CC BY
25УДК 619:619.98:579.841.93 DOI 10.33632/1998-698Х.2020-2-4-9
АССОЦИИРОВАННЫЙ АНТИГЕН ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА И ТУБЕРКУЛЕЗА
Баратов М.О. - доктор ветеринарных наук
Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт - филиал ФГБНУ «Федеральный аграрный научный центр Республики Дагестан» (367000, РД, г. Махачкала, ул. Дахадаева 88, e-mail: alama500@rambler.ru)
Проведены исследования по оценке результативности использования комбинации туберкулезного и бруцеллезного антигенов. Определено соотношение белковых и полисахаридных фракций при создании туберкулезного аллергена. Отражены этапы создания единого аллергена в разных соотношениях 1:0,25, 1:0,5, 1:0,75 и 1:1. Установлены оптимальные режимы постановки реакции и соотношение комбинации. Определена чувствительность в РСК с сыворотками крови 5 групп животных: иммунизированных вакцинами из штаммов 19 и 82; больных бруцеллезом; с гипериммунными сыворотками иммунизированных М. bovis кроликов; больных туберкулезом, а также здоровых. Установлено, что комбинация аллергенов микобактерий и бруцелл приводит к значительному повышению эффективности при выявлении комплементсвязывающих антител у больных бруцеллезом, а также иммунизированных вакцинами из шт. 19 и 82 животных. Показано, что смешанный антиген выявляет на 15-20% больше комплементсвязывающих антител, нежели бруцеллезный антиген. Наряду с этим, отмечено повышение чувствительности ассоциированного антигена при выявлении специфических антител у больных туберкулезом, а также у животных со смешанной инфекцией, о чем свидетельствуют результаты исследования 105 проб сывороток крови животных в хозяйстве, где двойная инфекция подтверждена результатами аллергических, патологоанатомических и лабораторных исследований. Исследования показали возможность использования ассоциированного антигена для одновременного выявления комплементсвязывающих бруцеллезных и туберкулезных антител в сыворотке крови. Полученные данные открывают перспективу использования антигенной комбинации в изучении вопросов диагностики смешанных инфекций у животных, что перспективно для повышения экономической эффективности и сокращения времени выявления эпизоотических и экономически значимых болезней.
Ключевые слова: туберкулез, бруцеллез, ассоциированный антиген, РСК, комплементсвязывающие антитела, микобактериальный, диагностика.
Длительное хроническое течение бруцеллеза бессимптомным бактерионосительством нередко с незначительным количеством специфических антител в сыворотке крови, создает большие трудности в диагностике. Установлено важность серологических методов исследования в обеспечении своевременного и полного выявления зараженных бруцеллезом животных [1,5,6,7,8,9].
Наряду с этим отмечено, что в лабораторной ветеринарной практике для диагностики туберкулеза практически не используется кровь. Связано это с низкой результативностью серологических методов исследования при данной патологии, в связи с отсутствием достаточно специфических антигенов, иммунной ареактивностью животных и как следствие низким уровнем циркулирующих антител
[3,4]. Не смотря на возможность тесного длительного ассоциативного существования возбудителей этих хронических эпизоотически значимых болезней, в литературе имеются разрозненные данные о возможности использования единого иммунологического теста для выявления бруцеллеза и туберкулеза, что существенно затрудняет и сдерживает работы по оздоровлению хозяйств. Комбинированный тест позволил бы почти в 2 раза сократить работу ветеринарных специалистов, серологов, и настолько же экономить материальные расходы [2,10].
Цель исследования - изучение состава антигенной ассоциации микобактерии и бруцелл для использования в РСК в целях одновременного исследования сыворотки крови на обе болезни.
Материал и методы. Для создания туберкулезного антигена использовали в определенных соотношениях, полисахаридную фракцию бычьего типа микобактерии, метано-ловый экстракт (Негр и Боке), сырой экстракт по Тогуновой и тканевой водный экстракт легкого КРС. Для оценки практической значимости комбинацию туберкулезного аллергена с единым бруцеллезным антигеном для РСК готовили в разных соотношениях, 1:0,25, 1:0,5, 1:0,75, 1:1. Оптимальные режимы постановки реакции и соотношения компонентов отработали с позитивными и негативными бруцел-
лезными и туберкулезными сыворотками. Многократными исследованиями установили время, экспозиции баксистемы - 45 минут, инкубации при 37 - 380 С - 30 минут и выдержки на водяной бане после добавления гемсистемы - 20 минут, а также титр гемолизина -удвоенный, взвесь эритроцитов в гемсистеме - 2%, объем компонентов (антигенов) - 0,2 мл. Оценивали результаты после 17-18 часовой выдержки.
