CC BY
50
DOI: 10.37489/0235-2990-2020-65-1-2-10-14
Антимикробные свойства водорастворимых полисахаридов и спиртовых экстрактов мицелия Laetiporus sulphureus (bull.) Murrill и разработка биотехнологии его получения в иммобилизованной культуре на бактериальной целлюлозе
*И. А. ГАВРЮШИНА1-2, Т. И. ГРОМОВЫХ2, Н. Б. ФЕЛЬДМАН2, С. В. ЛУЦЕНКО2, В. И. ПОНОМАРЕНКО1, О. В. КИСИЛЬ1, В. С. САДЫКОВА1
1 ФГБНУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе, Москва
2 ФГАОУ ВО Первый московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова, Москва
Antimicrobial Properties of Water-Soluble Polysaccharides and Alcoholic Extracts of Laetiporus Sulphureus (Bull.) Murrill Mycelium and Development of Biotechnology for Its Production in Immobilized Culture on Bacterial Cellulose
* I. A. GAVRYUSHINA12, T. I. GROMOVYKH2, N. B. FELDMAN2, S. V. LUTSENKO2, V. I. PONOMARENKO1, O. V. KISIL1, V. S. SADYKOVA1
1 FSBI Gause Institute of New Antibiotics, Moscow
21. M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation
Статья посвящена разработке нового способа получения мицелия базидиомицета Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill, иммобилизованного на матрице бактериальной целлюлозы. Мицелий содержит биологически активные соединения, с антимикробной активностью в отношении грамположительных бактерий, в том числе в отношении резистентного стафилококка. Целью работы было получение иммобилизованного мицелия путём совместного культивирования L.sulphureus с продуцентом бактериальной целлюлозы Gluconacetobacter hansenii. Исследованиями авторов установлено, что при совместном культивировании базидиального штамма L.sulphureus со штаммом-продуцентом бактериальной целлюлозы G.hansenii продуктивность увеличивается на синтетической среде Н5/1 в 3,2 раза, а на натуральной среде Maltax-10 (концентрация 5%) в 1,9 раза. Полученный иммобилизованный мицелий L.sulphureus, водные экстракты которого, содержащие глюканы, обладают антибактериальными свойствами.
Ключевые слова: Laetiporus sulphureus, ксилотрофный базидиомицет, биотехнология, иммобилизованный мицелий, бактериальная целлюлоза, антимикробная активность, Gluconacetobacter hansenii.
The article discusses the development of a new method of producing Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill basidiomycete mycelium immobilized on a bacterial cellulose matrix. Mycelium contains biologically active compounds with antimicrobial activity against Gram-positive bacteria, including resistant staphylococcus. The aim of the work was to obtain immobilized mycelium by co-cultivation of L.sulphureus with the producer of bacterial cellulose Gluconacetobacter hansenii. The authors found that when co-culturing the basidial L.sulphureus strain with the bacterial cellulose producing G.hansenii strain, productivity increases by 3.2 times on H5/1 synthetic medium and by 1.9 times on natural Maltax-10 medium (concentration 5%). The resulting immobilized L.sulphureus mycelium has antibacterial properties; its aqueous extracts contain glucans.
Keywords: Laetiporus sulphureus, xylotrophic basidiomycete, biotechnology, immobilized mycelium, bacterial cellulose, antimicrobial activity, Gluconacetobacter hansenii.
Базидиомицет вида Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill — серно-жёлтый трутовик, относится к царству Fungi, отделу Basidiomycota, классу Basidiomycetes, подклассу Homobasidiomycetideae, порядку Aphyllophorales, семейству Polyporaceae, роду Laetiporus. Серно-жёлтыш трутовик является
© Коллектив авторов, 2020
*Адрес для корреспонденции: 119021 Москва, ул. Б. Пироговская, д. 11, стр. 1. НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе
факультативным сапротрофом, вызывающим красно-бурую деструктивную и стволовую гниль, красно-бурую призматическую ядровую гниль у лиственных деревьев. Представитель вида L.sul-phureus встречается в Сибири, странах Юго-Восточной Азии. Ареал распространения этого вида находится также в Европе, Северной и Южной Америке [1—3].
