CC BY
34УДК 615.076:591.145.2:582.284
ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММА LS 1-06 LAETIPORUS SULPHUREUS (BULL.) MURRIL L. И ОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
1 Громовых Т.И. (профессор)*, 1 Иванова И.Е. (аспирант), 2 Шнырева А.В. (профессор), 3 Барсегян Г.Г. (в.н.с.), 1Данильчук Т.Н. (докторант), 3 Левин М.А. (в.н.с.)
1 ФГБОУ ВПО Московский государственный университет пищевых производств; 2 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; 3 ГБУЗ г. Москвы «Московский НИИ здравоохранения и медицинской экологии департамента здравоохранения г. Москвы», Москва, Россия
© Коллектив авторов, 2013
В статье рассмотрены результаты по изучению микроморфологических особенностей штамма Ls 1-06Laetiporus sp. и его генетической оценки принадлежности к виду Laetiporus sulphureus. Приведены результаты оценки токсичности мицелия штамма. Установлено, что водные и спиртовые экстракты штамма L. sulphureus Ls 1-06 не обладают токсичным действием на жизнедеятельность простейших инфузорий Paramecium caudatum и Tetrahymena pyriformis. Результатами по изучению острого токсического эффекта на экспериментальных животных (крысах) подтверждено его отсутствие, что позволяет отнести экстракты биомассы штамма L. sulphureus Ls 1-06 к V классу токсичности веществ, т.е. к нетоксичным.
Ключевые слова: грибы, Laetiporus sulphureus, мицелий, тестирование на токсичность, токсичность
INVESTIGATION OF THE TOXIC PROPERTIES OF STRAIN LS 1-06 LAETIPORUS SULPHUREUS (BULL.) MURRIL L. AND EVALUATION OF ITS USE PERSPECTIVES
1 Gromovykh Т.К (professor), 1 Ivanova !.Е. (postgraduate student), 2 Shnyrjova А.^ (professor), 3 Bargesjan G.G. (leading scientific collaborator), 1Danilchuk ^N.
* Контактное лицо: Громовых Татьяна Ильинична, e-mail: tigromovykh@rambler.ru
(candidate for PhD rank), 3Levin M^. (leading scientific collaborator)
1Moscow State University of Food Production; 2M.V. Lomonosov Moscow State University; 3Moscow Scientific Institute of Health and Medical Ecology of Moscow Department of Health, Moscow, Russia
© Collective of authors, 2013
We consider in this article the results of the study of micromorpho-logical features of strain Ls 1-06 Laetiporus sp. and its genetic evaluation of belonging to species Laetiporus sulphureus. The results of evalu-tion of the strain mycelium toxicity have been showed. It is established that the aqueous and ethanol extracts of the mycelium strain L. sulphureus Ls 1-06 do not have toxic effects on the life of the simplest cili-ates Paramecium caudatum and Tetrahymena pyriformis. The results of study of acute toxicity in experimental animals (rats) confirmed the absence and allow to relate biomass extracts of strain L. sulphureus Ls 1-06 to Class Vtoxicity of substances, that is non-toxic.
Key words: fungi, Laetiporus sulphureus, mycelium, testing for toxicity, toxicity
В настоящее время необходимы новые ресурсы лекарственных препаратов и антибиотиков. Одним из направлений поиска новых природных биологически активных соединений является использование мицелия и плодовых тел различных видов базиди-альных грибов. Одним из перспективных в этом направлении является вид Laetiporus sulphureus - сер-но-желтый трутовик, плодовые тела которого уже давно применяют в народной медицине в качестве лекарственного средства, обладающего антисептическими свойствами [1-4]. Известно, что не только плодовые тела, но и мицелий штаммов этого вида имеют в составе биологически активные соединения. В результате исследований Тихоновой О.В., Ершовой Е.Ю. и др. (2001 г.) показано, что при поверхностном и глубинном культивировании штаммы L. sulphureus проявляют антибиотическую активность в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, но не оказывают действия в отношении патогенных грибов [2].