Результаты исследований. При определении чувствительности установили оптимальное соотношение 1:0,5 (табл. 1).
Таблица 1 -Комбинированный антиген в разных соотношениях
Кровь от больных Количество Ассоциированный антиген Выявлены
(единый бруцеллезный АГ+ комплиментсвязывающие
микобактериальный АГ) антитела в
использование в РСК при диагностическом титре
соотношениях
Бруцеллезом 53 1:0,25 38
1:0,5 42
1:0,75 42
1:1 42
Туберкулезом 21 1:0,25 12
1:0,5 19
1:0,75 19
1:1 19
Чувствительность РСК проверяли с сыворотками крови следующих групп животных: иммунизированных в разное время вакцинами из штамма 19 и 82; естественно больных бруцеллезом животных; c гипериммунными сыворотками кроликов, иммунизированных М. bovis по методу Фрейнда; естественно больных туберкулезом животных неблагопо-
лучного стада; здоровых по туберкулезу и бруцеллезу животных. Предварительные опыты были поставлены с позитивными бруцеллезными и туберкулезными сыворотками в разведениях соответственно 1:5 и 1:10. В качестве контроля использовали негативную сыворотку и ставили РСК с каждым антигеном в отдельности по следующей схеме (табл. 2)
Таблица 2 - Схема постановки РСК и результаты контрольного опыта с тремя антигенами
Антигены Сыворотка
позитивная бруцеллезная (титр 1:5) позитивная туберкулезная (титр 1:10) негативная (титр 1:10)
Бруцеллезный АГ задержка гемолиза гемолиз гемолиз
Туберкулезный АГ гемолиз задержка гемолиза гемолиз
Ассоциированный АГ задержка гемолиза задержка гемолиза гемолиз
Эти опыты показали возможность использования ассоциированного антигена в целях, одновременного обнаружения компле-ментсвязывающих бруцеллезных и туберкулезных антител в сыворотке крови при полном отсутствии перекрестных реакций. При определении чувствительности ассоциированного антигена установлено, что в реакции
связывания комплимента (РСК) с ассоциированным антигеном обнаруживаются комплементсвязывающие бруцеллезные антитела в разведениях сыворотки почти 2 раза превышающих таковых с единым бруцеллезом антигеном, при полном совпадении результатов с показателями реакций с микобактериаль-ным антигеном.
Таблица 3 - Результаты исследования проб сывороток крови естественного больных и иммунизированных против бруцеллеза животных в РСК с
тремя антигенами
Группы животных Всего Количество Число позитивных показаний (в титрах АГ) в РСК с:
единым бруцеллезным АГ Всего % туберкулезным АГ Всего % ассоциированным АГ <и о В о
1/10 1/20 1/40 1/80 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/10 1/20 1/40 с ос
Естественно больные бруцеллезом 40 32 30 22 14 7 32 80 - - - - - - - 38 35 30 20 7 8 5
Иммунизированные штаммом 19 и 82 36 20 13 5 2 - 20 55,6 - - - - - - - 27 21 17 9 7 5
Неблагополучные по туберкулезу 753 - - - - - - - 49 24 18 9 3 49 6,5 49 24 18 9 9 0
Гипериммунные туберкулезные сыворотки 24 24 22 19 12 9 24 100 24 22 19 12 4 00
Здоровые 120 - - - - - 52 - - - - -
Всего 75 38
Примечание: в главном опыте были поставлены следующие контроли:
1. Позитивная бруц. сыворотка с единым бруцеллезным АГ - задержка гемолиза
2. Позитивная бруц. сыворотка ассоциированным АГ - задержка гемолиза
3. Позитивная бруц. сыворотка с туберкулезным АГ - полный гемолиз
4. Позитивная бруц. сыворотка с туберкулезным АГ - полный гемолиз
5. Позитивная туб. сыворотка с ассоциированным АГ - задержка гемолиза
6. Позитивная туб. сыворотка с бруцеллезным АГ - полный гемолиз
ЖУРНАЛ ДЛЯ ПРОФЕССИОНАЛОВ ОТ ПРОФЕССИОНАЛОВ
Многократными исследованиями выявлено закономерность полученных результатов. Как свидетельствуют данные таблицы 3, смешанный антиген выявлял на 15-20% больше комплементсвязывающих антител, нежели бруцеллезный антиген. Повышение чувствительности единого бруцеллеза анигена туберкулезным наблюдалось при всех исследованиях проб сывороток крови от животных неблагополучных по бруцеллезу и иммунизированных вакцинами из шт.19 и 82 стад, при полном отсутствии перекрестных реакций с чистым микобактериальным антигеном. Опыты так же показали, что при постановке РСК с сыворотками крови естественно больных туберкулезом и иммунизированных мико-бактериями животных, комплементсвязываю-щие антитела с ассоциированным антигеном обнаруживаются в значительной степени, чем при использовании микобактериального моноантигена точности совпало при расшифровке проб.