Представители этих видов синтезируют и накапливают в мицелии водорастворимые полисахариды (бета-глюканы), каротиноиды и
другие биологически активные соединения. Бе-та-глюканы и каротиноподобные соединения, синтезируемые L.sulphureus, обладают иммуно-модулирующими, противоопухолевыми и анти-оксидантными свойствами. Иммуномодулиру-ющие свойства известны и для спиртовых экстрактов мицелия; экстракты увеличивают выход интерлейкина IL-4 и уменьшают воспалительный запальный цитокинез фактора некроза опухолей a-TFN [3, 4].
Спиртовые экстракты мицелия обладают противовирусной активностью в отношении вируса простого герпеса первого типа (ВПГ-1), который проявляет устойчивость к ингибиторам ацикло-виру и фосфорноуксусной кислоте, а также обладает противовирусной активностью в отношении вирусов растений. Кроме того, для L.sulphureus известна антифунгальная активность в отношении дереворазрушающих грибов: Coniophora cere-bella, Coriolus versicolor, Fomes fomentarius, Trametes radiciperda и Trichoderma viride [5—9].
Получить биомассу мицелия базидиальных грибов возможно путём твердофазного и жид-кофазного культивирования. Использование биотехнологических методов в получении биомассы мицелия имеет ряд преимуществ, таких как безотходность производства препаратов, недефицитность сырьевых ресурсов и неограниченная возможность. Рост базидиальных грибов зависит от оптимального состава питательной среды и от условий культивирования: температуры, рН питательной среды, влажности субстрата, аэрации, света [2, 3]. Для повышения продуктивности биомассы мицелия бази-диомицетов необходимо проводить оптимизацию условий культивирования и состава питательной среды. Одним из основных факторов при культивировании является наличие в среде питательных веществ, преимущественно источников углерода [10, 11].
Перспективным направлением является получение биологически активных соединений на основе мицелия базидиальных грибов. Однако существует проблема получения мицелия видов L.sulphureus в условиях жидкофазной ферментации.
С целью решения данной проблемы повышенный интерес вызывает такой уникальный нетоксичный, биосовместимый и биоразлагаемый полимер как бактериальная целлюлоза, которая будет использоваться в качестве подложки и источника питательных веществ. В биотехнологии бактериальную целлюлозу рекомендуют для иммобилизации клеток и трудно культивируемых продуцентов [12—14].
Целью работы — получение иммобилизованного мицелия штамма L.sulphureus MZ-22 на бактериальной целлюлозе, изучение его биохимического состава и антимикробных свойств.
Материал и методы
Получение мицелия и матриц для иммобилизации проводили с использованием штаммов: L.sulphureus (Bull.) Muriill штамм MZ-22 (ВКМ F-4276D) — ксилотрофного базидиоми-цета и G.hansenii GH-1/2008 (ВКПМ В-1054) — продуцента бактериальной целлюлозы [10, 14]. Иммобилизацию мицелия проводили при совместном культивировании базидиального гриба L.sulphureus со штаммом-продуцентом бактериальной целлюлозы G.hansenii в двух вариантах: на синтетической среде состава, г/л: глюкоза — 7,0; дрожжевой экстракт — 5,0; Na2HPO4 — 0,27; K2HPO4 — 0,2; (NH4)2SO4 — 0,3; моногидрат лимонной кислоты — 0,115, рН среды 6,5 и на натуральной среде Мальтакс-10 (5%). Культивирование проводили в течение 30 сут при температуре 28±2°С. Посевной материал продуцента G.hansenii выращивали при перемешивании 120 об/мин в течение 5 сут. на жидкой среде Н5 следующего состава, г/л: глюкоза — 70,0; дрожжевой экстракт — 5,0; Na2HPO4 — 2,7; K2HPO4 — 2,0; (NH4)2SO4 — 3,0; моногидрат лимонной кислоты — 1,15; спирт — 5,0, рН 4,0.