Другие авторы выявили антимикробную [1, 3], антиоксидантную [5, 6] противоопухолевую [7, 8] и противовирусную [9] активности у штаммов L. sulphureus. Исследователи связывают антимикробные свойства с образованием и выделением в культу-ральную жидкость штаммами L. sulphureus органических кислот, а антиоксидантные, противовирусные и противоопухолевые - с биосинтезом каротиноид-ных соединений.
Доказано, что этанольные экстракты мицелия L. sulphureus, выращенного в глубинной культуре, обладают антиоксидантными свойствами [6]. Антиокислительная активность липокаротиноидного экстракта мицелия L. sulphureus была подтверждена и в экспериментах in vivo теми же исследователями. Радиозащитное и антиоксидантное действие одни авторы связывают, скорее всего, с присутствием в мицелии L. sulphureus липофильных биоантиоксидантов ка-ротиноидной природы [10], другие - с присутствие в мицелии данного вида экзополисахаридов [11, 12].
По сравнению с каротинообразующими дрожжами и микромицетами, базидиальный ксилотроф L. sulphureus обладает определенными преимуществами. Растущая популярность вида L. sulphureus делает актуальной разработку технологии его выращивания с использованием сырьевой базы и отходов растениеводства.
Несмотря на то, что общий объем публикаций, посвященных базидиомицету L. sulphureus, чрезвычайно велик, все сведения относятся только к представителям вида, паразитирующим на лиственных породах деревьев. Подобная информация о штаммах, поражающих древостои хвойных, практически отсутствует. Известно лишь, что они распространены, в основном, в Северной Америке, некоторых странах Европы и обладают токсичными свойствами. Кроме того, в настоящее время все исследования штаммов, изолированных из древостоев хвойных, проводили только в Северной Америке. Установлено, что выделенные с хвойных растений изоляты относятся к виду Laetiporus conifericola [13]. Известно, что данный вид распространен в Северной Америке - от Калифорнии до Аляски, развивается часто на красной пихте, кедрах, также как и L. sulphureus, вызывая бурую гниль как живых, так и уже мертвых деревьев.
Однако на сегодняшний день нет источников с информацией о свойствах и составе штаммов, паразитирующих на хвойных породах на территории России, как нет достоверного подтверждения, к какому виду относить такие штаммы, и действительно ли они токсичны? Это обосновывает необходимость исследования изолятов рода Laetiporus, выделенных с хвойных древостоев: подтверждения или опровержения их принадлежности к виду, изучению их биологически активных свойств и токсичности.
В период с 2006 г. были выделены штаммы из плодовых тел пораженных хвойных древостоев Республики Тыва. В результате изучения культуральных признаков, биологической активности и продуктивности был отобран наиболее продуктивный штамм Ьз 1-06, способный к биосинтезу каротиноидов и белка, в составе которого имеется большое количество незаменимых аминокислот [14]. Штамм L. sulphureus Ьз 1-06 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов как продуцент белка и каротиноидов (ВКПМ Б-982). Однако для его использования в качестве продуцента биологически активных соединений, пищевых и кормовых добавок требовалось проведение идентификации и исследования биологической активности и токсичности штамма.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Определение видовой принадлежности.
Видовую принадлежность определяли на основании морфологических признаков плодовых тел, описывавшихся при сборе грибов, спор и морфоло-го-культуральных признаков (тип колоний, характер
роста, цвет мицелия, запах, наличие экзопигмента), для чего мицелий наращивали на капустном агаре (200 г капусты, 2% агара, 2% глюкозы).
Результаты всех исследований были сопоставлены с данными в определителе [15]. Видовую принадлежность подтверждали молекулярно-генетиче-скими исследованиями. Изучали участок ядерной рДНК, содержащий транскрибируемый спейсерный участок ITS. Хроматограммы, полученные после сик-венирования, анализировали с помощью программы Chromas_Pro_Sequens_Scanner. Поиск гомологичных последовательностей в Генбанке осуществляли с применением программы BLAST (www.ncbi.nih.gov).
Изучение микроморфологических свойств штаммов.
