CC BY
5UIF-2022: 8.2 SCIENCE AND INNOVATION 2022
ISSN: 2181-3337 INTERNATIONAL SCIENTIFIC JOURNAL №4
АРПАНИНГ САРИК ПАКАНАЛИК ВИРУСИ ШТАММЛАРИ ИДЕНТИФИКАЦИЯСИ ВА МОЛЕКУЛЯР ДИАГНОСТИКАСИ
Махмудов Т.Х
Генетика ва усимликлар экспериментал биологияси институти УзРФА
Адилов Б.Ш.
Генетика ва усимликлар экспериментал биологияси институти УзРФА
Кодирова З.Н.
Генетика ва усимликлар экспериментал биологияси институти УзРФА
https://doi. org/10.5281/zenodo.6960800
Аннотация. Ушбу тадцщот иши Тошкент вилояти Генетика ва усимликлар экспериментал биологияси институти тажриба майдонида экилган бугдойнинг бир нечта навларида арпанинг сариц паканалик вируси штаммларининг тарцалиши ва уларни полимераза занжир реакцияси усулида аницлашдан иборат
Калит сузлар: арпанинг сариц паканалик вируси, полимераза занжир реакцияси, штамм
ИДЕНТИФИКAЦИЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА ШТАММОВ ВИРУСА
ЖЁЛТОЙ КАРЛИКОВОСТИ ЯМЕНИЯ
Аннотация. В данной научно-исследовательской работе приведены сведения о распространенности штаммов вируса желтой карликовости ячменя на нескольких сортах пшеницы, посеянной на экспериментальном участке института Генетики и ээкспериментальной биологии растений Ташкентской области, их идентификация методом полимеразной цепной реакции.
Ключевые слова: вирус жёлтой карликовости ячменя, полимеразная цепная реакция, штамм
IDENTIFICATION AND MOLECULAR DIAGNOSTICS OF BARLEY
YELLOW DWARF VIRUS
Abstract. This research work provides information on the prevalence of the strains of barley yellow dwarf virus on several wheat varieties planted on the experimental field of the Institute of Genetics and Experimental Plant Biology in the Tashkent region, their identification by the polymerase chain reaction method.
Keywords: barley yellow dwarf virus, strain, polymerase chain reaction
КИРИШ
Ер юзида галла усимлигини касаллантирувчи вируслар сони 100 дан ошган булиб, Европа мамлакатларида уларнинг 40 га як;ини идентификация килинган. Шулардан Узбекистонда Арпанинг сари; паканалик лютеовируси, бугдойнинг йул-йул мозаика потивируси ва арпанинг сари; йул-йул мозаика рабдовируслари аникланган [Горбунова 1966], [Кадирова 2002].
Узбекистон Республикаси вилоятлар кесимида галла усимлигида учрайдиган вирусларининг таркалиш даражаси урганилган. [Кодирова.3.Н.,Махмудов.Т.Х, 2020]. Галла усимлигида учрайдиган Арпанинг сариц паканалик вируси (АСПВ). лютеовируслар гурудига кириб, деярли барча галла етиштирувчи мамлакатларда таркалган. АСПВ сферик шаклга эга булиб, диаметри 25 нм га тенг. АСПВ нинг тозаланган препаратидаги седиментация коэффиценти 115-118 S , вириони 28% нуклеин кислота ва 72% оксил,
UIF-2022: 8.2 SCIENCE AND INNOVATION 2022
ISSN: 2181-3337 INTERNATIONAL SCIENTIFIC JOURNAL №4
геноми бир хдлкали РНК дан иборат. Исссиклик тасирида инактивация нуктаси 60°-75°С ни ташкил этади. Вирионлар усимликлар флоэмасида тупланади.Унинг асосан 5 та штамми аникланган булиб,улар PAV, MAV,SGH, RMVва КРУлардир., АСПВ-PÄVштамми деярли барча худудларда таркалганлиги аникланган [Z.Kadirova, H.Makkouk,2004, Т.Махмудов 2021]. Узбекистан худудида АСПВнинг штаммлари нитроцеллюлоза мембранасида иммуноблотинг усулида аникланган булиб, х,озирги кунда полимераза занжир реакцияси(ПЗР) усулида фитопатоген вирусларни диагностика килиш замонавий аник ташх,ис куйиш усулларидан бири х,исобланади. Бугунги кунда Узбекистонда бир катор вируслар, жумладан картошканинг Х вируси, олхури чечаги вируси, беда мозаика вируси каби вирусларни ПЗР усули ёрдамида молекуляр диагностика, вирус штаммларининг молекуляр идентифкацияси амалга оширилган хдмда вируснинг усимлик айрим физиологик хусусиятларига таъсири урганилган [Fayziyev, 2020, Husanov, 2020].
Ушбу илмий тадкикот ишининг максади, Тошкент вилояти иклим шароитида таркалган арпанинг сарик паканалик вируси штаммларининг идентификацияси ва молекуляр диагностикасини полимераза занжир реакцияси усулида амалга ошириш
х,исобланади.
ТАДЦЩОТ МАТЕРИАЛЛАРИ ВА МЕТОДОЛОГИЯСИ
Тадкикот обьекти сифатида Генетика ва усимликлар экспериментал биологияси инстутининг тажриба далаларида устирилаётган бугдой нав ва тизмаларида илмий тадкикот ишлари олиб борилди.
Бугдойнинг махдллий ва хорижий навлари галла ширалари ёрдамида АСПВ билан касаллантирилди ва изоляторларда устирилди. АСПВ билан касаланган бугдой усимликларидан касаллик аломатларига караб намуналар йигилди. Усимлик намуналари табиий холатини саклаб туриш учун -20°С хароратда музлатгичда сакланди.
Усимлик намуналаридан АСПВ РНК "Invitrogen™ PureLink™ RNA Mini Kit Thermo Fisher USA" реактивлар туплами ёрдамида ажратиб олинди. Тескари транскрипция реакцияси учун "OT-1" реактивлар туплами(Синтол, Россия), ПЗР утказиш учун "PLATINUM HS PCR 2X MM 200 RXNS PCR" реактивлар туплами, хамда АСПВ ва унинг штаммлари учун (Синтол, Россия) праймерлардан фойдаланилди.
Тадкикотларда касалланган бугдой усимлигидан АСПВ РНК ажратиш, Тескари транскрипция ва ПЗР жараёнлари реактивлар тупламлари ишлаб чикарувчининг тавсияси асосида олиб борилди.
ТАДКИКОД НАТИЖАЛАРИ
Институт тажриба далаларида етиштирилаётган галла усимликаридан АСПВини ажратиш ва урганиш максадида бугдойнинг ^айроктош, Ок марварид, Пах,лавон, Бардош, Илгор, Морокко, Гром навлари уруглари гултувакларга экилди ва касаллик аломатлари ривожланган АСПВ га табиий инфекцион булган, АСПВга хос касаллик аломатлари мавжуд кучатзорларга апрель ойида жойлаштирилди ва майсаларнинг усиши, касаллик аломатлари ривожланиши хдмда уларда усимлик битлари(ширалари) миграцияси ва купайиши кузатиб борилди.
Бугдойнинг барча навларида усимлик битлари (ширалар) (1-расм^) ва шу билан бирга АСПВига хос касаллик аломатларининг ривожланиши кузатилди, яъни усимликнинг барг учидан саргайиши, сунг усимлик саргайиши, усишдан ортда колиб паканилиги ва куриб колиш х,олатлари кузатилди (1-расм,А,С,Ф). Тажриба усимликларимизда катта галла
UIF-2022: 8.2 SCIENCE AND INNOVATION 2022
ISSN: 2181-3337 INTERNATIONAL SCIENTIFIC JOURNAL №4
шираси -Sitobeon avenae F., черемуха шираси- Rhopalosiphum padi,оддий галла шираси -Schizaphis graminum ривожланди. Шира тури УзРФА Зоология институти кичик илмий ходими Ш. Назаров томонидан аникланди.
1-расм АСПВ нинг буFдой усимликларидаги касаллик аломатлари А, С,Ф -АСПВ билан касалланган буFдой усимликлари, В, Е- соFлом усимликлар, Д-Fалла ширалари 1-Rhopalosiphum padi 2- Schizaphis graminum
Шираларнинг вирофорблигини аниклаш максадида изоляция хоналарида бугдойнинг ^айроктош ва Бардош навларини гултувакларда устирилиб, 5-6 смли майсаларнинг х,ар бирига 5тадан ширалар утказилди. Уларда х,ам АСПВга хос белгилар кузатилди (2-расм).
