CC BY
17УДК 615.076:620.193.82
АНТИФУНГААЬНАЯ АКТИВНОСТЬ «СТРОИТЕЛЬНЫХ БИОЦИДОВ» В ОТНОШЕНИИ STACHYBOTRYS SPP.
Доршакова Е.В. (н.с.)*, Павлова И.Э. (н.с.)/ Блинов Н.П. (проф. кафедры), Богомолова Т.С. (зав. лаб.), Чилина Г.А. (зав. лаб.), Выборнова И.В. (н.с.), Босак И.А. (врач-лабораторный миколог), Васильева Н.В. (директор института)
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина и кафедра медицинской микробиологии, Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2013
Изучена и оценена эффективность действия имеющихся в продаже «строительных биоцидов» в отношении токсинообра-зующих микромицетов-биодеструкторов из рода Stachybotrys. Изучены штаммные различия чувствительности Stachybotrys spp. к исследуемым биоцидам.
Ключевые слова: биодеструкция, биоциды, фунгистатическое действие, фунгицидное действие
ANTIFUNGAL ACTIVITY OF «CONSTRUCTION BIOCIDES» CONCERNING STACHYBOTRYS SPP
Dorshakova E.V. (junior scientific collaborator), Pavlova I.E. (scientific collaborator), Elinov N.P. (professor of the chair), Bogomolova T.S. (head of the laboratory), Chilina G.A. (head of the laboratory), Vybornova I.V. (scientific collaborator), Bosak I.A. (physician -laboratory mycologist), Vasilyeva N.V. (director of institute)
North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov: Kashkin Research Institute of Medical Mycology and Chair of Medical Microbiology, St. Petersburg, Russia
©Collective of authors, 2013
Efficiency of action of commercially available «building biocides» concerning of toxigenic micromycetes-biodestruktors of the genus
* Контактное лицо: Доршакова Евгения Владимировна, Тел.: (812) 303-51-40
Stachybotrys have been studied and estimated. Strains distinctions of sensitivity of Stachybotrys spp. to tested biocides were studied.
Key words: biocides, biodestruction, fungistatic action, fungicide action
ВВЕДЕНИЕ
Stachybotrys spp., способные синтезировать микотоксины, представляют опасность для здоровья людей. Наиболее токсичными являются макроци-клические трихотеценовые микотоксины, оказывающие на организм цитотоксическое, нейротоксиче-ское действия [1-7]. Штаммы Stachybotrys chartarum, продуцирующие макроциклические трихотецены, были отнесены к группе «хемотипа S» [8]. Штаммы S. chartarum, неспособные к синтезу макроцикличе-ских трихотеценов, продуцирующие простые трихотеценовые микотоксины (триходермин, триходер-мол), а также атраноны, были отнесены в группу «хемотипа А». Было обнаружено, что S. chlorochalonata имеет сходный спектр метаболитов с микромицета-ми «хемотипа А» S. chartarum [8,9].
Stachybotrys spp. обладают целлюлазолитической активностью, широко распространены в природе и антропогенной среде. Умеренный климат и повышенная влажность в Санкт-Петербурге благоприятствуют росту биомассы микромицетов в почве, а также контаминации микобиотой стен зданий [10-12]. На сегодняшний день имеет место необходимость борьбы с микромицетами рода Stachybotrys в связи с их негативным воздействием на здоровье людей. Важно оценить эффективность действия имеющихся в продаже «строительных биоцидов» в отношении Stachybotrys spp.
В связи с распространенностью Stachybotrys spp. в жилых, офисных и больничных помещениях, их потенциальной опасностью для здоровья людей, актуально изучение эффективности действия имеющихся на рынке противогрибковых средств, используемых в качестве антифунгальных, упреждающих возникновение грибов и для устранения очагов биоповреждений от них.
Цель исследования - оценить чувствительность Stachybotrys spp. к средствам, предназначенным для профилактики и уничтожения роста микромицетов «строительными биоцидами», выпускаемым различными производителями.
МАТЕРИАЛЫ
1. Техногенные субстраты помещений (штукатурка, гипсокартон, обои, минеральная вата, цементно-песчаная смесь).
2. Штаммы Stachybotrys spp.: 13 штаммов S. chartarum (12 - выявлены в техногенных субстратах в помещениях г. Санкт-Петербурга и 1 - в помещении г. Краснодара - штамм № 7); 1 штамм S. chlorochalonata (№ 11) - из отделочных материалов в жилом помещении Санкт-Петербурга.
