CC BY
14УДК 615.076:620.193.82
введение
чувствительность
штаммов stachybotrys spp
к некоторым
строительным
биоцидам
Доршакова Е.В. (н.с.)*, Павлова и.Э. (н.с.), Богомолова т.с. (зав. лаб.), чилина г.А. (зав. лаб.), Васильева н.В. (директор института, проф. кафедры)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2014
Провели оценку эффективности действия трех строительных биоцидов в отношении токсинообразующих микромицетов-биодеструкторов рода Stachybotrys. Изучены штаммные различия чувствительности Stachybotrys spp. к исследуемым биоцидам.
Ключевые слова: биодеструкция, биоциды, фунгистатическое действие, фунгицидное действие
the sensitivity of
stachybotrys spp.
strains to some construction biocides
Dorchakova E.v. (scientific collaborator), Pavlova I.e. (scientific collaborator), Bogomolova T.s. (head of the laboratory), chilina G.A. (head of the laboratory), vasilyeva N.v. (director of the Institute, professor of the chair)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
©Collective of authors, 2014
The effectiveness of three construction biocides against toxin remediation forming of micromycetes-biodestructors of Stachybotrys genus has been evaluated. Strains differences in the sensitivity of Stachybotrys spp. to examined biocides were studied.
Key words: antifungal effect, biocides, biodegradation, fungistatic action
Контактное лицо: Доршакова Евгения Владимировна, Тел.: (812) 303-51-40
В настоящее время по-прежнему актуальным является решение проблем, связанных с деятельностью микромицетов-биодеструкторов - разрушением ими строительных материалов, а также потенциальной опасностью для здоровья людей. Stachybotrys spp. обладают высокой целлюлазной активностью, нередко разрушают строительные конструкции и элементы декора, содержащие целлюлозу, синтезируемые ими микотоксины способны нанести вред здоровью людей. Наиболее токсичными являются макроциклические трихотеценовые микотоксины, оказывающие на организм цитотоксическое и ней-ротоксическое действия [1-7].
Важно оценить эффективность действия имеющихся в продаже строительных биоцидов в отношении Stachybotrys spp.
Цель исследования - изучить чувствительность Stachybotrys spp. к некоторым строительным биоцидам.
материалы:
1. Техногенные субстраты помещений (отделочные материалы).
2. Культуры 13 штаммов Stachybotrys chartarum: 12 - выделили из техногенных субстратов в помещениях Санкт-Петербурга и один - в помещении Краснодара (штамм № 7); один штамм S. chlorochalonata (№ 11) изолирован из отделочных материалов в помещении Санкт-Петербурга).
3. Для оценки противогрибковой активности были выбраны следующие «строительные биоциды»: «Средство от плесени» фирмы «Pufas», «Макросепт - Санитар» фирмы «Tury» и «Средство от плесени и грибка» фирмы «Element» в отношении четырнадцати штаммов Stachybotrys spp.
Все биоциды были включены в исследование в виде растворов, рекомендованных производителями.
4. В исследовании использовали следующие питательные среды:
- сусло - агар («НИЦФ»);
- картофельный агар: картофель - 300 г, вода дистиллированная - 1л, глюкоза - 2 г, агар-агар -20 г;
- картофельный отвар: картофель - 300 г, вода дистиллированная - 1 л, глюкоза - 2 г.
методы
1. Выделение культур Stachybotrys spp. из техногенных субстратов
Взятие проб с пораженных микромицетами поверхностей осуществляли ватным тампоном, смоченным в 0,9% растворе натрия хлорида, а с грубого и шероховатого - скальпелем. Смывы и соскобы с поверхностей помещали в герметичные упаковки с сопроводительными этикетками и засевали на питательные среды (сусло-агар и Сабуро-агар) в лабораторных условиях. Посевы инкубировали в термо-
■
статах при +28 °С и +37 °С в течение 14 суток [8], затем идентифицировали колонии микромицетов рода БЬаскуЪоЬту8 по морфологическим и культуральным признакам.
