CC BY
71
УДК 579.61
В. А. Винокуров (д.х.н., проф.)1, О. В. Попова (к.х.н., с.н.с.)1, А. В. Автономова (к.биол.н., с.н.с.)2, А. В. Барков (к.вт.н., с.н.с.)2, М. И. Шуктуева (м.н.с)2.
Получение липидов базидиальных грибов в погруженной культуре
1 Российский государственный университет нефти и газа им. И. М. Губкина, кафедра физической и коллоидной химии 119991, г. Москва, Ленинский просп., д. 65, корп. 1; тел. (499) 2339589, e-mail: vinok_ac@mail.ru 2Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН, лаборатория биологически активных соединений 119021, г. Москва, ул. Б. Пироговская, д. 11; e-mail: labbas@yandex.ru
V. A. Vinokurov1, O. V. Popova1, A. V. Avtonomova2, A. V. Barkov2, M. I. Shuktueva2
Accumulation of lipids in submerged culture of basidiomycetes
IGubkin Russian State University of Oil and Gas 65, Leninskii Pr., 119991, Moscow, Russia; ph. +7 (499) 2339589, e-mail: guschin.p@mail.ru, vinok_ac@mail.ru 2Gauze Institute of New Antibiotics, Russian Academy of Medical Sciences, II, Bo'shaya Pirogovskaya Str., 119992, Moscow, Russia; ph. (499) 2552391, e-mail: labbas@yandex.ru
Приведены результаты работы по оценке влияния источников питания на накопление в погруженной культуре биомассы и липидов штаммов Agrocybe aegerita, Laetiporus sulphureus, Lentinus edodes. Наибольший выход воздушно-сухой биомассы в неоптимизированных условиях был для A. aegerita — 11.8 г/л , L. sulphu-reus — 8.8 г/л, L. edodes — 7.0. Наибольший выход липидов составил А. аедегЫа — 1.1 г/л, L. sulphureus — 2.5 г/л, L. edodes — 1.5 г/л. Сумма полиненасыщенных жирных кислот в липидных фракциях мицелия трех культур составила 67.9—71.0 %. Основной жирной кислотой в погруженной биомассе всех трех культур была линолевая кислота. Таким образом, перспективным для получения липидов из мицелия является L. sulphureus, штамм Ь8-3.
Ключевые слова: базидиомицеты; АдгосуЬе аедег^а; Laetiporus sulphureus; Lentinus edodes; липиды; ненасыщенные жирные кислоты; погруженное культивирование.
Базидиальные грибы являются перспективными продуцентами целого ряда биологически активных и хозяйственно ценных метаболитов. Наиболее активно изучаются полисахариды клеточной стенки, вторичные метаболиты, ферменты базидиомицетов. Известно, что полисахариды базидиальных грибов обладают иммуномодулирющей, противоопухолевой, противовирусной, гипогликемической, ге-патопротекторной, антиоксидантной и кардио-
Дата поступления 23.09.11
The article presents the results of the influence of sources of carbon and nitrogen on the accumulation of biomass and lipid in submerged culture of strains of Agrocybe aegerita, Laetiporus sulphureus, Lentinus edodes. The highest yield of air-dry biomass in non-optimized conditions was for A. aegerita — 11.8 g/l, L. sulphureus — 8.8 g/l, L. edodes — 7.0 g/l. The highest yield of lipids was A. aegerita — 1.1 g/l, L. sulphureus — 2.5 g/l, L. edodes —1.5 g/l. The amount of polyunsaturated fatty acids in lipid fractions of the three cultures was 67.9—71.0 %. The main fatty acid in the submerged biomass of all three cultures was linoleic acid. Thus, promising to get out of mycelium lipids is L. sulphureus, strain Ls-3.
Key words: basidiomycetes; Agrocybe aegerita; Laetiporus sulphureus; Lentinus edodes; submerged cultivation; lipids; essential fatty acid.