3. Для оценки антифунгальной активности были выбраны следующие «строительные биоциды»:
«Антиплесень» фирмы «Лакра», «Санатскс» фирмы «Текс», «Дегёйпроф», «Neomid bio ремонт» и «Neomid 600» фирмы Neomid. Все биоциды были включены в исследование в виде рабочих растворов, рекомендованных производителями.
4. В исследования были использованы следующие питательные среды:
- сусло-агар («НИЦФ» - научно-исследовательский центр фармакотерапии);
- картофельный агар: картофель 300 г, вода дистиллированная — 1 л, глюкоза — 2 г, агар-агар — 20 г;
- картофельный отвар: картофель 300 г, вода дистиллированная - 1л, глюкоза - 2 г.
МЕТОДЫ
1. Выделение культур Stachybotrys spp. из техногенных субстратов.
Взятие проб с пораженных микромицетами поверхностей осуществляли ватным тампоном, смоченным в 0,9% растворе натрия хлорида, а с грубого и шероховатого - скальпелем. Образцы помещали в герметичные упаковки с сопроводительными этикетками и засевали на питательные среды - сусло-агар и Сабур о-агар в лабораторных условиях, f ioce-вы инкубировали в термостатах при +28 "С и +37 "С в течений 1-1 суток [12], затем идентифицировали колонии Stachybotrys spp, но морфологическим и куль-туральным признакам.
Выделение Stachybotrys spp. в чистые культуры из ассоциаций с другими микромицетами осуществляли щрем пересева колоний микробиологической иглой на картофельный агар и целях ускорения роста.
Видовую идентификацию чистых культур Stahybotrys spp. проводили по морфологическим признакам [13] с дальнейшим подтверждением методом сиквенирования в НИЛ молекулярно-генети-ческой микологии {и.о. зав. лаб. Пол и щук Л.1',),
2. Метод определения антифунгальной (фун-гицидной и фунгистатической) активности «строительных биоцидов».
Действие «строительных биоцидов» изучали методом серийных разведений в жидкой питательной среде (картофельном отваре). Данная питательная среда выбрана в связи с быстрым ростом на ней Stachybotrys spp. и низкой вероятностью контаминации другими микромицетами. Метод основан на выполнении последовательных двукрат ных разведений [14] вышеперечисленных «строительных биоцидов».
Оценка действия «строительных биоцидов» в отношении Stachybotrys spp. была проведена в диапазоне разведении рабочих растворов 1:1 - 1:64000. Для каждого биоцида были поставлены ряды пробирок, в первые пробирки каждого ряда исследуемые вещества вносили в минимальном разведении, затем проводили их тит рование до 8 пробирки. В пробирки с питательной средой и биоцидом соответствующего разведения вносили взвеси спор Stachybotrys spp. в количестве 0,1 мл. Для приготовления взвесей спор
культуры 14 штаммов 5ии:ку!и>1гу$ 8рр выращивали в течение 2 недель при +28 "С в пробирках на сусло-агаре. С поверхностей культур брали смывы конидий с постепенным добавлением 0,85% стерильного раствора натрия хлорида до густоты рабочих взвесей 1 ЕД по МакФарлапду,
В исследовании каждого биоцида ставили 3 пробы контроля:
1 — контроль культуры (1 мл питательной среды + 0,1 мл рабочей взвеси тест-культуры);
2 — контроль питательной среды (1 мл питательной среды);
3 - контроль препарата (0,5 мл питательной среды + 0,5 мл исходного раствора препарата).
Все ряды подготовленных разведений с культурами и образцами контроля выдерживали при 28 "С в течение 7-10 суток до появления роста гриба в первом контроле. Минимальной фунгистатической (подавляющей) концентрацией (М1 ¡К) препарата считали концентрацию в последней пробирке ряда (максимальное разведение), в которой отсутствовал визуально определяемый рост микромицета (Рис, 1).