В целях определения эффективности использования ассоциированного антигена в производственных условиях провели серию опытов. Для этого 18 позитивных проб сывороток крови, полученных от животных неблагополучного по бруцеллезу, 17 позитивных проб сывороток от животных неблагополучных по туберкулезу и 120 проб сывороток от здоровых животных благополучных стад были объединены в одну серию. Целью явилось однократной постановкой РСК выявить позитивные пробы, а в последующем их дифференцировать.
Главный опыт ставили с разведенными до 1:80 сыворотками. При этом обнаружены 35 позитивные сыворотки. Их отделили и повторили РСК в одном разведении с использова-
нием туберкулезного антигена. В этом случае выявили 17 позитивных сывороток. Разница чисел между первой и повторной постановки реакции (35-17=18) составляли позитивные бруцеллезные сыворотки, полученные от животных неблагополучного по бруцеллезу хозяйства, что в Выбор туберкулезного антигена для повторной постановки РСК определялся тем, что во всех предыдущих исследованиях его показания полностью совпадали с показаниями ассоциированного антигена и позитивных туберкулезных сывороток, т.е. число постоянное. В случае использования в этих целях бруцеллезного антигена для РА и РСК, часть сывороток, содержащих комплементсвязыва-ющие антитела обнаруживаемых смешанным антигеном оставались недовыявленными, и ошибочно причислялись к позитивным туберкулезным.
Представлял определенный интерес исследование сывороток крови от животных неблагополучных по обеим инфекциям. Для постановки опыта выбрали стадо коров в СПК «Львовский» Бабаюртовская зона отгонного животноводства Республики Дагестан, где систематически выделялись больные бруцеллезом и туберкулезом животные. Комиссионные аллергические исследования 317 голов выявили 56 голов, реагирующих на туберкулин (17,6%). Последующими патологоанатоми-ческими и лабораторными исследованиями туберкулез подтвержден. В РСК исследовали 105 проб сывороток крови. Реакцию ставили параллельно с тремя антигенами и соответствующими контролями. Результаты исследования (табл. 4) подтвердили наши предположения о возможности одновременной серологической диагностики обеих инфекций в РСК с ассоциированным антигеном.
Таблица 4 - Результаты РСК с сыворотками крови животных неблагополучного по бруцеллезу
и туберкулезу стад
Порядок Коли- Позитивные показания с АГ Результат
постановки во ассоциированным Единый бруцелл. туберкулезным
РСК проб число % число % число %
Все пробы сывороток 105 52 49,5 9 17,3 38 73,0 38 позит. туберкул.
позитивные с 52 РСК РСК 38 14 позит.
ассоциирова нным не ставится не ставится бруцелл.
антигеном
Как показывают данные таблицы 4, казаний реакции с ассоциированным антиге-
РСК с единым бруцеллезным антигеном ном и туберкулезным (52-38=14) показывает
можно было и не ставить, так как разница по- число позитивных бруцеллезных сывороток. В
ЖУРНАЛ ДЛЯ ПРОФЕССИОНАЛОВ ОТ ПРОФЕССИОНАЛОВ
данном случае, в РСК с ассоциированным антигеном обнаружили дополнительно 5 (10,6%) позитивные бруцеллезные сыворотки.