тонизирующей активностью 1-4. Из мицелия и плодовых тел базидиомицетов выделено большое количество вторичных метаболитов, обладающих антибактериальной и противогрибной активностью 5. В гораздо меньшей степени исследователи уделяют внимание липидам бази-диальных грибов. В то же время, липиды обладают огромным потенциалом для различных сфер человеческой деятельности: медицинской, химико-фармацевтической, пищевой, энергетической, лакокрасочной. Основной объем исследований липидов базидиомицетов
проведен с использованием плодовых тел. Однако получение липидов базидиальных грибов для практического применения целесообразно осуществлять в погруженной культуре. В среднем погруженный мицелий ксилотрофных базидиальных грибов содержит 5—10 % липидов 6. В мицелии ЬавИрогш зЫрНыгвт рядом авторов отмечено более высокое содержание липи-дов — 57%, 20—30% 6'7. Для жирнокислотного состава базидиальных грибов характерно преобладание ненасыщенных жирных кислот, в качестве основных ненасыщенных жирных кислот выступают олеиновая или линолевая кислоты 6. Сведений о влиянии условий культивирования на образование липидов базидиоми-цетами в погруженной культуре крайне мало.
Целью работы была сравнительная оценка способности базидиомицетов к образованию липидов в погруженной культуре.
Материалы и методы исследования
В работе были использованы штаммы грибов из коллекции лаборатории биосинтеза биологически активных соединений НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН, относящиеся к видам АдгосуЬв авдв-тИа штамм Аа-1, Ь. зЫркитвш штаммы Ь8-1, -2, -3, ЬвпИпш вйойвз штаммы 4, 12, 15.
Погруженное культивирование осуществляли в колбах 0.5 и 0.75 л на ротационной качалке при 220 об/мин. Температура культивирования составляла 26—28 оС. Среду стерилизовали при 1.2 атм. 30 мин. Среды содержали соли дигидрофосфат калия и сульфат магния и органические источники углерода и азота, такие как глюкоза, сахароза, меласса, обезжиренная соевая мука, пшеничная мука, кукурузная мука, кукурузный экстракт с нитратом натрия. Длительность процесса культивирования 6—7 сут. В процессе культивирования изучали накопление воздушно-сухой биомассы (весовым методом), значения рН культураль-ного фильтрата (на ионометре ЭВ-74). Опыты ставили в двух повторностях. По завершении процесса культивирования мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием через лавсан, промывали дистиллированной водой и сушили до постоянного веса при температуре, не превышающей 50—55 оС.
Полученную воздушно-сухую биомассу, содержание влаги в которой составляет 5—7 %, измельчали и полученный порошок использовали для определения содержания суммарных липидов.
Липиды выделяли по методу Фолча 8 из сухой биомассы. Содержание липидов в мицелии определяли весовым методом.
Выделенный липидный остаток был обработан по ГОСТ Р 51486-99 9 с целью получения метиловых эфиров жирных кислот и далее проанализирован хроматографически согласно ГОСТ Р 51483-99 10. Газожидкостная хроматография проведена на хроматографе AI Cambridge GC 95M с пламенно-ионизационным детектором; капиллярная колонка фирмы Supelco SP-2340 30м x 0.25мм x 0.2мкм/тол-щина жидкого слоя. Температурный режим градиентный 120—200 оС (скорость подъема температуры 4 оС/мин); температура инжектора и детектора 220 оС, газ-носитель — азот. Для калибровки системы использован стандартный образец метиловых эфиров рапсового масла фирмы Supelco (Cat No. 07756-1AMP).
Результаы и их обсуждение
На первом этапе работы был проведен скрининг культур базидиальных грибов с целью поиска липогенных штаммов. Были изучены штаммы видов A. aegerita, L. sulphureus, L. edodes. В погруженных условиях на средах без жиросодержащих источников питания был получен мицелий каждой культуры, оценен выход биомассы и липидов.
Выход воздушно-сухой биомассы изученных штаммов в условиях опыта варьировал от 8.6 до 12.1 г/л, носил штаммоспецифичный характер и не зависел от видовой принадлежности культуры. Содержание суммарных ли-пидов в погруженной биомассе изученных культур базидиомицетов было также различным, носило штаммоспецифический характер и составляло от 3.7 до 14.8 % (табл. 1).
Наиболее высокое содержание суммарных липидов было отмечено в погруженной биомассе L. sulphureus штамм Ls-3 (14.8%) и L. edodes штамм 15 (10.5%). Выход суммарных липидов зависит от двух показателей — содержания липидов в биомассе базидиомицетов и уровня накопления погруженной биомассы. Наиболее перспективными с точки зрения выхода суммарных липидов были следующие культуры: A. aegerita штамм Аа-1, L. sulphureus штамм Ls-3 и L. edodes штамм 15, которые и были отобраны для дальнейшей работы.