Выделение ЗЬаскуЬоЬтуз зрр. в виде чистых культур из ассоциаций с другими микромицетами осуществляли путем переноса участка колонии (диаметр - до 2 мм) микробиологической иглой на картофельный агар в целях ускорения роста.
Видовую идентификацию чистых культур ЗЬакуЬоЬтуз зрр. проводили по морфологическим признакам [9] с дальнейшим подтверждением методом сиквенирования в НИЛ молекулярно-генетиче-ской микологии.
2. Метод определения антифунгальной (фун-гицидной и фунгистатической) активности строительных биоцидов
Действие «строительных биоцидов» изучали методом серийных разведений в жидкой питательной среде - картофельном отваре, избранном в связи с быстрым ростом на ней ЗЬаскуЬоЬтуз зрр. и низкой вероятностью контаминации другими микромицетами. Метод основан на выполнении последовательных двукратных разведений [10] вышеперечисленных строительных биоцидов.
Для исследования использовали рабочие растворы «строительных биоцидов», предварительно разведенные в 15 или 100 раз. Для каждого биоцида были поставлены ряды пробирок, в первые пробирки каждого ряда исследуемые вещества вносили в минимальном разведении, затем проводили их титрование до 8 пробирки путем двукратного разведения. В пробирки с питательной средой и биоцидом соответствующего разведения вносили взвеси спор ЗЬаскуЬоЬтуз spp. в количестве 0,1 мл.
Для приготовления взвесей спор культуры 14 штаммов ЗЬаскуЪоЬгуз spp выращивали в течение 2 недель при +28 °С в пробирках на сусло-агаре. С поверхностей культур брали смывы конидий с постепенным добавлением 0,85% стерильного раствора натрия хлорида до густоты рабочих взвесей 1 ЕД по МакФарланду.
В исследовании каждого биоцида ставили 3 пробы контроля:
1) культуры (1 мл питательной среды + 0,1 мл рабочей взвеси тест-культуры);
2) питательной среды (1 мл питательной среды);
3) препарата (0,5 мл питательной среды + 0,5 мл исходного раствора препарата).
Все ряды подготовленных разведений с культурами и образцами контроля выдерживали при 28 °С в течение 7-10 суток до появления роста гриба в первом контроле. Минимальной фунгистатической (подавляющей) концентрацией (МПК) препарата считали концентрацию в последней пробирке ряда (максимальное разведение), в которой отсутствовал визуально определяемый рост микромицета.
Для определения фунгицидного действия препа-
рата делали высев штрихами микробиологической петлей на секторы агаризованного сусло-агара в чашках Петри из каждой пробирки, в которой визуально отсутствовал рост тест-культуры, а также из первой контрольной пробирки. Чашки с высевами ставили в термостат при 28 °С на срок до появления роста колоний в контрольном секторе, после чего учитывали рост микроскопических грибов во всех секторах.
Минимальной фунгицидной концентрацией (МФК) считали максимальное разведение препарата в пробирке, высев из которой на плотную питательную среду был негативным. Затем проводили расчет МПК и МФК в объемных процентах для соответствующих активных разведений.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
За период 2009-2013 гг. среди 140 помещений Санкт-Петербурга и Ленинградской области в 14 (10% от общего количества обследованных помещений) была обнаружена контаминация техногенных субстратов микромицетами рода Stachybotrys. Их количество в образцах строительных и отделочных материалов составляло 2-687500 КОЕ/дм2. Stachybotrys spp. был выявлен в очагах биоповреждений на гип-сокартоне, виниловых и бумажных обоях, а также в минеральной вате и цементно-песчаной смеси.
Все изученные биоциды обладали фунгицидной и фунгистатической активностями в отношении Stachybotrys spp. Исходя из полученных значений МПК (% об.) и МФК (% об.), биоциды можно расположить в порядке убывания их активности: «Макросепт - Санитар» фирмы «Tury» и «Средство от плесени и грибка» фирмы «Element», «Средство от плесени» фирмы «Pufas» (Рис.1).