Микроморфологические особенности штамма исследовали в живом состоянии путем выращивания культуры гриба в камерах Ван-Тигема. Для этого на стерильное предметное стекло фиксировали камеру Ван-Тигема, в центр которой наносили каплю расплавленного питательного сусло-агара. После застывания среды, в центр капли иглой вносили посевной материал и сверху накрывали покровным стеклом, предварительно смазанным вазелином. Камеры с посевами помещали в стерильные чашки Петри и инкубировали при 25±1 °С. Каждые вторые сутки культивирования наблюдали за микроморфологией при помощи светового микроскопа марки LWScientific (США).
Люминесцентную микроскопию применяли для окрашивания ядерного вещества. Материал для исследования готовили следующим образом: наросший на покровные стекла 7, 14 и 21-суточный мицелий фиксировали в модифицированном растворе Карнуа с последующим окрашиванием реактивом ДАПИ (4,6-диамидино-2-фенилиндол, SIGMA) в концентрации 500 нг/мл; в работе использовали микроскоп Axioskop 40 FL, фильтр 02 (Zeiss).
Сканирующую электронную микроскопию проводили для изучения морфологии конидий и мицелия. Для чего агаровые блоки с наросшим 7, 14 и 21-суточ-ным мицелием фиксировали в парах осмия. После высушивания образцы закрепляли, напыляли смесь платины и палладия (IB-3 IonCoater) и просматривали с помощью сканирующего электронного микроскопа «Hitachi» S-405A в лаборатории электронной микроскопии МГУ им. М.В. Ломоносова.
Исследование токсичности экстрактов мицелия на простейших.
Для оценки токсичности мицелий наращивали на капустной среде в колбах Эрленмейера на качалке в режиме 150 об/мин, затем высушивали в сушильном шкафу при 40 °С в течение 3 суток. Высушенную биомассу измельчали и проводили водную горячую экстракцию и этанольную экстракцию [15].
Водные экстракты из биомассы мицелия получали путем смешивания дистиллированной воды и измельченной биомассы при 60 ±1 °С встряхиванием на качалке в режиме 120 об./мин в течение пяти часов.
Соотношение исследуемого образца к экстрагенту составляло 1:30 соответственно. Спиртовые экстракты получали путем экстрагирования образца 96%-м этанолом с соотношением образца к экстрагенту - 1:10. Для исследований на инфузориях полученный экстракт доводили до концентрации спирта 1%.
На первом этапе оценивали выживаемость тест-объектов инфузорий Paramecium caudatum в водных экстрактах мицелия и культуральных фильтратах. Культуру тест-организма - P. caudatum готовили с титром не менее 500-100 клеток/мл в чашке Петри путем выращивания на среде Лозина-Лозинского [16]. Первый этап биотестирования на инфузориях P caudatum осуществляли в соответствии с техническим описанием с помощью прибора БиоЛаТ-3, компьютера с программой AutoCiliataXP, разработанной автором Черемных Е.Г. Оценку токсичности по первому этапу биотестирования проводили на основании критериев, указанных в таблице 1 [17].
Расчет коэффициента токсичности К1 выполняли по формуле:
Nl ,
где N1 - количество живых инфузорий после экспозиции в пробе; N2 - количество живых инфузорий
до начала опыта.
Таблица 1
Критерии оценки токсичности на P. caudatum
Коэффициент выживаемости P. caudatum, К1 Оценка токсичности
Тест-культуры водного экстракта
>=0,9 Нетоксичная проба
<= 0,50 Токсичная проба
Все остальные варианты значений коэффициента выживаемости учитываются при вычислении комплексной оценки после второго и третьего этапов
На втором этапе проводили оценку токсичности на тест-объектах Tetrahymena pyriformis. Для этого наращивали культуру на среде Лозина-Лозинского в течение от 3 до 14 суток с титром не менее 5-104±103 клеток/мл. Исследуемые пробы помещали во флаконы, в которые вносили по 10 мкл культуры инфузорий Т. pyriformis. Инфузории культивировали в течение 24 час. В качестве контроля использовали исходную питательную среду для инфузорий без добавления фильтратов и экстрактов. Заключение производили на основе критериев, указанных в таблице 2, вычисленных по формулам 2 и 3:
Л ] * Л",,,,.,,
N I контр
Л. контр — -
1V 2контр
где К1контр - количество инфузорий до начала экспозиции в пробе и контроле, Ы2, К2контр - количество живых инфузорий по окончании второго этапа опыта [17].