- — —
... »■
Рис.1. Ряд разведений биоцида после инкубации в течение 7 дней
Для определения фунгицидного действия препарата делали высев штрихами микробиологической петлей па секторы сусло-агара I! чашках ! Еетри из каждой пробирки, в которой визуально отсутствовал рост тест-культуры, а также из первой контрольной пробирки. Чашки с высевами ставили в термостат при 28 "С на срок — до появления роста колоний в контрольном секторе, после чего вели учет роста микроскопических грибов во всех секторах (Рис, 2),
Рмс. 2. Рост 5. сЬаПагит в секторах чашки Петри для определения его фунгицидного действия
Минимальной фунгицидной концентрацией (МФК) считали минимальную концентрацию (максимальное разведение) препарата в пробирке, высев из которой на плотную питательную среду не давал роста &1аскуЬо1гу& крр, Проводили расчет М11К и МФК в объемных ¡процентах для соответствующих активных разведений.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
За период 2009-2012 гг. нами было обследовано 116 помещений Санкт-Петербурга и Ленинградской области. В 13 помещениях (11,2% от общего количества обследованных помещений) была обнаружена контаминация техногенных субстратов ЗшскуЬоиух зрр. в количестве 2-687500 КОЕ/дм2 (в образцах строительных и отделочных материалов), В наименьшем количестве 51аскуЬо1гу& зрр. наблюдали в образце виниловых обоев без следов биопоражения, а в наибольшем - в образце бумажных обоев, покрытых темными пятнами и налетом серого цвета. Среди выявленных 19 очагов биопоражения строительных и отделочных материалов 5(лсИуЬоСгу$ чрр., имела место контаминация штукатурки в 6 случаях (31,6%), гипсокартона - в 6 (31,6%), обоев - в 5 (26,3%), а также минеральной ваты — I (5,3%) и цементно-песча-ной смеси 1 (5,3%).
Таким образом, потенциально токсигенные микром ицоты ЯШскуЬо/туъ врр. обнаружили в значительной части обследованных помещений, с преимущественным поражением целлюлозосодержа-щих отделочных материалов - гипсокартона, а также штукатурки.
Таблица №1 Фунгицидная и фунгистатическая активности «строительных биоцидов» по отношению к
Строительные биоциды» (минимальные активные разведения)
¡5 и Неотгс! 600 Неош((! Ыо ремонт Санатекс Декопроф Антиляесень (Лзкра)
мпк МФК МПК МФК МПК МФК МПК МФК МПК МФК
1 1:32 1:32 1:500 1:250 1:1000 1:1000 1 1000 1:1000 1:2000 1 1000
2 1:16 1:16 1:500 1:250 1:1000 1:1000 1 2000 1:1000 1:2000 1 1000
3 1:32 1:32 1:1000 1:500 1:1000 1:1000 1 1000 1:1000 1:1000 1 1000
4 1:64 1:32 1:1000 1:500 1:4000 1:4000 1 4000 1:4000 1:8000 1 4000
5 1:64 1:64 1:2000 1:1000 1:4000 1:4000 1 4000 1:4000 1:4000 1 4000
6 1:64 1:32 1:640 1:320 1:1000 1:1000 1 2000 1:2000 1:2000 1 2000
7 1:64 1:64 1:640 1:620 1:1000 1:1000 1 1000 1:1000 1:4000 1 2000
8 1:16 1:16 1:640 1:640 1:2000 1:1000 1 2000 1:2000 1:8000 1 4000
9 1:32 1:16 1:320 1:320 1:1000 1:1000 1:500 1:500 1:2000 1 2000
10 1:64 1:64 1:640 1:320 1:1000 1:500 1 1000 1:1000 1:2000 1 2000
11 1:64 1:64 1:640 1:640 1:1000 1:1000 1 1000 1:1000 1:4000 1 2000
12 1:64 1:32 1:320 1:160 1:1000 1:1000 1 1000 1:500 1:1000 1:500
13 1:16 1:16 1:160 1:160 1:500 1:500 1:500 1:500 1:200 1:200
14 1:8 1:8 1:320 1:320 1:1000 1:1000 1:500 1:500 1:1000 1:1000
Таблица №2 Активность «строительных биоцидов» против 5íachyfccrtrys «рр. (в объемных % рабочего раствора)
с± «Строительные биоциды»
д? и 1 И МеотМбОО Нео[тй Ыо ремонт Санатекс Декопроф Антиплесень (Лакра)
МПК (%об.) МФК (%об.) МПК (%об0 МФК (%0б.) МПК (%Об.) МФК (%0б.) МПК (%0б.) МФК (%0б.) МПК (%об.) МФК (%0б.)