Следующим этапом работы являлось изучение влияния состава жидкой питательной среды на образование липидов выбранными культурами базидиальных грибов.
Содержание суммарных липидов в мицелии базидиальных грибов
Культура Шта мм pH кж Выход воздушно-сухой биомассы, г/л Содержание липидов в воздушно-сухой биомассе, % Выход липидов, г/л
А. aegerita Аа-1 7.1 11.8 9.3 1.1
L. sulphureus Т-1 6.4 12.1 4.9 0.6
Т-2 6.9 10.9 3.7 0.4
Т-3 2.5 8.8 14.8 1.3
L.edodes 12 4.0 10.6 4.7 0.5
15 4.0 8.6 10.5 0.9
4 4.1 9.1 8.8 0.8
Таблица 2
Номера и составы жидких питательных сред для погруженного культивирования А. аедегИа штамм Аа-1
Источники кукурузный экстракт соевая мука+ соевая мука+
углерода + нитрат натрия пшеничная мука кукурузная мука
Глюкоза 1 2 3
Глюкоза + сахароза 4 5 6
Меласса 7 8 9
Таблица 3
Выход погруженной биомассы А. аедегИа штамм Аа-1 и содержание в ней суммарных липидов при культивировании на средах с различными источниками углерода и азота
№ Выход воздушно- Содержание липидов Выход
среды сухой биомассы, г/л в биомассе, % липидов, г/л
1 1.4 21.4 0.3
2 6.2 9.7 0.6
3 5.2 15.4 0.8
4 1.9 26.3 0.5
5 3.7 16.2 0.6
6 4.2 19.0 0.8
7 0.1 - —
8 4.1 19.5 0.8
9 6.7 19.4 1.3
Контроль 11.8 9.3 1.1
Примечание: определение содержания липидов в биомассе, полученной на среде №7, не было проведено в связи с ее крайне низким выходом.
Для погруженного культивирования А. аедегИа штамм Аа-1 было выбрано 3 источника углерода (глюкоза, глюкоза+сахароза и меласса) и 3 источника азота (кукурузный экстракт нитрат натрия, смесь соевой муки в сочетании с пшеничной мукой в соотношении 1:1, смесь соевой муки в сочетании с кукурузной мукой в соотношении 1:1). Были составлены композиции 9 питательных жидких сред, представляющие собой все парные сочетания этих источников углерода и азота (табл. 2). В качестве контроля использовали среду, примененную при проведении скрининга. Длительность процесса погруженного культивирования составила 7 сут. Было показано, что выход биомассы зависел от сочетаний источников углерода и азота (табл. 3). Наибольший выход биомассы был отмечен на среде №4 (глюко-
за+сахароза, кукурузный экстракт+нитрат натрия), высокие показатели выхода биомассы показали также среды №№1, 6, 8, 9. Наименьший выход был получен при культивировании А. aegerita штамм Аа-1 на среде № 7 (меласса, кукурузный экстракт+нитрат натрия), полученной биомассы было недостаточно для изучения содержания в ней суммарных липидов. Выход липидов, согласно полученным результатам, в большей степени зависел от источника азота, чем от источника углерода. Перспективными источниками азота явились кукурузный экстракт в сочетании с нитратом натрия и смесь соевой и кукурузной муки в соотношении 1:1. Наибольший выход липидов обеспечивали среда №9, содержащая в своем составе мелассу и смесь соевой и кукурузной муки. По этому показателю среда №9 была
Номера и составы жидких питательных сред для погруженного культивирования Ь. ви/рЬигвив штамм Т-3
Минеральная основа сред: дигидрофосфат калия и сульфат магния
Таблица 5
Выход погруженной биомассы Ь. ви/рЬигвив штамм Т-3 и содержание в ней суммарных липидов при культивировании на средах с различными источниками углерода и азота
Источник Кукурузный экстракт + Соевая Соевая мука +
углерода нитрат натрия мука кукурузная мука
Глюкоза 1 2 -
Сахароза 3 4 5
Меласса 6 7 8
№ Выход воздушно- Содержание липидов Выход
среды сухой биомассы, г/л в биомассе, % липидов, г/л
1 3.8 39.4 1.5
2 6.0 41.6 2.5
3 4.1 37.8 1.6
4 6.2 33.9 1.1
5 7.0 34.3 2.4
6 6.4 21.9 1.4
7 8.7 28.7 2.5
8 8.8 26.1 2.3
эффективнее контрольной среды. Культивирование на средах №№3, 6, 8 приводило к более высокому выходу липидов по сравнению с культивирование на средах №№1, 2, 4, 5 (табл. 3).