Заключение. Таким образом, лабораторные опыты и производственные испытания показали эффективность использования ассоциированного антигена в серологической диагностике бруцеллеза и туберкулеза. При этом решаются две важные задачи: повышается чувствительность существующего единого
бруцеллезного антигена для РА и РСК, что, несомненно, способствует наиболее полному выявлению в стадах больных бруцеллезом животных и сокращению сроков оздоровления неблагополучных хозяйств; позволяет одновременно ставить РСК и на туберкулез, сокращая при этом объемы работ, материальные расходы и рабочее время.
Литература
1. Абдулин, Х.Х. Серологическая диагностика бруцеллеза и пути повышения ее эффективности / Х.Х. Абдулин // Научные труды КазНИВИ. - 1980.-Т. 135.-С.16-20.
2. Баскаков, Н.И. Профилактика туберкулеза и бруцеллеза животных в Калужской области / Н.И. Баскаков, А.Н. Деринов, В.А. Бархударян // Ветеринария. - 2006. - №4. - С.3-8.
3. Воробьева, З.Г. Экспресс-диагностика туберкулеза крупного рогатого скота / З.Г. Воробьева, А.Л. Лазовская, К.Н. Слинина // Ветеринарная патология. - 2004. - №1-2(9). - С. 126-127.
4. Донченко, A.C. Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота / A.C. Донченко, Н.П. Овдиенко, H.A. Донченко // Новосибирск. - 2004. - С.309.
5. Димова, A.C. Оценка технологичности различных противобруцеллезных вакцин и схем их применения на крупном и мелком рогатом скоте: Автореф. дисс. канд. вет. наук: 16.00.03 / A.C. Димова; ИЭВСиДВ, Новосибирск. - 2003. -22 с..
6. Косилов, И.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных/ И.А. Косилов, П.К. Аракелян, С.К. Димов, А.Г. Хлыстунов // Новосибирск. -1999. - С. 342.
7. Косилов, И.А. Противоэпизоотическая и противоэпидемическая эффективность специфической профилактики бруцеллеза овец / И.А. Косилов, П.К. Аракелян // Науч. обеспечение вет. пробл. в животноводстве. Новосибирск, - 2000. -С. 120-130.
8. Красиков, А.П. Методы диагностики и профилактики бруцеллеза и туберкулеза животных / А.П. Красиков, С.А. Панкратов // Омск. - 1988. - С. 17-26.
9. Нуратинов, Р.А. Патент 2111009 Способ серологической диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота. 20.05 98.
10. Федченко, В.А. Рекомендации по профилактике и оздоровлению от туберкулеза и бруцеллеза крупного рогатого скота Торгайской области / В.А. Федченко, В. И. Белобаб, С.А.Кенжетаев // Аркалык. - 1982. 78 с.
ASSOCIATED ANTIGEN FOR THE DIAGNOSIS OF BRUCELLOSIS AND TUBERCULOSIS
Baratov M.O. - Doctor of Veterinary Sciences
Caspian Zonal Scientific Research Veterinary Institute - Branch of the Federal State Budgetary Scientific Institution "Federal Agrarian Scientific Center of Dagestan Republic" (Republic of Dagestan, 367000 Makhachkala, Dakhadaev st., 88, e-mail: alama500@rambler.ru)
Studies have been conducted to evaluate the effectiveness of using a combination of tuberculosis and brucellosis antigens. The ratio of protein and polysaccharide fractions when creating a tuberculosis allergen was determined. The stages of creating a single allergen are reflected in different ratios 1: 0.25, 1: 0.5, 1: 0.75 and 1: 1. The optimal reaction mode and combination ratio were established. The sensitivity was determined in CSCs with blood serums of 5 groups of animals: immunized with vaccines from strains 19 and 82; patients with brucellosis; with hyperimmune sera of immunized M. bovis rabbits; tuberculosis patients, as well as healthy. It was found that the combination of mycobacteria and brucella allergens leads to a significant increase of efficiency in detecting complement-binding antibodies in patients with brucellosis, as well as immunized with vaccines from pc. 19 and 82 animals. It was shown that a mixed antigen reveals on 15-20% more complement-binding antibodies than a brucellosis antigen. Along with this, an increase of the
