 14
80 % 34 10 - 160 0,75±0,03 3 21
85 % 30 11 - 250 0,68±0,04 4 43
90 % 14 13 - 300 0,71±0,03 5 15
95 % 15 13 - 200 0,64±0,04 3 31
100 % 40 20 - 330 0,68±0,03 5 7
Проанализировав полученные данные, можно прийти к заключению, что наибольшей каталитической активностью характеризуется биоматериал с содержанием иБТЭС 20 %, так как биосенсор на основе данного образца характеризуется более низким показателем нижней границы определяемых содержаний и пределом обнаружения и максимальный значением коэффициента чувствительности. Возможно, это связано с тем, что золь-гель матрица с содержанием
гидрофобной добавки иБТЭС 20 об. % в меньшей степени препятствует диффузии субстрата. А при увеличении содержания гидрофобной добавки иБТЭС происходит образование более рыхлой матрицы с порами большого диаметра, из которых легко вымываются дрожжевые клетки (рис. 2).
Наиболее стабильными в работе являются биосенсоры на основе функционального материала с содержанием гидрофобной добавки иБТЭС 0, 10 и 20 об. %, так как показатель операционной стабильности самый минимальный. Это, скорее всего, связано с эффективным транспортом веществ в системе окружающая среда - биоматериал.
Характеристики биосенсора, полученного на основе метилотрофных дрожжей 0%. polymorpha инкапсулированных в кремнийорганический золь-гель, полученный с использованием изобутилтриэтоксисилана и тетраэтоксисилана, сравнивали с ранее изученным биорецепторным элементом с гидрофобной добавкой метилтриэтоксисилан. Характеристики для сравнения приведены в табл. 2.
Таблица 2
Сравнение характеристик
Состав золь-гель матрицы Характеристики биорецепторных элементов
Предел обнаружения, мкмоль/дм3 Диапазон определяемых содержаний, мкмоль/дм3 Коэффициент чувствительности Операционная стабильность, % Долговременная стабильность, сутки
20 % иБТЭС 80 % ТЭОС 1 5 - 1200 3,8±0,3 мг (02)/(ммоль ■ мин) 1 20
85 % МТЭС 15 % ТЭОС [10] 1 1,5 198±5 нА ■ дм3/(ммоль ■ мин) 1 10
Из используемых в работе соотношений наиболее эффективным для иммобилизации метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha ВКМ Y-2559 является кремнийорганический золь-гель с содержанием гидрофобной добавки изобутилтриэтоксисилан 20 %. При сравнении данного образца с полученным ранее золь-гель матрицей с содержанием гидрофобной добавки метилтриэтоксисилана 85 об. % можно увидеть, что образец с иБТЭС менее эффективен, чем образец с МТЭС. Возможно, это связано с тем, что разветвлённый алкил вносит в систему дополнительные стерические затруднения при инкапсулировании клеток, однако это требует дополнительных исследований структуры получаемого биогибридного биоматериала.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ «Стабильность» №20-33-70078 и гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых учёных - кандидатов наук (договор № МК-1349.2020.3).
Список литературы
1. Recent bio-applications of sol-gel materials / D. Avnir, T. Coradin, O. Lev [et. al] // Journal of Materials Chemistry. 2006. Vol. 16. № 11. P. 1013 -1030.
2. Synthesis of transparent aminosilane-derived silica based networks for entrapment of sensitive materials / C. Müller, K. Kraushaar, A. Doebbe [et al] // Chemical Communications. 2013. Vol. 49. № 86. P. 10163.
3. Dickson D.J., Ely R.L. Silica sol-gel encapsulation of cyanobacteria: Lessons for academic and applied research // Applied Microbiology and Biotechnology. 2013. Vol. 97. № 5. P. 1809 - 1819.
4. Meunier C.F., Dandoy P., Su B.L. Encapsulation of cells within silica matrixes: Towards a new advance in the conception of living hybrid materials // Journal of Colloid and Interface Science. Elsevier Inc., 2010. Vol. 342. № 2. P. 211 - 224.