Таблица 2
Критерии оценки степени токсичности водного экстракта тест-культуры на инфузории Т. pyriformis
Коэффициент прироста инфузорий T. pyriformis за 24 ч экспозиции, К2 Оценка степени токсичности или решение о продолжении исследования
>=0,9 >=0,9 объект нетоксичен
<=0,5 <=0,5 объект токсичен
Примечание: Все остальные варианты значений коэффициента прироста учитываются при вычислении комплексной оценки после третьего этапа
Изучение острой токсичности образцов мицелия на крысах.
Для исследований использовали особей обоих полов линии белых крыс Wistar. Определяли величину средне-смертельной дозы (ЛД50) в условиях дробного многократного внутрижелудочного введения водного экстракта мицелия штамма, полученного в воде при нагреве и ультразвуковой обработке суспензии. Экстракт вводили каждой особи в объеме 2,0 мл многократно через каждый час. Внутрижелу-дочное введение крысам испытуемого насыщенного раствора в пересчете на суммарную дозу составляло 7 г/кг.
Оценку результатов действия экстрактов проводили по следующим показателям: поведение животных, выживаемость, изменение массы тела крыс, массовый индекс органов (по данным некропсии).
Результаты исследований идентификации штамма Lsl-06.
При изучении микроморфологии штамма обнаружили, что мицелий имеет оранжево-розовый цвет, состоит из длинных гиф с простым ветвлением, без образования пряжек, также отмечали образование овальных, шарообразных и грушевидных структур, расположенных на гифах терминально или интерка-лярно. При окраске ядер выявили, что мицелий ди-кариофитный, ядра расположены тесно друг к другу (Рис. 1).
А
В
Рис. 1. Микроморфология штамма Lsl-06 Laetiporus sp.: А - морфология колонии на питательном капустном агаре; Б - окраска ядер, В - морфология мицелия (сканирующая электронная микроскопия мицелия)
При изучении микроморфологии в режиме световой микроскопии было установлено, что мицелий штамма Laetiporus sp. имеет гифы различного диаметра (от 3,5 до 6,5 мкм). Шарообразные структуры воздушного мицелия являются хламидоспорами, а грушевидные структуры субстратного мицелия - бластоконидиями, которые на мицелии формиру-
ются апикально (Рис. 2). На основании микроморфологических и культуральных признаков штаммов на агаризованных средах выявили их сходство с видом L. sulphureus.
При исследовании генетической принадлежности штаммов сиквенированием вариабельных участков ITS рДНК подтверждена степень сходства с видом L. sulphureus на 99%.
Последовательность ITS рДНК вариабельных участков штамма 1-06 представлена ниже:
GAAAAANGGGGTCGCCCCTNG TCACAACAC ACCCCTGNTGCACGTTGAAGGCCCGGCTCGTT GAGTGGGTGGGCGACCGCCCAGGATTCGTAGC CTCGCTTTCTTACACAAACTTCGGAATGTACAT CAGAATGTCTTACGCGTGTAACGCATCGTAATAT AACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAAT GTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCT TTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGCATTCCGAG GAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAACTCTCA ACCCCTGCCATCTTTGCGGATGAGCGTCGGTTG GATTTTGGAGGTTGCCGGACTCGTTCGGCTCCT CTTGAAAGCATAGTGAAGCTTGGACCTGACCGA CCGAGTGGACGTGATAGAAAGTCACCGTCGACT GAAGGGTCCGTCGTTGAACGGTTCAAGCTTTGT TTCATCGTCTTCGGACGAAACATCTCTGACCTC TGACCTCAAATCAGGTAG GAC TACCCG C TGAAC TTAAG CATATCAATAAGCCGGAG GAA
Таким образом, было установлено, что штамм, выделенный из плодового тела, паразитирующего на Larix sibirica L., принадлежит к виду Laetiporus sulphureus. В связи с чем, утверждение авторов Бурдсала Ж. и Банника М. о том, что на древостоях хвойных паразитирует только вид L. conifericola неправомочно, так как полученные нами данные этому противоречат.