1 3,13 3,13 0,2 0,4 0,1 0,1 0,1 0,1 0,05 0,1
г 6,25 6,25 0,2 0,4 0,1 0,1 0,05 0,1 0,05 0,1
3 3,13 3,13 0,1 0,2 0,1 0,1 0,05 0,1 0,1 0,1
4 1,56 3,13 0,1 0,2 0,03 0,03 0,03 0,03 0,02 0,03
5 1,56 1,56 0,05 0,1 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03
6 1,56 3,13 0,16 0,31 0,1 0,1 0,05 0,05 0,05 0,05
7 1,56 1,56 0,16 0,31 0,1 0,1 0,1 0,1 0,03 0,05
8 6,25 6,25 0,16 0,16 0,05 0,1 0,05 0,05 0,02 0,03
9 3,13 6,25 0,31 0,31 0,1 0,1 0,2 0,2 0,05 0,1
10 1,56 1,56 0,16 0,31 0,1 0,2 0,1 0,2 0,05 0,05
11 1,56 1,56 0,16 0,16 0,1 0,1 0,1 0.1 0,03 0,05
12 1,56 3,13 0,31 0,63 0,1 0,1 0,1 0,2 0,1 0,2
13 6,25 6,25 0,63 0,63 0,2 0,2 0,2 0,2 0,05 0,05
14 12,5 12,5 0,31 0,31 0,1 0,1 0,2 0,2 0,1 0,1
Средн. значение 5,14 7,88 0,24 0,29 0,09 0,1 0,10 0,13 0,05 0,06
1 >-«''" ■ I Ьо PWHF
н а н ие но ван не о «оцмд а
Рис.3. Средние значения МПК (% об.) и МФК {% об.) исследованных «строительных биоцидов» в отношении 14 штаммов 5{ас/)уЬо(ту5 ьрр.
-Neomid bio ремонт -Санатекс
-Декопроф
-Антиплесень
{Лакра)
1 2 г A s в 7 8 9 10 11 12 13 14
№ штамма
Рис. 4. Различия чувствительности 5(асЬуЬо{гу$ $рр. к «строительным биоцидам»
Все изученные биоциды обладают фунгицидной и фунгистатической активностями в отношении 5ЫскуЬоЩ& врр Исходя из полученных значений М11К (%об.) и МФК (%об.), биоциды можно расположить в порядке убывания их активности: «Антиплесень» («Лакра»), «Санатекс», «Декапроф», «Ыеот1с1 ремонт», «Ыеотк! 600» (Рис, 3). Значительно более низким фунгистатическим и фунгицидным действиями обладает «Кеош1<1 600», его средняя пода-вляю1цая концентрация составляет 5,14%, а средняя фунгицидная - 7,88%.
Наибольшими фунгицидной и фунгистатической активностями обладает «Лнтиплесень» («Лакра»), его средняя подавляющая концентрация на все штаммы ЩаскуЬо1гу& зрр. - 0,05% о б., а средняя фунгицидная - 0,06%об. Средние значения М1 (К (% об.) и МФК (% об.) биоцида Антиплесень («Лакра») достоверно отличаются от гаковых значений других биоцидов Р^0,0002 - РйО.ОООЗ, Отметим близкие значения минимальных показателей — фунгицидной и фунгистатической концентраций с акцентом на преимущественно фунгицидное действие. Разница меж-
ду МФК и МПК при серийном титровании составляла не более 1 разведения. Обнаружили значительные отличия средних значений М! SK (%об.) и МФК (%об.) действия Neomid 600 от таковых показателей других биоцидов. Разницы между средними значениями МПК (%об.) и МФК (%об.) остальных четырех биоцидов статистически не значимы.
Анализ пггаммного различия устойчивости микромицетов к биоцидам целесообразно проводить в отношении четырех из них: «Антиплесень» («Лакра»), «Neomid bio ремонт», «Санатекс», «Декопроф», исключив значительно менее активный «Neomid 600», Достоверных отличий чувствительности различных штаммов Stachybotrys spp. к 4 «строительным биоцидам» не выявили. Среди штаммов Stachybotrys spp, можно выделить штаммы №4 и №5 как наиболее чувствительные к действию «строительны*: биоцидов», а также №12 и №13 как наиболее устойчивые. Однако отметим меньшую устойчивость 4 штамма к биоциду «Neomid bio ремонт», чем штаммов 8, 11, а также меньшую чувствительность 13 штамма к биоциду «Антиплесень» («Лакра»), по сравнению с таковой 14,9,3,2,1, и штамма 12 к биоциду «Санатекс» по сравнению с К). Восприимчивость других штаммов к «строительным биоцидам» отличается незначительно,
В дальнейшем запланировано продолжить работу по тестированию «строительных биоцидов» в связи с регулярным обновлением ассортимента противогрибковых средств на российском рынке.