5. Albert K., Huang X.C., Hsu H.Y. Bio-templated silica composites for next-generation biomedical applications // Advances in Colloid and Interface Science. Elsevier, 2017. Vol. 249. № 1001. P. 272 - 289.
6. Gupta R., Chaudhury N.K. Entrapment of biomolecules in sol-gel matrix for applications in biosensors: Problems and future prospects // Biosensors and Bioelectronics. 2007. Vol. 22. № 11. P. 2387 - 2399.
7. Silica sol-gel encapsulated methylotrophic yeast as filling of biofilters for the removal of methanol from industrial wastewater / O. A. Kamanina, D. G. Lavrova, V. A. Arlyapov [et al] // Enzyme and Microbial Technology. Elsevier Inc., 2016. Vol. 92. P. 94 - 98.
8. Synthesis of organosilicon sol-gel matrices and preparation of heterogeneous biocatalysts based on them / O. A. Kamanina, D. G. Fedoseeva, T. V. Rogova [et al] // Russian Journal of Applied Chemistry. 2014. Vol. 87. № 6. P. 761 - 766.
9. Effect of polyethylene glycol additives on structure, stability, and biocatalytic activity of ormosil sol-gel encapsulated yeast cells / D. G. Lavrova, O. A. Kamanina, A. V. Machulin [et al] // Journal of Sol-Gel Science and Technology. 2017. P. 1 - 5.
10. Yeast-based self-organized hybrid bio-silica sol-gels for the design of biosensors / O. N. Ponamoreva, O. A. Kamanina, V. A. Alferov [et al] // Biosensors and Bioelectronics. Elsevier, 2015. Vol. 67. P. 321 - 326.
11. Electrochemical biosensors: Recommended definitions and classification / D. R. Thevenot, K. Toth, R. A. Durst [et al] // Biosensors and Bioelectronics. 2001. Vol. 16. № 1-2. P. 121 - 131.
Каманина Ольга Александровна, канд. хим. наук, доц., o.a.kamaninaaigmail.ru, РФ, Тула, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Тульский государственный университет,
Рыбочкин Павел Владимирович, магистрант, rybochkin.pavel. vlaimail. ru, РФ, Тула, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Тульский государственный университет,
Тимошина Мария Сергеевна, студент, mariya4jc@gmail. com, РФ, Тула, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Тульский государственный университет,
Лаврова Дарья Геннадьевна, аспирант, d.gfedoseevaaigmail.com, РФ, Тула, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Тульский государственный университет
MATERIALS BASED ON MICROORGANISMS IMMOBILIZED IN SILICON ORGANIC SOL-GEL MATRIX
O. A. Kamanina, P. V. Rybochkin, M. S. Timoshina, D. G. Lavrova
Materials obtained due to the interaction of chemically different components that form a certain spatial structure are functional hybrid materials. To improve the viability of cells immobilized in hybrid biomaterials, organo-inorganic matrices of various compositions obtained by the sol-gel method are used. Functional biomaterials obtained during the immobilization of methylotrophic yeast Ogataea polymorpha VKM Y-2559 by the sol-gel method using tetraethoxysilane and isobutyltriethoxysilane as silane precursors were characterized in the work.
Key words: heterogeneous biocatalyst, encapsulated microorganisms, sol-gel technology, organosilicate materials, associations of microorganisms
Kamanina Olga Aleksandrovna, candidate of chemical science, docent, o. a. kamaninaaigmail. ru, Russian Federation, Tula, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Tula State University,
Rybochkin Pavel Vladimirovich, student, rybochkin.pavel. vl'amail. ru, Russian Federation, Tula, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Tula State University,
Timoshina Mariia Sergeyevna, student, mari\>a4ic'agmaiL com, Russian Federation, Tula, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Tula State University,
Lavrova Darya Gennadyevna, graduate student, d. g. fedosee vaagmaiL com, Russian Federation, Tula, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Tula State University