При исследовании токсичности водных экстрактов мицелия штамма Ls 1-06 на простейших P. caudatum выявили, что они не являются токсичными при соотношении экстракт: вода - 1:5 (табл. 3). Коэффициент выживаемости клеток P. caudatum составил не менее 1,0, что свидетельствует о нетоксичности такой концентрации экстракта. Спиртовые экстракты мицелия штамма Ls 1-06 L. sulphureus (1% этанол)
Рис. 2. Микроморфология мицелия штамма Lsl-06 Laetiporus sp. (указано стрелками): А - утолщение клетки мицелия при образовании хламидоспор; Б - вздутия в мицелии при образовании бластоконидий
нетоксичны при исходном концентрации исследуемого экстракта для Р. оаиёаЬит.
Таблица 3.
Влияние экстрактов мицелия штамма ¿. $и!рНигеи$ на коэффициент выживаемости Р. саидМит
Самки
Разведение исходного экстракта
Исх. экстракт
1:1
1:5 I 1:10
Концентрация сухого вещества в исходном водном экстракте мицелия , 0,33±0,01%
штамм Ls 1-06 0,3 0,3 1,0 1,5
Контроль вода 2,24
Концентрация сухого вещества в исходном водном экстракте, 0,019±0,001%
штамм Ls 1-06
К1 выживаемости клеток в спиртовых экстрактах мицелия
штамм Ls 1-06 3,15 1 3,17 2,90 I -
Контроль 1% спирт 1,82
При оценке на простейших ТеЬгакутепа руп/огт18 установили, что экстракты штаммов не обладают токсичным действием на культуру простейших Т. руп/огт1з, т.к. имеет место прирост клеток через 24 часа (табл. 4). По коэффициенту прироста Т. руп/огт18, который составил 13 - для водных экстрактов и 11 - для спиртовых, можно утверждать об их биологической активности, влияющей на жизнеспособность инфузорий.
Таблица 4.
Влияние экстракта мицелия штамма Ls 1-06 I. $и!рНигеи$ на численность культуры Т. pyriformis
Штамм Кол-во исходных, клеток/ 300 мкл Кол-во клеток через 24 ч, клеток /300 мкл Коэффициент прироста
Водный экстракт
Ls1-06 109 1010 13
Спиртовой экстракт
Ls1-06 104 1190 11
Вода (контроль) 102 216 2
1% спирт (контроль) 90 182 2
Многократное введение экстракта Ls 1-06 1. зирЬигеш
Доза, г/кг 4,0 5,0 6,0 7,0 Расчетные показатели токсичности (г/кг)
Самцы
Эффект: пало/ всего 0/10 0/10 0/10 0/10 ЛД50>7,0 г/кг
Эффект: пало/ всего
0/10
0/10
0/10
0/10
Однократное контрольное введение физ.раствора
ЛД50>7,0 г/кг
Доза, 8 мл/крыса 5,0 Расчетные показатели токсичности (мг/крыса)
Самцы
Эффект, пало/ всего 0/7 Нет павших
Самки
Эффект, пало/ всего
0/7
Нет павших
На 2-е, 7-е и 14-е сутки животных взвешивали и определяли влияние экстракта мицелия штамма Ьз 1-06 Ь. 8и1ркигвш на состояние, поведение, динамику изменения массы тела крыс (табл. 6). Выявили, что животные переносили введённые количества веществ хорошо, без выраженных токсических проявлений, как в период введения, так и на протяжении 14 суток последующих наблюдений.
Таблица 6.
Изменение массы тела крыс после однократного внутрижелудочного (в/ж) введения испытуемых препаратов
Препарат, доза
Изменение массы тела, %
2 сут. 7 сут. 14 сут.
Внутрижелудочное введение экстракта мицелия штамма Ls 1-06 1. зи!рЬигеиз
5 г/кг, самцы (п=10) 101,8 107,6 110,9
5г/кг, самки (п=10) 103,5 109,3 116,0
7г/кг, самцы(п=10) 102,7 107,8 113,3
7г/кг, самки (п=10) 103,3 109,1 117,2
Контрольное внутрижелудочное введение физиологического раствора
8 мл, самцы (п=7) 103,5 108,0 112,0
8 мл, самки (п=7) 104,5 109,5 115,8
Таким образом, при изучении экстрактов штамма Ь.з 1-06 Ь. зи1ркигеш выявили, что они не вызывают токсического эффекта в отношении простейших. Результаты оценки токсичности на крысах. Многократное дробное внутрижелудочное введение крысам экстракта мицелия штамма Ьз 1-06 Ь. зиркигеш во всех испытанных дозах (4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг), в том числе -максимальной дозе -7,0 г/кг, на протяжении всего периода наблюдений не сопровождалось летальностью вне зависимости от пола животных (табл. 5).
Таблица 5
Влияние экстракта мицелия штамма Ls 1-06 I. $и!рНигеи$ на выживаемость белых крыс Wistar после многократного дробного внутрижелудочного введения
Поведение и состояние животных опытных и контрольных групп не различались. При анализе полученных данных, по которым определяли динамику изменения массы тела, наблюдали положительную динамику роста массы тела у крыс во всех испытуемых группах. Достоверных различий в динамике массы тела в группах животных, получавших раствор экстракта мицелия штамма Ьз 1-06 Ь. 8и1ркигеш, не выявили, кроме того, она практически не отличалась от показателей в контрольной группе.
После заключительного взвешивания, животных подвергали эвтаназии и производили вскрытие, мор-фометрический анализ органов и тканей, вычисляли массовые коэффициенты крыс опытных и контрольных групп (табл. 7).
Таблица 7.
Массовые индексы органов белых крыс после внутрижелудочного введения экстракта мицелия штамма Ls 1-06 I. su!phureus (М ± m)
Группы и дозы (г/кг)
Органы Экстракт мицелия штамма Ls 1-06 1. зи!рЬигеиз Контроль физ.раствор
5 г/кг 7г/кг 8 мл/кг
сГ 9 С? 9 С? 9
Сердце 3,85 ±0,1 3,73±0,1 3,91±0,1 3,78±0,1 3,85±0,1 3,61±0,05
Легкие с трахеей 9,32±0,3 9,03±0,2 9,04±0,1 8,85±0,3 9,13±0,1 8,87±0,5
Тимус 1,41±0,09 1,49±0,07 1,47±0,08 1,39±0,08 1,37±0,11 1,32±0,08
Печень 41,7±1,3 39,9±2,1 40,9±2,7 38,8±2,4 39,7±0,9 39,1±2,5
Селезенка 6,1±0,3 6,2±0,4 5,9±0,5 6,0±0,3 6,3±0,5 6,1±0,3
Почка (лев) 4,2±0,1 4,2±0,1 4,2±0,1 4,4±0,2 4,1±0,1 4,3±0,2
Надпочечник (лев) 0,18±0,03 0,20±0,03 0,21±0,05 0,23±0,02 0,17±0,05 0,20±0,03
Головной мозг 7,25±0,02 7,33±0,09 7,47±0,11 7,38±0,15 7,26±0,10 7,22±0,13
Яички/ яичники 13,4±0,21 0,65±0,06 14,2±0,3 0,72±0,08 14,0±0,3 0,78±0,09
Результаты вскрытия (некропсии) крыс.
На вскрытии крыс, умерщвленных в конце токси-кометрического эксперимента (через 14 суток), а также на вскрытии контрольных животных, умерщвленных в тот же срок, различий не установлено. Крысы правильного телосложения, удовлетворительной упитанности. Состояние волосяного и кожного покровов нормальное. Шерсть - блестящая, опрятного вида, без очагов облысения.
При осмотре грудной и брюшной полостей нарушений в расположении внутренних органов не отмечали. Желудок имел обычную форму и размеры, просвет заполнен плотным пищевым содержимым. Слизистая оболочка тела желудка - бледно-розовая, блестящая, складчатая, без раздражений, а тонкой и толстой кишок -блестящая, гладкая.
Подчелюстные лимфатические узлы и слюнные железы имели овальную или округлую форму, однородный розоватый или желтоватый цвет и умеренную плотность.
Щитовидная железа плотно прилежала к гортани, имела обычные размеры и плотность, розовато-красноватый цвет. Тимус - треугольной формы, беловатого цвета и умеренно плотной консистенции.
Величина и форма сердца изменений не представляли. Мышца сердца - коричневатая, плотная. Поверхность легких бледно-розовой окраски; легкие спадались при вскрытии грудной клетки. Ткань на разрезе также имела однородную бледно-розовую окраску. Слизистая оболочка внелегочных бронхов - гладкая, блестящая, бледно-розовая. Величина и форма печени без изменений. Капсула печени была тонкой, прозрачной. Ткань печени имела коричневатый цвет и умеренно плотную консистенцию. Поджелудочная железа - бледно-розовая, дольчатая.
Величина и форма почек не отличались от таковых в контроле, капсула легко снималась. Поверхность органа - гладкая, однородной коричневато-сероватой окраски. На разрезе почек отчетливо различались корковое и мозговое вещества. Форма, размеры и плотность надпочечников, яичников или яичек были такими же, как в контроле.
Селезенка имела темно-вишневый цвет, гладкую поверхность и плотноватую консистенцию. Оболочки головного мозга - тонкие, прозрачные. Вещество
головного мозга умеренной плотности. Расширения желудочков мозга не наблюдали.
Таким образом, по данным вскрытия и макроскопического исследования, однократное внутрижелу-дочное введение экстрактов мицелия штамма Ls 1-06 L. sulphureus в исследованных дозах белым крысам Wistar обоих полов не вызывает макроскопических изменений внутренних и эндокринных органов, головного мозга, а также слизистой оболочки желудка, кишечника, кожи, подкожной клетчатки и мышц.
При оценке показателя массового индекса органов у крыс обоих полов также выявили отсутствие достоверных различий при введении экстрактов мицелия и физиологического раствора (табл. 7).
Из приведённых в таблице 7 данных следует, что достоверных отличий массовых индексов органов крыс, получавших экстракт мицелия штамма Ls 1-06 L. sulphureus в разных дозах, от показателей массовых индексов в соответствующих контрольных группах нет. При испытании экстрактов мицелия штамма Ls 1-06 L. sulphureus показано, что многократное внутрижелудочное дробное введение крысам обоих полов в объёме, многократно превышающем максимальный разовый объём, рекомендованный для данного вида, в максимальной дозе 7 г/кг не сопровождалось летальностью, не вызывало существенных изменений общего состояния и поведения животных.
Результаты определения острого токсического действия, данные наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 14 суток после острого внутрижелудочного введения, а также данные вскрытия и морфометрического анализа являются основанием для отнесения экстракта мицелия штамма к V классу практически нетоксичных веществ, для которых значение средне-смертельной дозы, находится в пределах 5000 г < ЛД50< 15000 г (по Hodgeetal H. «Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning». Ed. IV, Baltimore, 1975; Сидоров K.K., 1977). В пересчёте на человека, по правилам межвидового переноса, полученная величина составит около 1,17 г/кг, т.е. по выявленным данным, для человека весом 70 кг безопасно потребление 81,7 г препарата мицелия одномоментно.