ВЫВОДЫ
1. Встречаемость Stachybotrys spp. в жилых, офисных и больничных помещениях Санкт-Петербурга и Ленинградской области за 2009-2012 гг. составила 11,2%.
2. Все исследуемые «строительные биоциды» активны в о тношении изучаемых штаммов Stachybotrys spp. в диапазоне разведений 1:16 - 1:4000.
3. Наиболее эффективным противогрибковым средством в отношении Stachybotrys spp, является «Лнтиплесень» производства фирмы «Лакра».
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Pestka J.J., Yike I., Dearborn D.G., et al. Stachybotrys chartarum, trichothecene mycotoxins and damp building - relatedill-ness: new insights into a public health enigma // Toxicological Sciences. - 2008. - Vol. 104. - P. 4-26.
2. Cameron D.G. Toxicity prifile of Stachybotrys chartarum IIA Thesis In Environmental toxicology/ Submitted to the Graduate Faculty of Texas Tech University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of science.- 2009. Andersen, В., Nielsen, K.F., and Jarvis, B.B. Characterization of Stachybotrys from water-damaged buildings based on morphology, growth, and metabolite production // Mycologia. -2002. - Vol. 94. - P. 392-403.
3. Scott A.M. Stachybotrys chartarum (or S. atra or S. alternans): Review of Toxicological Literature. Integrated Laboratory Systems, Inc. Research Triangle Park.- North Carolina, 2004.
4. Jarvis B.B. Stachybotrys chartarum: A fungus for our time// Phytochemistry. - 2003. - Vol. 64. - P. 53-60.
5. Hossain M.A., Ahmed M.S. and Ghannoum M.A. Attributes of Stachybotrys chartarum and its association with human disease // J. Allergy Clin Immunol. - 2004. - Vol. 113. - P.2 00-208.
6. Васильева H.B., Блинов Н.П. Микроорганизмы - контаминанты и патогены - индукторы процессов старения больничных зданий и помещений медицинского назначения, а также возбудители некоторых заболеваний людей (учебное пособие) / Под ред. Н. П. Елинова. - СПб.: КОСТА, 2009. - 224 с.
7. Доршакова Е.В. Морфолого-физиологические особенности токсинообразующих грибов - биодеструкторов из рода Stachybotrys I/ Проблемы медицинской микологии. - 2011. - Т. 13, №3. - С. 13-21.
8. Andersen В., Nielsen K.F. and Jarvis B.B. Characterization of Stachybotrys from water-damaged buildings based on morphology, growth, and metabolite production // Mycologia. - 2002. - Vol. 94. - P. 392-403.
9. Andersen В., Nielsen K.F. and Thrane U. Molecular and phenotypic descriptions of Stachybotrys chlorohalonata sp. nov. and two chemotypes of Stachybotrys chartarum found in water-damaged buildings // Mycologia. - 2003. - Vol. 95. - P. 1227-1238.
10. Хабибуллина Ф.М. Микологическая характеристика подзолистых и болотно-подзолистых почв // Микология и криптогамная ботаника в России: традиции и современность: Тр. Междунар. конф., посвященной 100-летию организации исследований по микологии и криптогамной ботанике в Ботаническом институте им. ВА. Комарова РАН. - СПб.: Изд-во СПб ГХФА, 2000. - С. 270-273.
11. Хабибуллина Ф.М. Почвенная микобиота естественных и антропогенно нарушенных экосистем северо-востока европейской части России: Автореф. дисс... док. биол. наук. - Сыктывкар, 2009. - 40 с.
12. Доршакова Е.В., Блинов Н.П., Павлова И.Э. и др. Микромицеты в естественной среде обитания и в помещениях - их потенциальная опасность для здоровья людей// Проблемы медицинской микологии. - 2012. - Т.14, №3. - С. 53-57.
13. Samson R.A., Houbraken J., Thrane U., et al. Food and indoor Fungi: CBS laboratory manual series. CBS. KNAW. Fungal biodiversity Centre Utrecht The Netherlands. - 2010.
14. XII государственная Фармакопея Российской Федерации: Часть I. - М.: Медицина, 2007. - 684 с.
Поступила в редакцию журнала 04.09.2013
Рецензент: С.М. Игнатьева