2-расм. Галла ширалари ёрдамида АСПВ юктирилган буFдой майсалари
Касаллик аломатлари аник куринган бугдой усимлик баргларида АСПВини изолятларини аниклаш максадида полимераза занжир реакцияси олиб борилди. Усимлик намуналари х,овончага солиниб, суюк азот ёрдамида гомогенизация килинди. Гомоген массадан 200 мг 1,5 мл хджмдаги эппендорф пробиркасига солинди, 1
UIF-2022: 8.2 SCIENCE AND INNOVATION 2022
ISSN: 2181-3337 INTERNATIONAL SCIENTIFIC JOURNAL №4
мл лизис буфер ва меркаптаэтанол солиниб вортексланди. Хона хароратида 3 дакика инкубация килнди. 2600 айл./дак тезликда 5 дакика центрифугаланди. Центрифугаланган пробирканинг супернатанти бошка пробиркаларга солинди. Пробиркаларга 1:1,5 нисбатда 96% ли этанол солиниб вортексланди. 700 |i1 эритма спин-колонкага солинди(эппендорф пробирка билан) солинди ва 12000 айл./дак тезликда 15 секунд центрифугаланди.
700 |i1 ювувчи буфер №1 спин-колонкага солинди. Центрифугада 12000 айл/дак тезликда 15 сек центрифугаланди, сунг спин-колонкалар янги пробиркага олинди. Кейин 500 ювувчи буфер №2 спин-колонкага солинди ва 12000 айл/дак тезликда 15 секунд центрифугаланди. Пробиркани 12000 айл/дак тезликда 15 секунд центрифуга килинди. спин-колонкалар янги пробиркага солинди ва сорбент мембрана устига марказий кисмига 100 Rnase-Free water солиниб, хона хароратида 2 дакика инкубация килиниб, 12000 айл.\ тез.да 2 дакика центрифугаланди ва элюция килинган РНК эппедорф пробиргага олинди ва - 20°С харорат музлатгичда сакланди.
1-жадвал АСПВ штаммларининг праймерлари
Shu-F TACGGTAAGTGCCCAACTCC
Yan-R TGTTGAGGAGTCTACCTATTTG
S2a-F TCACCTTCGGGCCGTCTCTATCAG
S2b-F TCACCTTCGGGGCGTCTCTTTCTG
Ажратиб олинган АСПВ РНК тескари транскрипция, кДНК синтезида универсал Yan-R праймери фойдаланилди ва ПЗР MiniAmp™Plus Thermal Cycler (Applied BioSystems, USA) амплификаторида амалга оширилди.. [Carolyn M. Malmstrom, Ruijie Shu, 2004]
АСПВ нинг ORF-3 генининг тескари транскрипцяни амалга ошириш учун куйидаги таркибий кисмлар ишлатилди: тескари транскрипция кДНК олиш учун "OT-1" реактивлар туплами курсатмаси асосида аралашма (master mix) тайёрланиб олинди бу икки боскичда амалга оширилди.
1-боскич: RNK-5 |1, ddH2O-2 |1, Yan-R праймер - 2 |1 микропробиркага солиб, 70 °C 2 дак. амплификаторга куйилди. Кейин амплификатордан намуналар олиниб муз устига куйилди.
2-боскич: 2x ПЗР буффер -8 |1, dNTP-2 |1, MMLV-RT-1 |1, аралашма (master mix) тайёрланди, ва 1 боскич аралашмага кушилди
Тескари транскрипция термоциклик дастури: 37°C - 60 дакика, 70°C - 10 дакикада 1 циклда давом этади.
Синтез килинган кДНКни ПЗР куйиш учун куйидаги таркибий аралашма (master mix) тайёрланди: PLATINUM HS PCR 2X Master Mix (Invitrogen, USA) тупламидан Platinum Master Mix-12,5^1, ddH2O- 4,5^1, Yan-R- ^1, S'hu-F- ^1, S2a-F- ^1, S2b-F- ^1, cDNK-4^1. ПЗР термоциклик дастури: бошлангич денатурaция - 94° 10 дакика 1 цикл; денатуратция 94° 10 секунд, отжиг - 55° 30 секунд ва элонгация 72° 1 дакика 35 циклда такрорланди; якуний элонгация - 72° 10 дакика давом этди.