Из результатов проведенных исследований следует, что штамм Ls 1-06, выделенный из древостоев хвойных, относится к виду L. sulphureus, который используют как источник пищевых ресурсов. Биомасса мицелия штамма не является токсичной, что служит основанием для применения её в качестве продуцента биологически активных веществ и пищевых добавок.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Ефременкова О.В., Тихонова О.В., Ершова Е.Ю. и др. Антимикробные свойства базидиального гриба Laetiporus sulpureus в условиях глубинного культивирования // Успехи медицинской микологии. - 2006. - Т. 7. - С. 280-282.
2. Тихонова О.В., ЛурьеЛ.М., Ершова Е.Ю. и др. Изучение глубинной культуры Laetiporus sulphureus (Fr) Bond, et Sing. - М.: Национальная академия микологии. - 2002. - С. 257.
3. Turkoglu A., Duru M.E., Mercan N., et al. Antioxidant and antimicrobial activities of Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill
// Food Chemistry. - 2007 - Vol. 101, №1. - P. 267-273.
4. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская А. С. Достижения и проблемы новой области биотехнологии: получение медицинских препаратов на основе биологически активных веществ мицелиальных грибов // Успехи медицинской микологии. - 2001. - Т. 1. - С. 254-256.
5. Ким И.В. Антиоксидантная активность ЗЦМ // Молочная промышленность. - 2011. - №4. - С. 81.
6. Капич А.Н., Гвоздкова Т.С., Квачева З.Б. и др. Антиоксидантные, радиозащитные и противовирусные свойства экстрактов мицелия гриба Laetiporus sulphureus в условиях глубинного культивирования // Успехи медицинской микологии. - 2004. - Т. 3. - С. 146-148.
7. Теплякова Т.В., Косогова Т.А., Мазуркова Н.А. и др. Ингибитор репродукции вируса гриппа А на основе экстракта базидиального гриба Laetiporus sulphureus. Патент № 2475530 С2 РФ. № 2011110826/10. Заявлено 22.03.2011. опубл. 20.02.2013 г. Бюлл. № 12. - 11 с.
8. YoshikawaK., Bando S., Arihara S., et al. Benzofuran glycoside and acetylenic acid from the fungus Laetiporus sulphureus var. miniatus// A Chem Pharm. Bull. - 2001. - №.3. - P. 327-329.
9. Квачева З.Б., Капич А.Н., Вотяков В.И., Николаева С.Н. Противовирусная активность экстрактов мицелия базидиального гиба Laetiporus sulphureus //Успехи медицинской микологии. - 2005. - Т. 5. - С. 272-274.
10. Капич А.Н. Новый метод определения антиоксидантной активности // Успехи медицинской микологии. 2006. - Т. 7. - С. 243-245.
11. Daba A.S., Ezeronye O.U. Anti-cancer effect of polysaccharides isolated from higher basidiomycetes mushrooms // African J. of Biotechnol.- 2003. - Vol. 2. - P. 672-678.
12. Hwang H.S., Hak Lee Sung, Yu Mi Baek. Production of extracellular polysaccharides by submerged mycelial culture of Laetiporus sulphureus var. miniatus and their insulinotropic properties// Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2008. - Р. 419429.
13. Linder D.L., Banik M.T. Molecular phylogeny of Laetiporus and other brown rot polypore genera in North America // Mycologia. - 2008.- Vol. 100, №3. - P. 417-430.
14. Громовых Т.И., Иванова И.Е., Торкова А.А. Культивирование мицелия штаммов Laetiporus sulphureus для получения кормовой добавки для птиц // Вестник РАСХН. - 2012. - №6. - С. 53-55.
15. Ушанова В.М., Ченцова Л.И., Шайхутдинова М.Н. и др. Массообменные процессы: учеб. пособие. -Красноярск, 2004. - Ч. 1. - 207 с.
16. Черемных Е.Г., Симбирева Е.И. Инфузории пробуют пищу // Химия жизни. - 2009. - №1. - С. 28-31.
17. Черемных Е.Г. Применение в токсикологических исследованиях автоматического прибора биотестирования // Партнеры и конкуренты. - 2003. - №11.
Поступила в редакцию журнала 15.09.2013
Рецензент: Т.В. Теплякова