Изучение влияния состава среды на образование липидов штаммами L. sulphureus было проведено с использованием трех источников углерода (глюкоза, сахароза, меласса) и трех источников азота (кукурузный экстракт + нитрат натрия, соевая мука и соевая мука в сочетании с кукурузной мукой в соотношении 1:1). В эксперименте было изучено 8 сочетаний этих источников углерода и азота, их номера и составы приведены в табл. 4. Минеральная основа всех сред включала дигидро-фосфат калия и сульфат магния. Длительность процесса погруженного культивирования составила 6 сут. Полученные результаты погруженного культивирования приведены в табл. 5. Лучшие показатели по накоплению погруженной биомассы L. sulphureus были отмечены на средах со следующими сочетаниями источников углерода и азота: меласса и соевая мука (среда №7) — 8.7 г/л, меласса и соевая мука в сочетании с кукурузной мукой (среда №8) — 8.8 г/л. Содержание суммарных липидов в погруженной биомассе в большей степени зависело от источника азота и было наиболее высоким на средах, содержащих кукурузный экстракт в сочетании с глюкозой (среда №1) и с сахарозой (среда №3). Кроме того, высокое содержание суммарных липидов было
получено при культивировании продуцента на среде №2, в состав которой входили глюкоза и соевая мука. Наиболее высокий выход липи-дов был отмечен на всех средах, содержащих соевую муку, за исключением сочетания соевой муки с сахарозой (табл. 5).
Погруженное культивирование L. edodes штамм 15 проводили на средах с различными сочетаниями трех источников углерода (глюкоза, сахароза, и меласса) и трех источников азота (кукурузный экстракт в сочетании с нитратом натрия, соевая мука и смесь соевой и кукурузной муки в сочетании 1:1). Минеральная основа всех сред включала дигидрофосфат калия и сульфат магния. Композиции источников углерода и азота в средах приведены в табл. 6. Длительность процесса погруженного культивирования составила 6 сут. Полученные результаты погруженного культивирования приведены в табл. 7. Было показано, что накопление погруженной биомассы L. edodes определяется преимущественно источником азота. Высокий выход биомассы гриба отмечен на всех средах, содержащих в качестве источника азота соевую муку или ее смесь с кукурузной мукой в соотношении 1:1. Содержание суммарных липидов в погруженной биомассе также зависело от источника азота в жидкой питательной среде. В процентном отношении наибольшее содержание липидов в мицелии получено на средах (среды №№1, 4, 7, 9). Максимальный выход суммарных липидов был отмечен на среде, содержащей мелассу, соевую и
Номера и составы жидких питательных сред для погруженного культивирования Ь. edodes штамм 15
Таблица 7
Выход погруженной биомассы Ь. edodes штамм 15 и содержание в ней суммарных липидов при культивировании на средах с различными источниками углерода и азота
Источник Кукурузный экстракт + Соевая Соевая мука +
углерода нитрат натрия мука кукурузная мука
Глюкоза 1 2 3
Сахароза 4 5 6
Меласса 7 8 9
№ среды Выход воздушно-сухой биомассы, г/л Содержание липидов в биомассе, % Выход липидов, г/л
1 2.1 28.6 0.6
2 5.6 7.1 0.4
3 6.6 9.1 0.6
4 3.5 25.7 0.9
5 5.8 8.6 0.5
6 5.7 12.3 0.7
7 4.2 28.6 1.2
8 7.0 12.8 0.9
9 6.6 22.7 1.5
кукурузную муку, и составил 1.5 г/л. На втором месте по выходу липидов (1.2 г/л) была среда, содержащая мелассу и кукурузный экстракт (табл. 7).
Изучение жирнокислотного состава липидов отобранных культур базидиомицетов, выращенных в колбах на ротационной качалке на средах, обеспечивающих наибольший выход липидов, позволило сделать следующие выводы.
Сумма полиненасыщенных жирных кислот в липидных фракциях из мицелия А. аеде-тИа штамм Аа-1, Ь. зЫркитеш штамм Ь8-3 и Ь. ейвйез штамм 15 была примерно одинакова и составила 71%, 68.3% и 67.9%, соответственно.