ПЗР махсулотлари анализи электрофорез ёрдамида 10x трис-борат-ЕДТА буферида (TBE, Thermo Scientific) тайёрланган 2% агароза гелида, этидиумбромид билан аникланди. 10 мкл намунага 3 мкл буёк (6x DNA loading dye, Fermentas) ва агароза чукурчасига намуна билан биргаликда солинди. Маркерлар сифатида ДНКнинг маълум
улчамдаги 100bp DNA Lader (Invitrogen, USA) молекулалари аралашмасидан фойдаланилди. Электрофорез 100В да 60 дакика давомида горизонтал электрофорез СЕ-2(Хеликон, Россия) ёрдамида амалга оширилди.
a-BYDV-PAV
/
b-BYDV-RPV
c-BYDV-RPV / d-BYDV-RPV
1 2 3 4 5 6 7
3-расм. АСПВ штамларининг ПЗР тахлили.
Гел трансиллюминатор Квант-С (Хеликон, Россия) да олинган электрофореграмма натижасига кура бугдойнинг ^айроктош навида АСПВ-PÄV штамига хос 600 bp ампликон ва ундан ташкари ушбу навнида АСПВ-RPV штамига хос 372 bp ампликон борлиги аникланди. Иккинчи ва учинчи намуналарда АСПВ аникланмади. Туртинчи намуна Морокко навида ва олтинчи намуна Бардош навида АСПВ-RPV штамига хос 372 bp ампликон борлиги аникланди.
ХУЛОСА: Шундай килиб, Тошкент вилояти ^ибрай тумани Дурмон Институт тажриба даласига экилган бугдойнинг табиий инфекцион фонида АСПВ ва унинг ташувчилари-усимлик битлари бугдой майсаларига утказилди ва уларда купайтирилди. Касаллик аломатлари урганилди ва намуналар йигилди. Йигилган намуналардан АСПВ РНК си ажратилди. Ажратиб олинган АСПВ РНК си OT-ПЗР усулида урганилди. Тадкикод натижасида бугдой навлари АСПВ-PÄV ва АСПВ-RPV штаммлари билан зарарланганлиги аникланган. Бугдойнинг ^айроктош нави АСПВнинг PAV ва RPV штаммалри билан ва Морокко, Бардош навлари эса АСПВнинг RPV штамми билан касаланганлиги аникланди.
МУ^ОКАМА:
Тадкикотимиз натижалари олдинги куплаб тадкикотларда курсатилган арпанинг сарик паканалик АСПВ-PÄV ва АСПВ-RPV штамлари бугдойнинг касаллинтирувчи предоминант штаммлар эканлигига мос келади. АСПВ-PÄV Эроннинг барча минтакаларида етиштириладиган дон экинларида BYDV вирусларнинг асосий серотипи эканлиги аникланди (Rastgou ва бошк., 2004b). Бундан ташкари 2013 йилдан 2015 йилгача Миннесота ва Жанубий Дакота тупланган 463 та намуналардан, тахминан 50%-да (n = 222) АСПВ вирус мавжудлиги аникланди. Вирус билан зарарланган намуналарнинг
UIF-2022: 8.2 SCIENCE AND INNOVATION 2022
ISSN: 2181-3337 INTERNATIONAL SCIENTIFIC JOURNAL №4
аксариятида (n = 146) арпанинг сарик паканалик PAV штами аникланган (Anil Adhikari ва бошк., 2020).
Ушбу тадкикотда кулланилган ОТ-ПЗР тах,лили Узбекистонда бугдойда АСПВ инфекциясини молекуляр диагностика килишда фойдали эканлигини исботлади. Вирус хилма-хиллигини тушуниш бизга тегишли бугдой вируслари карши кураш чоралари ишлаб чикишга ёрдам беради, шу жумладан препаратларни ишлаб чикиш ва вирусларга чидамлилик бугдой генотипларни селекция килиш ва кишлок хужалигига тадбик килиш мух,им хисобланади.
REFERENCES
1. Горбунова Н.И., Успенская Н.В., и Шевакова, М.Н. 1966.Полосатой мозаики пшеницы в Узбекистане . Вирусные болезни сельскохозяйственных растений и методы защиты. Киев.. 378-381 стр.
2. K.M Makkouk, S. Kumari, Z Kadirova, A.Zueva, First record of Barley yellow striate mosaic virus and Cereal yellow dwarf virus-RPV infecting wheat in Uzbekistan. Plant Disease /vol.85 No.10 October 2001
3. Z.N. Kadirova, A.A. Zueva, and A.A. Abdikarimov Identification of Cereal Viruses in Uzbekistan Barley Yellow Dwarf Disease: Recent Advances and Future Strategies Proceedings of an International Symposium Held at El Batán, Texcoco, Mexico 1-5 September 2002. pp 108-109.
4. ^одирова 3.H., Махмудов Т.Х,.,Ахмаджонов М.,А.А.Абдукаримов Узбекистон Республикасининг айрим вилоятларида бугдойнинг вирус касалликларини таркалишини урганиш.O'zbekiston Respublikasi Fanlar akademiyasining Maruzalari 42020. 83-88 bet
5. Махмудов Т.Х., ^одирова З.Н., А.А.Абдукаримов Арпанинг сарик паканалик вирусининг иммуноблотинг диагностикаси. O'zbekiston Respublikasi Fanlar akademiyasining Maruzalari 5-2021. 75-79 bet.
6. Fayziev, V., Jovlieva, D., Juraeva, U., S'havkiev, J., Es'hboev, F. Yeffects of PVXN-UZ 915 necrotic isolate of Potato virus X on amount of pigments of Datura stramonium leaves/Journal of Critical Reviews, 2020, 7(9), str. 400-403
7. Khusanov Tokhir Sunnatovich., Kadirova Zarifa Nasirovna., Davronov Kodirjon Sotvoldievich., Akhmedova Zakhro Rakhmatovna, Analysis оf Lysimetric Parameters оf The Yeffect Of Chemical And Biological Drugs Against Alfalfa Mosaic Virus. The American Journal оf Agriculture And Biomedical engineering JULY 2020 Page No.: 25-29 Volume-II Issue-VII PUBLIS'hED: 30 JULY 2020 www.usajournals'hub.com/inde x.php/tajabe.
8. Carolyn M. Malmstrom, Ruijie Shu. Multiplexed RT-PCR for streamlined detection and separation of barley and cereal yellow dwarf viruses. October 2004; Journal of Virological Methods 120(1):69-78
9. Jensen, Virology 38: 83, 1969. Orlob, Arny & Medler, Phytopathology 51: 515, 1961. Oswald & Houston, Pl. Dis. Reptr 35: 471, 1951.
10. Т.Б Касталева Выделение вируса желтой карликовости ячменя из естественно зараженных растений овса и ячменя //Доклады ВАСХНИЛ-Москва, 1994. - С. 23-25.
UIF-2022: 8.2 SCIENCE AND INNOVATION 2022
ISSN: 2181-3337 INTERNATIONAL SCIENTIFIC JOURNAL №4
11. Кеглер X., Кляйнхемпель X., Вердеревская Т. Борьба с вирусными болезнями плодовых культур. -М. Агропромиздат. 1986.- с. 326-356.
12. Rastgou M, Khatabi B, Yasaei A, Afsharifar AR, Masoumi M and Izadpanah K (2004b) Distribution and new hosts of viruses causing yellow dwarf in cereals. Proc. 16th Iranian Plant Protection Congress. 61
13. Anil Adhikari, Benham E. Lockhart, Mala Ganiger, Emmanuel Byamukama, Connie Tande, Madeleine J. Smith, Ruth Dill-Macky,Barley yellow dwarf virus-PAV is the dominant species causing Barley yellow dwarf disease in South Dakota and Minnesota. Crop Protection, 2020, Volume 134, 2020,105171.
14.Мусахоновна Л. УЗЛУКСИЗ ТАЪЛИМ ТИЗИМИДА БИОЛОГИЯ ФАНИДАН САМАРАДОРЛИККА ЭРИШИШДА ЭЛЕКТРОН ТАЪЛИМИЙ ВОСИТАЛАРДАН ФОЙДАЛАНИШНИНГ ИЛМИЙ-АМАЛИЙ АСОСЛАРИ //Science and innovation. - 2022. - Т. 1. - №. B3. - С. 577-585.
15..Dzhuraev R. K., Karakhanova L. M. Model of the organization of research activities of 10th grade students in teaching physics and biology //International journal of discourse on Innovation, integration and education. - 2021. - Т. 2. - №. 01. - С. 296-300.
16.ДЖУРАЕВ Р. Х., КАРАХАНОВА Л. М. Модель организации исследовательской деятельности учащихся 10 классов при преподавании физики и биологии //International journal of discourse on Innovation, integration and education. - 2021. - Т. 2. - №. 1. - С. 295299.
17..Musokhonovna K. L. ICT-As a means of achieving new educational results in teaching natural disciplines in secondary schools //ACADEMICIA: An International Multidisciplinary Research Journal. - 2021. - Т. 11. - №. 10. - С. 315-321.
18.Kharaxonova L. M. SPECIFIC ASPECTS OF MEDIA EDUCATION AND ITS USE IN HIGH SCHOOLS //Academic research in educational sciences. - 2021. - Т. 2. - №. CSPI conference 3. - С. 278-284.
19.Караханова Л. 6. DEVELOPMENT OF STUDENTS'KNOWLEDGE BASED ON THE USE OF 3D EDUCATIONAL TECHNOLOGIES IN THE BIOLOGY EDUCATION //Образование и инновационные исследования международный научно-методический журнал. - 2020. - №. 2. - С. 55-59.
20.Джураев Р. Х., Карахонова Л. М. Медиаобразование как фактор повышения качества обучения школьников //Образование через всю жизнь: непрерывное образование в интересах устойчивого развития. - 2013. - Т. 11. - №. 2. - С. 322-323.
21Сафарова Р. Г. и др. Укувчи-ёшларни оммавий маданият хуружларидан х,имоя килишнинг назарий-методологик асослари. - 2017.
22.Karakhanova L. M. USE OF MEDIERE RESOURCES IN THE EDUCATIONAL PROCESS OF BIOLOGY IN SCHOOLS //International Scientific Review of the problems of pedagogy and psychology. - 2018. - С. 68-70.
23.Karakhonova L. M. Using the electronic educational resources in biology lessons //INTERNATIONAL SCIENTIFIC REVIEW OF THE PROBLEMS OF PHILISOPHY, PSYCHOLOGY AND PEDAGOGY. - 2019. - С. 35-39.
24.Jurayev, R. K., & Karakhanova, L. M. (2020). Scientific And Methodical Bases Of The Use Of Electronic Educational Resources In Teaching Biology In General Educational Schools. International Journal of Advanced Science and Technology, 29(8), 3500-3505.
UIF-2022: 8.2 SCIENCE AND INNOVATION 2022
ISSN: 2181-3337 INTERNATIONAL SCIENTIFIC JOURNAL №4
25.Musaxonovna, K. L. (2022). General secondary schools requirements for the introduction of informed educational resources for the development of natural sciences. ACADEMICIA: An InternationalMultidisciplinary Research Journal, 12(5), 855-860.
26.1Караханова Л. М. НОВЫЕ ИНТЕРАКТИВНЫЕ ЭЛЕКТРОННЫЕ РЕСУРСЫ В СОВРЕМЕННОМ ОТКРЫТОМ ОБРАЗОВАНИИ В ОБУЧЕНИИ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК //Academic research in educational sciences. - 2021. - Т. 2. - №. CSPI conference 1. -С. 1303-1305.
27Джураев, Р. Х., & Карахонова, Л. М. (2022). ПЕДАГОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ОДАРЕННЫХ ДЕТЕЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫМИ УЧРЕЖДЕНИЯМИ. INTEGRATION OF SCIENCE, EDUCATION AND PRACTICE. SCIENTIFIC-METHODICAL JOURNAL, 3(4), 6670.
28.ДЖУРАЕВ Р. Х., КАРАХАНОВА Л. М. Модель организации исследовательской деятельности учащихся 10 классов при преподавании физики и биологии //International journal of discourse on Innovation, integration and education. - 2021. - Т. 2. - №. 1. - С. 295299.