Посев инокулята штамма G.hansenii проводили суспензией с титром 108 КОЕ/мл в объеме 10 см3. Посевной материал продуцента F.officinalis выращивали на агаровой среде Maltax-10 в концентрации 5%. Посев проводили агаровым блоком газонной культуры мицелия L.sulphureus размером 10x10x5 мм3. Через 48 ч в колбы вносили инокулят агарового блока площадью 1 см2 мицелия L.sulphureus и культивировали смешанную культуру в течение 30 сут. в термостате при температуре 28±1°С.
Полученные плёнки иммобилизованного мицелия на матрице бактериальной целлюлозы отделяли от культуральной жидкости, высушивали в сухожаровом шкафу при t=60°C до постоянной массы. Содержание белка в мицелии базидиоми-цета, полученного как в монокультуре, так и на матрице бактериальной целлюлозы, определяли методом Брэдфорда [13].
Продуктивность мицелия рассчитывали по количеству белка в образцах иммобилизованного мицелия на бактериальной целлюлозе, следующим образом: А — количество мицелия в образце (%), В — количество белка в образце мицелия, полученном в монокультуре (%); С — количество белка в иммобилизованном мицелии на бактериальной целлюлозе, полученного в смешанной культуре (%), тогда количество мицелия в нем будет составлять:
А = В X 100 / С.
Количественное содержание глюканов определяли в мицелии базидиомицетов L.sulphureus, полученном как при моно-, так и при совместном культивировании со штаммом-продуцентом бактериальной целлюлозы G.hansenii.
Мицелий, высушенный в сухожаровом шкафу при температуре 60°С до постоянной массы, измельчали в гранитной ступке. Растёртый мицелий пересыпали в колбу с притёртой крышкой и заливали дистиллированной водой в соотношении 1 мас. ч. сырья : 30 об. ч. дистиллированной воды. Суспензию взбалтывали и настаивали в течение 60 мин при температуре 20—22°С. Настоявшуюся суспензию взбалтывали, затем отбирали 1/4 часть от общего объёма и убирали в холодильник на 24 ч. 3/4 части суспензии от общего объёма дезинтегрировали ультразвуком при помощи ультразвукового дезинтегратора Sonicator Q500, QSONICA. Дезинтеграцию проводили в течение 5 мин, амплитуда (интенсивность) составляла 40%. После дезинтеграции отбирали 1/4 часть суспензии и убирали в холодильник на 24 ч. Оставшуюся часть суспензии повторно дезинтегрировали ультразвуком при тех же условиях и убирали в холодильник на 24 ч.
После настаивания в холодильнике образцы суспензий (без дезинтеграции, дезинтеграция 5 мин, дезинтеграция 10 мин) пропускали через бумажный фильтр. Профильтрованную жидкость разбавляли в 4 раза 96% этанолом, тщательно перемешивали и центрифугировали 60 с при 12000 об/мин. Полученный осадок после центрифугирования высушивали в сухожаровом шкафу при температуре 50—55°С. Сухой осадок вы-
Таблица 1. Показатели продуктивности Laetiporus sulphureus при моно- и совместном культивировании с Gluconacetobacter hansenii
Штамм Продуктивность, г/л Продуктивность, Удельная продуктивность,
г/л в сутки %
L.sulphureus в монокультуре 2,87 0,10 9,57
L.sulphureus на бактериальной целлюлозе 13,44 0,45 44,80
деленных полисахаридов взвешивали на аналитических весах марки Axic.
Количество каротиноидньж пигментов, содержащихся в спиртовьж экстрактах мицелия штамма L.sulphureus, полученном, как при моно-, так и при совместном культивировании с G.hansenii определяли фотометрическим методом при длине волны 450 нм. Разделение фракции каротиноидов, полученной из мицелия L.sulphureus проводили методом ВЭЖХ при 450 нм. на колонке Poroshell C18 (4,6x50 мм; 2,7 мкм) в градиенте аце-тонитрила (от 0 до100%) при скорости потока 0,5 мл/мин.