грибка [Element!
Наименование строительного биоцида
Рис. 1. Средние значения МПК (% об.) и МФК (% об.) исследованных «строительных биоцидов» в отношении 14 штаммов Stachybotrys spp.
Значения МПК (% об.) и МФК (% об.) «Макросепт - Санитар» («Tury») и «Средство от плесени и грибка» («Element») в отношении большинства штаммов Stachybotrys spp. незначительно отличались друг от друга, а таковые «Средство от плесени» («Pufas») обладали более низким фунгистатическим и фунгицид-ным действиями (таблицы 1 и 2).
Таблица 1
Фунгицидная и фунгистатическая активности строительных биоцидов против штаммов Stachybotrys
spp.
№ штамма Stachybotrys spp. Наименование строительного биоцида (минимальные активные разведения)
«Средство от плесени» (Pufas) «Макросепт-Санитар» (Tury) «Средство от плесени и грибка» (Element)
МПК МФК МПК МФК МПК МФК
1 1:60 1:30 1:1600 1:800 1:800 1:400
2 1:60 1:60 1:1600 1:800 1:400 1:800
3 1:120 1:60 1:800 1:800 1:800 1:800
4 1:120 1:120 1:1600 1:1600 1:1600 1:800
5 1:60 1:60 1:800 1:800 1:400 1:400
6 1:120 1:120 1:3200 1:1600 1:1600 1:1600
7 1:60 1:60 1:800 1:800 1:400 1:400
8 1:30 1:30 1:800 1:800 1:1600 1:1600
9 1:60 1:60 1:1600 1:1600 1:800 1:400
10 1:60 1:60 1:1600 1:800 1:1600 1:800
11 1:120 1:120 1:1600 1:1600 1:800 1:800
12 1:60 1:60 1:1600 1:1600 1:400 1:400
13 1:30 1:30 1:400 1:400 1:1600 1:1600
14 1:60 1:60 1:1600 1:800 1:1600 1:800
Наименование строительного биоцида
№ штамма Stachybotrys spp. «Средство от плесени» (Pufas) «Макросепт- Санитар» (Tury) «Средство от плесени и грибка» (Element)
МПК МФК (% МПК МФК МПК МФК
(%об.) об.) (%об.) (%об.) (%об.) (%об.)
1 1,66 3,33 0,0625 0,125 0,125 0,25
2 1,66 1,66 0,0625 0,125 0,25 0,125
3 0,83 1,66 0,125 0,125 0,125 0,125
4 0,83 0,83 0,0625 0,0625 0,0625 0,125
5 0,83 0,83 0,125 0,125 0,25 0,25
6 1,66 1,66 0,031 0,0625 0,0625 0,0625
7 1,66 1,66 0,125 0,125 0,25 0,25
8 3,33 3,33 0,125 0,125 0,0625 0,0625
9 1,66 1,66 0,0625 0,0625 0,125 0,25
10 1,66 1,66 0,0625 0,125 0,0625 0,125
11 0,83 0,83 0,0625 0,0625 0,125 0,125
12 1,66 1,66 0,0625 0,0625 0,25 0,25
13 3,33 3,33 0,25 0,25 0,0625 0,0625
14 1,66 1,66 0,0625 0,125 0,0625 0,125
Средние значения 1,66 1,84 0,092 0,112 0,134 0,156
Наибольшими фунгицидной и фунгистатиче-ской активностями обладал строительный биоцид «Макросепт - Санитар» («Tury»), его средняя подавляющая концентрация на все штаммы Stachybotrys spp. составила 0,092% об., а средняя фунгицидная - 0,112% об.; средние значения МПК и МФК строительного биоцида «Средство от плесени и грибка» («Element») -0,156 и 0,134% об. соответственно. Значительно более низкие показатели средних значений МПК и МФК были выявлены у биоцида «Средство от плесени» («Pufas») - 1,84; 166% об. Следует отметить близкие значения показателей минимальной фунги-цидной концентрации и минимальной фунгистати-
ческой (подавляющей) концентраций, соответствующие фунгицидному действию. Разница между МФК и МПК при серийном титровании составляла не более 1 разведения.
Среди штаммов Stachybotrys зрр. можно выделить штамм № 4,5,11 как наиболее чувствительный к действию строительных биоцидов, а также № 2,6, 8,13 как наиболее устойчивые (Рис. 2 и 3).
Таблица 2
Активность строительных биоцидов в отношении различных штаммов Stachybotrys spp. (в объемных % рабочего раствора)
Рис. 2. МПК (% об.) в отношении «строительных биоцидов» к различным штаммам Stachybotrys spp.
Рис. 3. МФК (% об.) «строительных биоцидов» в отношении различных штаммов Stachybotrys spp.
В дальнейшем запланировано продолжить работу по тестированию строительных биоцидов в связи с регулярным обновлением ассортимента противогрибковых средств на российском рынке.
ВЫВОДЫ
1. «Строительные биоциды», исследуемые в данной работе, активны в отношении изучаемых штаммов ЗЬаскуЬоЬтуз spp. в диапазоне разведений 1:30 -
1:3200.
2. Наиболее эффективными противогрибковыми средствами в отношении Stachybotrys spp. являются «Макросепт - Санитар» фирмы «Tury» и «Средство от плесени и грибка» фирмы «Element».
3. Наименее эффективным противогрибковым средством в отношении Stachybotrys spp. является «Средство от плесени» фирмы «Pufas».
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Pestka J.J., Yike I., Dearborn D.G., et al. Stachybotrys chartarum, trichothecene mycotoxins and damp building -relatedillness: new insights into a public health enigma // Toxicol. Sciences. - 2008. - Vol. 104. - P. 4-26.
2. CameronD.G. Toxicity prifile of Stachybotrys chartarum //A thesis in environmental toxicology/ Submitted to the Graduate Faculty of Texas Tech University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of science.- 2009.
3. Andersen B., Nielsen K.F. and Jarvis B.B. Characterization of Stachybotrys from water-damaged buildings based on morphology, growth, and metabolite production// Mycologia. - 2002. - Vol. 94. - P. 392-403.
4. Scott A.M. Stachybotrys chartarum (or S. atra or S. alternans): Review of toxicological literature. Integrated Laboratory Systems, Inc. Research Triangle Park, North Carolina. - 2004.
5. Jarvis B.B. Stachybotrys chartarum: A fungus for our time// Phytochemistry. - 2003. - Vol. 64. - P. 53-60.
6. Hossain M.A., Ahmed M.S. and Ghannoum M.A. Attributes of Stachybotrys chartarum and its association with human disease// J. Allergy Clin. Immunol. - 2004. - Vol. 113. - P. 200-208.
7. Васильева Н.В., Блинов Н.П. Микроорганизмы-контаминанты и патогены - индукторы процессов старения больничных зданий и помещений медицинского назначения, а также возбудители некоторых заболеваний людей (учебное пособие) - СПб.: КОСТА, 2009. - 224 с.
8. Доршакова Б.В. Морфолого-физиологические особенности токсинообразующих грибов - биодеструкторов из рода Stachybotrys // Проблемы медицинской микологии. - 2011. - Т. 13, №3. - С. 13-21.
9. Доршакова Б.В., Блинов Н.П., Павлова И.Э. и др. Микромицеты в естественной среде обитания и в помещениях -их потенциальная опасность для здоровья людей// Проблемы медицинской микологии. - 2012. - Т. 14, №3. - С. 53-57.
10. Samson R.A., Houbraken J., Thrane U., et al. Food and indoor Fungi: CBS laboratory manual series. CBS. KNAW. Fungal biodiversity Centre Utrecht The Netherlands. - 2010.
11. XII государственная Фармакопея Российской Федерации: Часть I. - М.: Медицина, 2007. - 684 с.
Поступила в редакцию журнала 18.08.2014
Рецензент: И.А. Босак