Основной жирной кислотой в погруженной биомассе всех трех культур была линоле-вая кислота, имеющая в своей структуре две двойные связи, т.е. являющаяся полиненасыщенной жирной кислотой. На втором и третьем месте среди ненасыщенных жирных кислот в мицелии А. аедетНа штамм Аа-1 и Ь. ейвйез штамм 15 были олеиновая и линоленовая кислоты.
Среди насыщенных жирных кислот больше всего в погруженной биомассе изученных культур было пальмитиновой кислоты.
Полученные экспериментальные данные позволяют считать перспективным для получения липидов из мицелия базидиальных грибов культуру Ь. зифкитеш штамм Ь8-3. Наибольший выход липидов при погруженном культивировании этого объекта в предложенных ус-
ловиях составил 2.5 г/л. Дальнейшие исследования должны быть направлены на оптимизацию количественного состава использованных сред, что, как известно, приводит к значительному повышению выхода целевых продуктов 11,12. Известно, что мукоровые грибы способны обеспечивать выход липидов до 7 г/л 13.
Использование липидов базидиальных грибов может иметь несколько направлений. Состав грибных липидов зачастую сходен с составом растительных масел. Применение грибных липидов может быть сходно с применением растительных масел: в пищевой промышленности в качестве продуктов питания, в энергетической отрасли в качестве биодизельного топлива. Преобладание в составе жирных кислот эссенциальных ненасыщенных жирных кислот ставит грибные липиды в ряд продуктов для лечебного и функционального питания.
Получение грибных липидов в погруженной культуре не имеет связанных с сезонностью ограничений получения растительных масел. Погруженное культивирование в биореакторах можно осуществлять в течение круглого года. При этом максимальный уровень биомассы грибов достигается в сроки меньше недели.
Таким образом, изучение липидов базиди-альных грибов, условия их накопления и регуляции состава, создание эффективных технологий получения липидов является перспективным направлением в микобиотехнологии и в биотехнологии в целом.
Литература
1. Hikino H. and Mizuno T. // Planta Medica.-1989.- V.55.- P.385.
2. Eo S. K., Kim Y. S., Lee C. K., Han S. S. // Journal of Ethnopharmacology.- 1999.- V.68.-P.175.
3. Wasser S. P. // Appl Microbiol Biotechnol.-2002.- V.60.- P.258.
4. Han H. F.,Nakamura N., Hattori M. // Journal of Natural Medicines.- 2006.- V.60.- P.295-302.
5. Schuffler A., Anke T. Secondary Metabolites of Basidiomycetes. In: The Mycota. XV. Physiology and Genetics, ed. by Esser K. Springer Berlin Heidelberg, 2009.- P. 209.
6. Гвоздкова Т. С., Щерба В. В., Черноок Т. В., Филимонова Т. В., Рожкова 3. А., Осадчая О. В., Смирнов Д. А., Бабицкая В. Г. // В сб. Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты.- Минск, Изд. И. П. Логвинов, 2007.- Т.1.- С.88.
7. Шиврина А. Н., Низковская О. П., Фалина Н. Н., Маттисон Н. Л., Ефименко О. М. Биосинтетическая деятельность высших грибов.- Л.: Наука, 1969.- 243 с.
8. Folch J., Lees M., Stanley G.H.S. //J. Biol. Chem.- 1957. V.226.- P.497.
9. ГОСТ Р 51486-99 «Масла растительные и жиры животные. Получение метиловых эфиров жирных кислот».
10. ГОСТ Р 51483-99 «Масла растительные и жиры животные. Определение методом газовой хроматографии массовой доли метиловых эфиров индивидуальных жирных кислот к их сумме».
11. Автономова А. В., Краснопольская Л. М., Максимов В. Н. // Микробиология.- 2006.-Т.75б, №2.- С.186.
12. Krasnopolskaya L., Leontieva M., Avtonomova A., Isakova E., Belitskii I. V., Usov A. I., Buchman V. M. // Int. J. of Medicinal Mushrooms.- 2008.-V.10.- №1.- P.25.
13. Сергеева Я. Э., Галанина Л. А., Андрианова Д. А., Феофилова Е. П. // Прикладная биохимия и микробиология.- 2008.- Т.44, №5.- С.576.
Исследование проводится в рамках Федеральных целевых программ «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009—2013 годы» и «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2013 годы».