Спектр антимикробной активности определяли на тест-культурах условно-патогенных микроскопических грибов и бактерий из коллекции культур Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе методом диффузии в агар на тест-культурах ФГБНУ «НИИНА».
Для определения антимикробной активности препаратов были использованы следующие культуры бактерий: Staphylococcus aureus ATCC 21027 (=209 P), Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli АТСС 25922, условно-патогенные грибы принадлежали к микромицетам рода Aspergillus: A.fumi-gatus КБП F24, A.niger INA 00760; дрожжевые условно-патогенные грибы — Candida albicans АТСС 2091. Контролем чувствительности тест-организма служили стандартные диски с нистатином для грибов (80 мкг/мл, «НИИ Пастера»,Россия) и ампициллином для бактерий («НИИ Пастера», 10 мкг/мл).
Для экспериментов по определению антимикробной активности тестируемых соединений готовили инокулюм бактериальных тест-культур, для чего использовали чистую суточную культуру бактерий, выращенных на соответствующих плотных питательных средах при температуре 35°C. Далее в
стерильном физиологическом растворе (0,85% №С1) готовили взвесь микроорганизмов, доводя её до определённой плотности. Плотность бактериальных суспензий составляла 0,5 по стандарту МакФарланда (1,5х108 КОЕ/мл) и при дальнейшем разведении бульоном Мюллера—Хинтон в 100 раз концентрация микробньж клеток снижалась до 5х105 КОЕ/мл.
Результаты исследований
Штамм L.sulphureus хорошо растёт совместно с G.hansenii на синтетической среде Н-5, формируя на бактериальной целлюлозе лёгкий, воздушный мицелий оранжевого цвета. На поверхности питательных сред на 5-7-е сутки совместного жидко-фазного стационарного культивирования образуются различной толщины плёнки бактериальной целлюлозы, а затем в условиях иммобилизации начинается рост мицелия базидиомицетов. Сравнительный анализ показателей продуктивности штамма L.sulphureus при монокультивировании и в условиях иммобилизации при совместном культивировании с G.hansenii представлен в табл. 1.
При совместном культивировании общая продуктивность штамма L.sulphureus выше в 4,7 раза, чем при монокультивировании, и составляет 13,44 г/л. Суточная и удельная продуктивность этого штамма в смешанной культуре с G.hansenii
ВЭЖХ каротиноидного комплекса спиртовых экстрактов мицелия L.sulphureus.
Таблица 2. Содержание водорастворимых глюканов в мицелии Laetiporus sulphureus, мг/г
Образец мицелия L.sulphureus в монокультуре L.sulphureus на бактериальной целлюлозе
Время дезинтеграции 0 мин 5 мин 10 мин 0 мин 5 мин 10 мин
Количество глюканов в мицелии, мг/г 6,9 7,5 11,3 12,2 14,9 27,2
Таблица 3. Антибактериальная активность водных экстрактов мицелия Laetiporus sulphureus
Водорастворимые экстракты Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Escherichia coli _ATCC 21027_ATCC 6633_АТСС 25922_
L.sulphureus в монокультуре 24,35+0,21 18,32+0,17 Не активны
L.sulphureus на бактериальной целлюлозе 22,32+0,14 16,14+0,22 Не активны
на синтетической среде Н-5 составила, соответственно, 0,45 г/л в сутки и 44,80%.
Спиртовые экстракты мицелия L.sulphureus представляют собой в основном смесь каротино-идов. Исследования показали, что количество ка-ротиноидных пигментов в иммобилизованном мицелии L.sulphureus на бактериальной целлюлозе составляет 0,21%, а в монокультуре — 0,15% Установлено, что наибольшее количество каро-тиноидных пигментов синтезируется в иммобилизованном на бактериальной целлюлозе мицелии L.sulphureus.
При концентрации ацетонитрила от 70 до 75% с колонки в виде трёх пиков элюируются основные каротиноиды мицелия L.sulphureus: латипо-ровая кислота А, дезоксилатипоровая кислота и масутакиевая кислота А, что соответствует данным литературы (рисунок).
Результаты исследования водорастворимых фракций мицелия показали, что глюканов в мицелии L.sulphureus иммобилизованном на бактериальной целлюлозе содержится в 2 раза больше, чем в монокультуре. Наибольший выход глюканов был получен после 10 мин дезинтеграции ультразвуком, как в монокультуре, так и в иммобилизованном мицелии. Так, в монокультуре мицелия L.sulphureus содержится 11,3 мг/г и в иммобилизованном мицелии 27,2 мг/г глюканов, соответственно (табл. 2).
Оценка антимикробной активности водных и спиртовых экстрактов монокультуры и иммобилизованного на бактериальной целлюлозе мицелия L.sulphureus показала, что спиртовые экстракты не обладают антимикробной активностью в отношении всех тест-организмов. Водорастворимые фрак-
ЛИТЕРАТУРА
1. Бухало A.C., Бабицкая В.Г., Бисько H.A. и др. Биологические свойства лекарственных макромицетов в культуре. Сборник научных трудов в 2-х т. Киев: Альтпресс, 2011. — Т. 1. — 212 с. / Bukhalo A.S., Babitskaya V.G., Bis'ko N.A. i dr. Biologicheskie svojstva lekarstvennykh makromitsetov v kul'ture. Sbornik nauchnykh trudov v 2-kh t. Kiev: Al'tpress, 2011; 1: 212. [in Russian]
2. Ильина Г.В., Ильин Д.Ю. Ксилотрофные бизидиомицеты в чистой культуре. Пенза: РИО ПГСХА, 2013. — С. 224. / Il'ina G.V., Il'in D.Jyu. Ksilotrofnye bizidiomitsety v chistoj kul'ture. Penza: RIO PGSKhA, 2013; 224. [in Russian]
3. Sulkowska-Ziaja K, Muszynska B, Gawalska A., Salaciak K. Laetiporus sulphureus — chemical composition and medical value. Acta Scientiarum Polonorum-Hortorum cultus 2018; 17: 1: 87—96. doi: 10.24326/asphc.2018.1.8
4. Klaus A., Niksic M, Kozarski M. et al. The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants. International Journal of Food Sciences and Nutrition 2013; 64: 5: 599-610.
ции, содержащие глюканы в количестве 4 мг/мл, обладали высокой активностью в отношении грам-положительных бактерий Staphylococcus aureus ATCC 21027, Bacillus subtilis ATCC 6633, но оказались неактивны в отношении Escherichia coli ATCC 25922 и дрожжевых и мицелиальных грибов. Содержание антибиотических компонентов не зависит от способа культивирования мицелия и не оказывает влияние на антимикробную активность (табл. 3).
Заключение
В наших исследованиях показано, что иммобилизованное культивирование базидиомицета L.sulphureus с G.hansenii позволяет увеличить продуктивность мицелия в 4,7 раза. В биомассе, полученной при совместном культивировании с G.hansenii, доля иммобилизованного мицелия L.sulphureus составляет 81,96%, что доказано наличием белка (14,46%), каротиноидных пигментов (0,21%). Таким образом, культивирование L.sulphureus и G.hansenii позволяет получать иммобилизованный мицелий на бактериальной целлюлозе с большей продуктивностью, что перспективно для разработки биотехнологии антимикробных веществ водорастворимых соединений, содержащихся в биомассе.
Разделы работы, посвящённые ВЭЖХ анализу активных компонентов биомассы грибов (ка-ротиноидов и агарициновой кислоты), а также определению антимикробной активности, выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 18-74-10073).
5. Kovacs, D, Vetter J. Chemical composition of mushroom Laetiporus sulphureus (Bull.) Murill. Acta Alimentaria 2015; 44: 1: 104-110.
6. Wu H.T., Lu F.H., Su Y.C., Ou H.Y., Hung H.C., Wu J.S., YangY.C, Chang C. J. In vivo and in vitro antitumor effects of fungal extracts. Molecules 2014; 19 (2): 2546-2556.
7. Zhang J., Jianhua L, Zhao L, Shui X., Wang L. Antioxidant and antimicrobial activities and chemical composition of submerged cultivated mycelia of Laetiporus sulphureus. Chemistry of Natural Compounds 2018; 54: 6: 1187-1190.
8. Kolundzic M, Grozdanic N, Stanojkovic T, Milenkovic M, Dinic M, Golic N, Kojic M, Kundakovic T. Antimicrobial and Cytotoxic Activities of the Sulphur Shelf Medicinal Mushroom, Laetiporus sulphureus (Agaricomycetes), from Serbia. Intern J Med Mushrooms 2016; 18: 6: 469-486.
9. Трошкова Г.П., Костина H.E, Бардашева A.B. Базидиальные грибы Западной Сибири — продуценты противоопухолевых соединений. Стабильность антибактериальной активности мицелиальных грибов в процессе хранения. Успехи медицинской микологии. — 2014. — Т. 12. — С. 355-358. / Troshkova G.P., Kostina N.E, Bardasheva A.V. Bazidial'nye griby
Zapadnoj Sibiri — produtsenty protivoopukholevykh soedinenij. Stabil'nost' antibakterial'noj aktivnosti mitselial'nykh gribov v protsesse khraneniya. Uspekhi Meditsinskoj Mikologii 2014; 12: 355-358. [in Russian]
10. Олейников Д.Н., Танхаева Л.М., Агафонова C.B. Антиоксидантные компоненты плодовых тел Laetiporus sulphureus (Bull.: Fr) Murr. Прикладная биохимия и микробиология. — 2011. — Т. 47. — № 4. — С. 462-468. / Olennikov D.N., Tankhaeva L.M., Agafonova S.V. Antioksidantnye komponenty plodovykh tel Laetiporus sulphureus (Bull.: Fr) Murr. Prikladnaya Biokhimiya i Mikrobiologiya 2011; 47: 4: 462-468.
11. HwangH.S., YunJ.W. Hypoglycemic effect ofpolysaccharides produced by submerged mycelial culture of Laetiporus sulphureus on streptozo-tocin-induced diabetic rats. Biotechnol Bioproc Engineer 2010; 15: 173-181.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Гаврюшина Ирина Александровна — аспирант лаборатории таксономического изучения и коллекции культур микроорганизмов ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва
Громовъх Татьяна Ильинична — д. б. н., профессор кафедры биотехнология ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва
Фельдман Наталия Борисовна — д. б. н., профессор кафедры биотехнологии ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва
Луценко Сергей Викторович — д. б. н., профессор, заведующий кафедрой биотехнологии ФГАОУ ВО Первый
12. Костина Н.Е., Проценко М.А. Сравнение плодового тела и культивируемого мицелия ксилотрофных базидиомицетов. Успехи медицинской микологии. — 2016. — Т. 16. — С. 287—289. / Kostina N.E., Protsenko M.A. Sravnenie plodovogo tela i kul'tiviruemogo mitseliya ksilotrofnykh bazidiomitsetov. Uspekhi Meditsinskoj Mikologii 2016; 16: 287-289. [in Russian]
13. Nimeskern L, Martinez Ä. H, Sundberg J., Gatenholm P., Müller R, Stok K.S. Mechanical evaluation of bacterial nanocellulose as an implant material for ear cartilage replacement. J Mech Behav Biomed 2013; 22: 12-21.
14. Gromovykh T.I., Sadykova V.S., Lutcenko S.V. et al. Bacterial cellulose synthesized by Gluconacetobacter hansenii for medical applications. Prikladnaya Biokhimiya i Mikrobiologiya 2017; 53: 1: 69-75.
МГМУ им. И. M. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва
Пономаренко Валерий Иванович — к. фарм. н., заведующий отдела аспирантуры ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва
Кисиль Ольга Валерьевна — к. х. н., старший научный сотрудник лаборатории химических исследований биологически активных соединений микробного происхождения ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва Садыкова Вера Сергеевна — д. б. н., заместитель директора по научной работе ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва
